CN108676877A - 一种PML-RARα融合基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因探针稳定剂，包含以下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris‑HCl、EDTA、海藻糖、甘油和叠氮钠。本发明还公开了所述基因探针稳定剂的用途及含有所述基因探针稳定剂的PML‑RARα融合基因检测试剂盒；所述检测试剂盒包含探针溶液，所述探针溶液包含以下组分：所述基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针。本发明提供的基因探针稳定剂可有效防止探针在存放过程中降解，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性，且能确保检测结果的可靠性，避免出现假阴性结果。本发明提供的PML‑RARα融合基因检测试剂盒稳定性好、灵敏度和特异性高，检测结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基因探针稳定剂及含有该探针稳定剂的PML-RARα融合基因检测试剂盒。
背景技术
PML-RARα是急性早幼粒细胞白血病(M3)的诊断指标，而M3的治疗是区别于其他急性髓系白血病(AML)。M3是急性髓细胞白血病的一种特殊类型，其特点是骨髓及其他造血组织中有大量白血病细胞无限制地增生，并进入外周血液，而正常血细胞的制造被明显抑制，该病居于年轻人恶性疾病首位，病因至今仍不完全清楚。
位于15q22的PML基因与位于17q21的RARα基因相互易位，形成PML-RARα融合基因。RARα融合基因的表达干扰了正常RARα在核内的分布和对细胞分化的调控，使大量细胞阻滞在早幼细胞阶段，在APL发病机制中起到重要作用。因此，对PML-RARα融合基因进行检测，能够更好地指导患者分子靶向治疗和预后判断。
鉴于白血病的相关融合基因的检测对于白血病诊断、分型、临床治疗选择、预后疗效评价以及微小残留病检测上的临床价值，融合基因检测技术的开发具有极大的临床意义和市场价值。
荧光原位杂交法(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是目前检测PML-RARα基因融合最常用的方法。由于PML-RARα阳性细胞没有典型的表面标志物，因此只能用分裂中期(MP)细胞核型分析、RT-PCR或荧光原位杂交(FISH)的方法进行检测。其中FISH技术是利用携带荧光标记的核酸探针与被检样本中的靶DNA同源互补而进行杂交，在荧光显微镜下直接分析杂交靶序列的彩色探针信号，以获得细胞内基因状态信息。FISH的优点在于可以对分裂间期(IP)细胞进行检测，比常规核型分析更准确，稳定性和重复性较高，并且具有检测隐形易位、复杂核型的能力，能够直观展现出多种信号类型，具有其他检测方法不可及的临床价值。但目前基于FISH法的检测PML-RARα融合基因检测中的探针条数多，混合存放时，易降解，导致检测结果的不稳定性，尤其容易出现假阴性检测结果，大大影响了检测结果的准确率和可信度。
为了保证试剂盒的稳定性，特别是在长途运输过程中由于环境温度的不稳定和路途颠簸等影响下还能保证良好的稳定性。目前急需开发出一种添加探针稳定剂的预混荧光探针工作液，可以在没有降解或副反应的情况下保存以简化所需操作，极大降低对使用者和使用环境的要求，提供便利，但与此同时，对试剂盒的稳定性提出了更高要求，增加了保证其溶液稳定性的难度，鉴于此，提出发明。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种一种基因探针稳定剂，可有效防止基因探针在存放过程中降解，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性，且能确保检测结果的可靠性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基因探针稳定剂，包含以下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl、EDTA、海藻糖、甘油和叠氮钠。
优选地，所述的基因探针稳定剂包含以下组分：2～10g/L柠檬酸钠、5～15g/LNaCl、80～150g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为30～80％的去离子甲酰胺、1～8mmol/L Tris-HCl、0.05～1mmol/L EDTA、15～30mmol/L海藻糖、体积百分比为0.1～0.25％的甘油和体积百分比为0.05～0.1％的叠氮钠。
优选地，所述的基因探针稳定剂包含以下组分：6.5g/L柠檬酸钠、13g/L NaCl、145g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为65％去离子甲酰胺、4.5mmol/L Tris-HCl、0.4mmol/LEDTA、20mmol/L海藻糖、体积百分比为0.1％的甘油和体积百分比为0.05％的叠氮钠。
本发明基因探针稳定剂的组分和各组分的使用量是发明人经过大量研究和分析得出的，可有效保护基因探针，防止基因探针在存放过程中降解，同时不会影响基因探针的检测性能。
本发明还提供了所述的基因探针稳定剂在制备基因检测试剂或试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种基因检测试剂盒，包含探针溶液，所述探针溶液包含所述的基因探针稳定剂和基因探针。
本发明还提供了一种一种PML-RARα融合基因检测试剂盒，包含探针溶液，所述探针溶液包含以下组分：所述的基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针。
本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒灵敏度和特异性高，检测结果准确可靠。
优选地，所述针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针为以人基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到的扩增产物；所述两组探针均标记有荧光染料，同一组探针标记的荧光染料相同，不同组探针间标记的荧光染料不同；
