CN108707685A - 与谷子分蘖数性状相关的snp标记及其检测引物和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种与谷子分蘖数性状相关的SNP标记及其检测引物和应用。本申请与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，该SNP标记位于第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记内，SNP标记与谷子分蘖数紧密连锁。本申请与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，可以用于谷子分蘖数性状的分子标记辅助育种，通过该SNP标记检测可以预测谷子分蘖数，为实现谷子分蘖数性状的早期鉴定或筛选育种提供了科学依据，对加快谷子品种的遗传选育或改良进程具有重要的理论和实践指导意义。本申请检测SNP标记的引物对，可以对谷子分蘖数进行分型，检测SNP表达的差异。

Description

与谷子分蘖数性状相关的SNP标记及其检测引物和应用

技术领域

本申请涉及谷子育种技术领域，特别是涉及一种与谷子分蘖数性状相关的SNP标记及其检测引物和应用。

背景技术

我国是谷子的原产地和世界上栽培面积最大、产量最高的国家，产量约占全世界总量的80％。同时，我国也是谷子遗传资源数量最多、多样性最丰富的国家。

分蘖是谷子等禾本科植物在地面以下或接近地面处所发生的分枝。有效分蘖数与单位面积的穗数具有直接的关系，是影响谷子产量的重要因子，研究与控制分蘖数等产量性状相关的基因及其位置功能等，对于指导谷子遗传育种具有重要的意义。

单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)是基因组水平上由单个核苷酸碱基的变异引起的DNA序列多态性，其在基因组中数量多，分布广泛，遗传稳定性好。随着基因测序技术的发展和成本的降低，对不同个体同一基因或基因片段进行直接测序和序列比较，就能够确定碱基是否存在变异。因此，SNP检测有利于基因分型，适用于快速和规模化地筛查未知或已知SNP与某遗传性状的关系。

目前关于谷子数量性状相关的QTL定位和SNP标记研究主要集中于SSR标记的开发利用等途经，而利用群体自交系简并基因组测序检测多态性的SNP分子标记的开发应用研究尚未有报道。因此，开展谷子数量性状SNP分子标记的开发，并建立辅助选育体系，对于提高谷子产量，节约育种成本具有重要意义。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的与谷子分蘖数性状相关的SNP标记及其检测引物和应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，该SNP标记位于第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记内，并且，SNP标记与谷子分蘖数紧密连锁。

需要说明的是，本申请经过研究发现了一段与谷子分蘖数紧密连锁的序列，这段序列内的SNP标记直接影响谷子分蘖数性状，这段序列即第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记。

进一步的研究发现，第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记中，尤其是SNP标记的碱基为T或C，与谷子分蘖数紧密连锁。

本申请的一种实现方式中，具体披露了其中一个SNP标记，即TN-03-847位点，TN-03-847位点位于第三条染色体的序列第48401847bp位置，TN-03-847位点所在的序列如SeqID No.1所示，TN-03-847位点是Seq ID No.1所示序列中自5’端起第63位碱基。

需要说明的是，第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记与谷子分蘖数紧密连锁，其中可能包含众多SNP标记，TN-03-847位点只是本申请的一种实现方式中证实的与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，在本申请的指导下，不排除在该bin标记内还有其它的SNP标记。

优选的，本申请与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，对SNP标记，利用复合区间作图法，采用5％的总体显著水平，QTL检测的LOD值为3.9399，表型变异解释率为2.15％。

本申请的另一面公开了一种检测本申请的SNP标记的引物对，该引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-GTTGCGTGGTATCAATGTG-3’

Seq ID No.3：5’-AAATGGTGTTTGGTAGGGT-3’。

本申请的另一面公开了一种检测本申请的SNP标记的试剂盒，该试剂盒中包括本申请的引物对。

优选的，本申请的试剂盒中还包括用于PCR扩增的试剂。

本申请的另一面公开了一种检测本申请的SNP标记的方法，包括采用本申请的引物对，或者本申请的试剂盒，对待测的谷子基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的测序结果，获得SNP标记的碱基情况。

本申请的另一面公开了一种预测谷子分蘖数的方法，包括采用本申请的引物对，或者本申请的试剂盒，对预测对象的谷子基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的测序结果，获得本申请的SNP标记的碱基情况，根据SNP标记的碱基情况预测谷子的分蘖数。