针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、以及SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40中的至少10对；
针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.77和SEQ ID NO.78、以及SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80中的至少10对。
优选地，所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为10～100μmol/L；所述针对RARα基因的第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为10～100μmol/L。
优选地，所述荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633和Alexa Fluor 647。
优选地，所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒还包含复染液。
优选地，所述复染液包含DAPI和抗淬灭剂。
本发明所述探针包括有针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针。所述探针以人基因组DNA为模板，利用40对特异性引物对进行PCR扩增反应而得到，扩增引物序列信息见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推)。
表1扩增引物序列表
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明基因探针稳定剂的组分和各组分的使用量是发明人经过大量研究和分析得出的，可有效保护基因探针，防止基因探针在存放过程中降解，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性，且能确保检测结果的可靠性，避免出现假阴性结果；(2)本发明基因探针稳定剂不会影响基因探针的检测灵敏度和特异性；(3)本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒具有高灵敏度和特异性。对本试剂盒的性能研究试验表明，本试剂盒检测参考品的分析灵敏度为100％，分析特异度为100％，阴/阳性符合率为100％，检测结果准确可靠。
附图说明
图1为本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的红色信号数量和绿色信号数量的计数方式的参考图；
图2为本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的阴阳性细胞信号模式示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明基因探针稳定剂的一种实施例，所述基因探针稳定剂包含以下组分：6.5g/L柠檬酸钠、13g/L NaCl、145g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为65％去离子甲酰胺、4.5mmol/LTris-HCl、0.4mmol/L EDTA、20mmol/L海藻糖、体积百分比为0.1％的甘油和体积百分比为0.05％的叠氮钠。
实施例2
本发明基因探针稳定剂的一种实施例，所述基因探针稳定剂包含以下组分：8g/L柠檬酸钠、12g/L NaCl、90g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为45％的去离子甲酰胺、3mmol/LTris-HCl、0.8mmol/L EDTA、30mmol/L海藻糖、体积百分比为0.15％的甘油和体积百分比为0.05％的叠氮钠。
实施例3
本发明基因探针稳定剂的一种实施例，所述基因探针稳定剂包含以下组分：6g/L柠檬酸钠、15g/L NaCl、150g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为80％的去离子甲酰胺、8mmol/LTris-HCl、1mmol/L EDTA、20mmol/L海藻糖、体积百分比为0.1％的甘油和体积百分比为0.1％的叠氮钠。
实施例4
本发明基因探针稳定剂的一种实施例，所述基因探针稳定剂包含以下组分：10g/L柠檬酸钠、5g/L NaCl、80g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为30％的去离子甲酰胺、1mmol/LTris-HCl、0.05mmol/L EDTA、30mmol/L海藻糖、体积百分比为0.2％的甘油和体积百分比为0.08％的叠氮钠。
实施例5
本发明基因探针稳定剂的一种实施例，所述基因探针稳定剂包含以下组分：2g/L柠檬酸钠、7g/L NaCl、130g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为65％的去离子甲酰胺、7mmol/LTris-HCl、0.1mmol/L EDTA、25mmol/L海藻糖、体积百分比为0.25％的甘油和体积百分比为0.06％的叠氮钠。
实施例6
本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：探针溶液和复染液。
所述探针溶液包含以下组分：实施例1所述基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针；所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为10μmol/L，每条探针标记有红色荧光染料(Cy3)，识别人类15号染色体15q22；所述针对RARα基因第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为10μmol/L，每条探针标记有绿色荧光染料(Alexa Fluor 488)，识别人类17号染色体17q21。
所述复染液含有DAPI和抗淬灭剂，购于Slow Fadeantifade reagent，货号为S36939。
所述探针溶液制备方法如下：
1、扩增引物的设计
PML-RARα融合基因是由位于15q22的PML基因与位于17q21的RARα基因相互易位而形成。由于PML基因和RARα基因长度较小，排除重复序列和变异性较高的序列之后，可用于探针制备的区域有限，因此，本发明探针的制备分别选用PML基因上游和下游各200kb序列和RARα基因上游和下游各200kb序列。为实现检测，分别设计了2组扩增引物：针对PML基因上游和下游各200kb序列的第一组扩增引物和针对RARα基因上游和下游各200kb序列的第二组扩增引物。
所述扩增引物组的扩增区域分别为PML和RARα基因上下游目标检测区域中非重复且高度保守的片段，片段长度大于1000bp，扩增引物相应的扩增产物针对每个基因的上下游扩增产物分别构成了第一组和第二组探针库。扩增引物序列信息见表1。
引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条序列分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液，并做好标记。
2、探针库构建
利用上述设计的引物对，以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增，相应的扩增产物分别构成了第一组和第二组探针库。
(1)人基因组DNA提取：根据本领域现有技术，可参考《分子克隆实验指导-第三版》(科学出版社)或按照市售人基因组DNA提取试剂盒产品说明书进行操作。
(2)配置PCR引物工作液：针对第一组探针库，将相应的扩增引物(1F/1R-20F/20R)分为4个扩增引物组，对PML基因上游的2个非重复且高度保守区域和下游的2个非重复且高度保守区域进展扩增，分别取相应的扩增引物(1F/1R-5F/5R、6F/6R-10F/10R、11F/11R-15F/15R、16F/16R-20F/20R)储存液50ul置于4支1.5ml离心管中，使用10mmol/L TrisBuffer配制成终浓度各为10pmol/mL的4支扩增引物工作液，相应做好标记；针对第二组探针库，将相应的扩增引物(21F/21R-40F/40R)分为4个扩增引物组，对RARα基因上游的2个非重复且高度保守区域和下游的2个非重复且高度保守区域进行扩增：分别取相应的扩增引物(21F/21R-25F/25R、26F/26R-30F/30R、31F/31R-35F/35R、36F/36R-40F/40R)储存液50ul置于4支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的4支扩增引物工作液，相应做好标记。
(3)配置PCR扩增体系：分别进行上述8个体系的扩增，扩增体系试剂组成如下：
(4)PCR扩增：配置好体系后轻轻混合均匀，瞬时离心5-10s，按如下程序进行扩增：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，从第二步开始30个循环，72℃5min，4℃保持。
(5)产物鉴定和纯化：将针对PML基因上游2个非重复且高度保守区域和下游2个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第一组探针库；将针对RARα基因上游2个非重复且高度保守区域和下游2个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第二组探针库。通过2％琼脂糖凝胶电泳对两组探针库进行鉴定，切割目的产物并回收，经纯化干燥后即得到第一组和第二组探针库，相应做好标记。
3、染料标记探针本实施例优选Cy3(红色荧光)标记第一组探针，优选Alexa Fluor488(绿色荧光)标记第二组探针。人工合成Cy3标记和Alexa Fluor 488标记的polyA序列，所述polyA序列包含1-30个碱基，优选的是包含10-20个碱基，更优选的是包含2-8个碱基，polyA序列末端修饰有链霉亲和素。将Cy3标记和Alexa Fluor 488标记的polyA序列分别与修饰有生物素的第一组和第二组探针库混合(每100ug探针库加入20uL荧光标记的polyA序列)，于37℃缓慢摇动孵育30min，得到相应荧光标记的探针。探针经纯化和沉淀，溶解在探针稳定剂中，即获得含红色标记的第一组探针和绿色标记的第二组探针的探针溶液，将探针溶液于-20℃避光保存。
采用本实施例提供的PML-RARα基因融合检测试剂盒进行检测的步骤如下：
1、样本预处理
1.1样本要求
样本为临床疑似慢性髓细胞性白血病患者血液滴片。
1.2推荐的血液滴片制作工艺：
低渗：1ml新鲜血液抽取下后24小时内离心去上清，加入37℃温浴的75mM KCl低渗液8ml，迅速吹打混匀，37℃水浴20-30min。
固定：固定液(3:1甲醇：冰乙酸)室温固定30min，固定2次。固定时间，固定次数可根据不同实验需求决定。
滴片：加适量固定液重悬细胞，滴片。
1.3样本漂洗：室温下将滴片浸泡在2×SSC(SSC缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)：氯化钠88g、柠檬酸钠44g、超纯水400mL，充分溶解混匀，室温下将溶液pH值调至5.3，用超纯水将溶液定容至500mL，0.45μm滤器过滤。)中，漂洗2min。
1.4样本脱水：室温下将切片依次浸没在70％、85％、100％乙醇中脱水各2min无水乙醇处理后自然风干滴片。
2、FISH检测
FISH检测包括杂交、杂交后洗涤与DAPI复染三个步骤。因为探针上的荧光基团见强光容易发生淬灭，所以以上三个步骤均需在暗处操作(避光操作)。
2.1准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。