本申请的再一面公开了本申请的SNP标记在谷子分蘖数预测、谷子分蘖数性状早期鉴定或谷子分子辅助筛选育种中的应用。

本申请的再一面公开了本申请的引物对或本申请的试剂盒在谷子分蘖数预测、谷子分蘖数性状早期鉴定或谷子分子辅助筛选育种中的应用。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，可以用于谷子分蘖数性状的分子标记辅助育种，通过该SNP标记检测可以预测谷子分蘖数，为实现谷子分蘖数性状的早期鉴定或筛选育种提供了科学依据，对加快谷子品种的遗传选育或改良进程具有重要的理论和实践指导意义。本申请检测SNP标记的引物对，可以对谷子分蘖数进行分型，检测SNP表达的差异。

附图说明

图1是本申请实施例中谷子父母本基因组DNA电泳图，其中，第一泳道为M泳道，表示DL2000marker，第二泳道即标注为1的泳道表示父本“冀张谷一号”基因组DNA，第三泳道即标注为2的泳道表示母本“A2”基因组DNA；

图2是本申请实施例中谷子父母本基因组DNA的PCR产物电泳图，其中，第一泳道即标注A3-1的泳道，表示以母本“A2”基因组DNA为模板、3_1为引物的PCR产物，第二泳道即标注为33-1的泳道，表示以父本“冀张谷一号”基因组DNA为模板、3_1为引物的PCR产物，第三泳道为M泳道，表示DL2000marker；

图3是本申请实施例中母本和父本SNP标记中TN-03-847位点所在的序列的比对结果图，TN-03-847位点在第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记中，母本碱基为T，父本碱基为C。

具体实施方式

本申请提供了与谷子分蘖数相关的bin标记区域的SNP标记、检测引物及其应用。谷子分蘖数紧密连锁SNP标记TN-03-847，位于第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记内。

需要说明的是，本申请中bin是指Bin作图(即Bin map)中，利用作图群体中全部的重组位点信息，获得构成重组事件的最小单位(Recombination bin)。利用得到的bin作为标记用于后续的连锁图谱构建和QTL定位。

本申请中，遗传图谱(genetic map或linkage map)是指以遗传标记间重组率为基础构建的标记之间相对位置的线性排列图。基于高通量重测序技术通过对作图群体亲本和子代群体进行测序，将一定数量的连续SNP作为判断子代重组位点的依据，得到每个子代的全基因组物理重组图谱。利用作图群体中全部的重组位点信息，获得构成重组事件的最小单位(Recombination bin)和Bin图(即Bin map)，并利用得到的bin作为标记用于后续的连锁图谱构建和QTL定位。

本申请提供谷子父本“冀张谷一号”和母本“A2”材料，二者杂交的F1代材料，及自交13代的F2群体441份材料。将各份材料在河北张家口种植，并记录和整理分蘖数等性状数据。将各份材料进行简并基因组重测序后，比对参考基因组拼接完成，获得SNP多态性标记。通过分蘖数性状数据，获得与之相关的SNP标记，并通过克隆测序验证SNP标记。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一高通量测序和SNP标记信息分析

本例利用谷子父本“冀张谷一号”和母本“A2”材料，二者杂交的F1代材料，及自交13代的F2群体441份材料，即重组自交系(Recombinant inbred lines，缩写RILs)。将各份材料在河北张家口种植，并记录和整理分蘖数等性状数据。将各份材料进行简并基因组重测序后，比对参考基因组拼接完成，获得SNP标记。通过分析分蘖数性状数据，获得与之相关的SNP标记，并通过克隆测序验证SNP标记。

本例利用RADseq法，提取每个样本个体的基因组DNA，共计444个样本，其中包括其中441个RILs、2个亲本、1个F1个体。对提取的基因组DNA进行质量检测，对合格的DNA进行酶切，电泳回收DNA片段，并加上接头进行cluster制备，最后上机测序。

本例的具体步骤如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗，再转入离心管中，混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1L的1.5×CTAB配方包括：15g的CTAB、1mol/L的pH8.0的Tris.Cl 75mL、0.5mol/L的EDTA 30mL、NaCl 61.4g，加去离子水定容至1L；使用前加入约2mL的巯基乙醇，使其终浓度为0.2％。

(2)水浴完成后，冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇，轻轻混匀，至下层液变为深绿色；其中氯仿/异戊醇的体积比为氯仿:异戊醇为24:1。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入50μL TE溶解DNA。

(5)检测DNA的浓度，并用水调整为20ng/μL。

(6)采用PstI酶进行酶切，打断基因组DNA，PstI酶的酶切反应体系为30μL，包括：基因组DNA 20μL、PstI酶1μL、10×PstI缓冲液3μL、Nuclease-free water 6μL。酶切反应体系配制好后，在37℃恒温孵育至少1小时。

(7)加接头反应，在打断的基因组DNA片段上添加测序接头，加接头反应的体系为40μL，包括：PstI酶切产物30μL、测序接头1μL、10×连接buffer 1μL、T4 DNA ligase 2μL、rATP 0.4μL、ddH₂O 5.6μL。

(8)每个样品各取1μL反应产物，加入在一个新的离心管中，每12个样品一组，每组的总体积为12μL。

(9)用3％回收胶电泳1h，EB染色后切取300-700bp大小片段。用QIAquick Kit进行胶纯化回收，回收产物溶于30μL的EB溶液。

(10)进行PCR反应，采用测序接头的通用引物对切记回收的片段进行PCR扩增，PCR反应体系25μL，包括：10×buffer 2.5μL、25mM的dNTPs 0.25μL、5U/μL的高保真酶0.25μL、10μM的测序接头正向引物0.5μL、10μM的测序接头反向引物0.5μL、切胶回收产物20μL、无菌水1μL。

PCR反应条件为，94℃预变性5min，然后进入10个循环：94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸40秒，循环结束后72℃延伸3min。

(11)磁珠纯化，完成建库。

具体纯化方法为：首先，向PCR产物中加入1.2倍体积磁珠，静置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500μL 70％酒精洗涤两次。干热仪上蒸干后，加入15μLEB溶液溶解5min。最后，磁力架上吸附，转移上清于1.5mL离心管中。

(12)检测达到上机标准后上机测序。

结果：对444个样本进行酶切建库测序，得到75.99Gb原始数据，平均每个个体171.54Mb。将测序序列比对到参考基因组上，平均比对率86.326％，平均覆盖率8.226％，平均测序深度为3.655×。

其中，444个样本包括441个RILs、2个亲本、1个F1个体；本例的参考基因组即Yugu基因组，可以从下列网址获取Yugu基因组序列：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝Setaria+italica+(foxtail+millet)。

通过测序和信息分析，获得亲本间有多态的33771个SNP标记。根据窗口滑动的方法，选取若干个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点，生成bin基因型和bin图。根据bin基因型数据，用MSTMap软件构建遗传图谱，2022个bin定位到9条染色体上，再将遗传图谱数据导入到MapChart软件，整合一张基因组遗传连锁图谱。

利用所构建的谷子高密度遗传图谱，采用复合区间作图分析(CIM)，对谷子分蘖数性状表型进行QTL分析。QTL检测采用5％的总体显著水平，根据500次排列检验结果，确定分蘖数性状表型数据QTL分析的临界LOD值，分析得到与分蘖数相关的预测bin区间和SNP位点信息。

结果显示，与谷子分蘖数性状相关的SNP标记位于遗传连锁图谱第三条染色体的238.05厘摩(cM)，第293个bin至第294个bin(即chr3_bin293-chr3_bin294)，也就是第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记内；其中，TN-03-847位点位于第三条染色体的序列第48401847bp位置；这些与谷子分蘖数性状相关的SNP标记的碱基都是T或C。利用复合区间作图法，采用5％的总体显著水平，QTL检测的LOD值为3.9399，表型变异解释率为2.15％，加性效应值(Additive effect,A)为-0.1852。

实施例二SNP标记验证

根据预测的bin标记和SNP位点，对比参考基因组，得到相关区域基因序列，选取SNP位点前后300bp左右，设计开发SNP标记引物，以父本和母本材料DNA为模板进行PCR扩增。选择引物扩增正常、PCR扩增产物复合预测大小的扩增产物进行切胶回收，并进行测序，选择父本和母本材料扩增基因序列有SNP位点差异的标记引物。以F1代和F2代材料为模版，进行SNP标记引物PCR扩增和结果测序，选择符合基因分型和与表型性状相关的标记引物。

首先，根据PCR产物回收后的测序结果，选择父本和母本材料扩增基因序列SNP位点差异的标记。具体步骤如下：

(1)按照实施例一中步骤(1)至(4)，用CTAB法分别提取父本和母本基因组DNA。

(2)用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的父本和母本基因组DNA，检测结果如图1所示，其中，第二泳道即标注为1的泳道表示父本“冀张谷一号”基因组DNA，第三泳道即标注为2的泳道表示母本“A2”基因组DNA。可见父本和母本基因组DNA提取成功。

(3)将提取的父本和母本基因组DNA存储于-20℃备用。

(4)分别以提取的父本和母本基因组DNA为模板，采用3_1F和3_1R引物组合对基因组DNA进行扩增。其中，上游引物3_1F为Seq ID No.2所示序列，下游引物3_1R为Seq IDNo.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-GTTGCGTGGTATCAATGTG-3’

Seq ID No.3：5’-AAATGGTGTTTGGTAGGGT-3’。

PCR反应体系25μL，包括：10×buffer 2.5μL、25mM的dNTPs 0.15μL、5U/μL的Taq酶0.15μL、10μM的上游引物0.5μL、10μM的下游引物0.5μL、基因组DNA 1.0μL、无菌水20.2μL。

PCR反应条件为，94℃预变性5min，然后进入35个循环：94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸40秒，循环结束后72℃延伸3min。

PCR扩增产物经纯化后于4℃保存。各PCR扩增产物取部分进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。图2中，第一泳道即标注A3-1的泳道，表示以母本“A2”基因组DNA为模板的PCR扩增产物，第二泳道即标注为33-1的泳道，表示以父本“冀张谷一号”基因组DNA为模板的PCR扩增产物。图2的结果显示，引物3_1F和3_1R能够对父本和母本的基因组DNA扩增出符合预期的靶标片段。

分别对父本和母本的基因组DNA扩增产物进行测序，引物3_1F和3_1R扩增得到的父本扩增产物的测序序列如Seq ID No.1所示序列，TN-03-847位点是Seq ID No.1所示序列中自5’端起第63位碱基。父本扩增产物和母本扩增产物的测序序列比对结果如图3所示，其中背景标灰的碱基表示TN-03-847位点的碱基，母本碱基为T，父本碱基为C。

然后，根据样品分蘖数数据筛选：父本分蘖数为5，母本分蘖数为1。441份样品中，最小值1，最大值12；分蘖数最多的50个样品中，与父本SNP相同的样品数多于70％。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 张家口市农业科学院(河北省高寒作物研究所)

<120> 与谷子分蘖数性状相关的SNP标记及其检测引物和应用

<130> 17I25619

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> TN-03-847位点所在序列

<400> 1

gttgcgtggt atcaatgtga tgtttcatgt gtcgagtgct tcacgatatg ctttcaactt 60

tactattgat atttatgaca tggcacatat aaaagctatt aatgcgcacg agcttaaaaa 120

tgcaatatgt tgatataaac aatgatcaac ggtcattagc aaattattta tcatatagct 180

agtctgcggc aacacatgga gtaccaacta gctgccgctt acaacttact taaactagat 240

tcatgtacgt gtttgttcct cattatatct tttcaaagaa atctcttatt tttaatatat 300

tatttttatg ttggtgaata ccctaccaac accatt 336

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgcgtggt atcaatgtg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaatggtgtt tggtagggt 19

Claims (10)

1.一种与谷子分蘖数性状相关的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记位于第三条染色体第48401847bp至第48662086bp的bin标记内，所述SNP标记与谷子分蘖数紧密连锁。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的碱基为T或C。

3.根据权利要求1或2所述的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记包括TN-03-847位点，所述TN-03-847位点位于第三条染色体的序列第48401847bp位置，所述TN-03-847位点所在的序列如Seq ID No.1所示，所述TN-03-847位点是Seq ID No.1所示序列中自5’端起第63位碱基。

4.根据权利要求3所述的SNP标记，其特征在于：对SNP标记，利用复合区间作图法，采用5％的总体显著水平，QTL检测的LOD值为3.9399，表型变异解释率为2.15％。

5.一种检测权利要求1-4任一项所述的SNP标记的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-GTTGCGTGGTATCAATGTG-3’

Seq ID No.3：5’-AAATGGTGTTTGGTAGGGT-3’。

6.一种检测权利要求1-4任一项所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求5所述的引物对；优选的，所述试剂盒中还包括用于PCR扩增的试剂。

7.一种检测权利要求1-4任一项所述的SNP标记的方法，其特征在于：包括采用权利要求5所述的引物对，或者权利要求6所述的试剂盒，对待测的谷子基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的测序结果，获得所述SNP标记的碱基情况。

8.一种预测谷子分蘖数的方法，其特征在于：包括采用权利要求5所述的引物对，或者权利要求6所述的试剂盒，对预测对象的谷子基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的测序结果，获得权利要求1-4任一项所述的SNP标记的碱基情况，根据所述SNP标记的碱基情况预测谷子的分蘖数。

9.根据权利要求1-4任一项所述的SNP标记在谷子分蘖数预测、谷子分蘖数性状早期鉴定或谷子分子辅助筛选育种中的应用。

10.根据权利要求5所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在谷子分蘖数预测、谷子分蘖数性状早期鉴定或谷子分子辅助筛选育种中的应用。