2.2杂交(避光操作)：在滴片样本杂交区域加入10μLPML-RARα双色探针溶液(每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针的均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将滴片放入预热并已安装好湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：75℃(+/-1℃)变性2min，37℃杂交过夜(14h～18h)。
2.3杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(72±1℃)，将洗涤缓冲液I置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于72±1℃的洗涤缓冲液Ⅰ中2min，再置于室温的洗涤缓冲液Ⅱ中30s；最后置于纯水中3-5s漂洗一次，洗涤后将切片直立风干。
2.4DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，室温避光5-10min后即可显微镜下观察荧光信号。DAPI复染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存时间不超过72h)，需要检测时将切片放至室温后进行观察。
3、结果判定标准
(1)本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒结果判定标准如下：
a、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数小于3个(3/100或＜3％)，该样本判定为阴性。
b、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数大于5个(5/100或＞5％)，该样本判定为阳性。
c、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数介于3-5个(3-5％)，需另一阅片人另外计数100个细胞。汇总两位阅片人计数细胞数与阳性细胞数，即总计200个细胞中，若阳性细胞总数小于8个(＜4％)，该样本判定为阴性，若阳性细胞总数大于等于8个(≥4％)，该样本判定为阳性。
(2)本发明细胞荧光信号计数标准如图1所示，图中灰色代表红色点，白色代表绿色点；细胞的阳性与阴性判定标准如图2所示，图中黑色代表红色点，白色代表绿色点。上下移动显微镜视野，查找所有存在于细胞核内的信号：
a、以下信号模式可判定为PML-RARα融合基因阳性细胞：间期核中出现的是1个红色、1绿色和2个红绿杂交信号(1R1G2F)；
b、以下信号模式可判定为PML-RARα融合基因阴性细胞：间期核中出现的是2个红色和2个绿色随机分散的4个杂交信号(2R2G)。
实施例7
本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：探针溶液和复染液。
所述探针溶液包含以下组分：实施例2所述基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针；所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为90μmol/L，每条探针标记有红色荧光染料(Cy3)，识别人类15号染色体15q22；所述针对RARα基因的第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为90μmol/L，每条探针标记有绿色荧光染料(Alexa Fluor 488)，识别人类17号染色体17q21。
所述复染液同实施例6。
本实施例所述探针溶液的制备方法、试剂盒的检测步骤和结果判定标准同
实施例6。
实施例8
本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：探针溶液和复染液。
所述探针溶液包含以下组分：实施例3所述基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针；所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为50μmol/L，每条探针标记有红色荧光染料(Cy3)，识别人类15号染色体15q22；所述针对RARα基因的第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为50μmol/L，每条探针标记有绿色荧光染料(Alexa Fluor 488)，识别人类17号染色体17q21。
所述复染液同实施例6。
本实施例所述探针溶液的制备方法、试剂盒的检测步骤和结果判定标准同实施例6。
实施例9
本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：探针溶液和复染液。
所述探针溶液包含以下组分：实施例4所述基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针；所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为25μmol/L，每条探针标记有红色荧光染料(Cy3)，识别人类15号染色体15q22；所述针对RARα基因的第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为25μmol/L，每条探针标记有绿色荧光染料(Alexa Fluor 488)，识别人类17号染色体17q21。
所述复染液同实施例6。
本实施例所述探针溶液的制备方法、试剂盒的检测步骤和结果判定标准同实施例6。
实施例10
本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：探针溶液和复染液。
所述探针溶液包含以下组分：实施例5所述基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针；所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为75μmol/L，每条探针标记有红色荧光染料(Cy3)，识别人类15号染色体15q22；所述针对RARα基因的第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为75μmol/L，每条探针标记有绿色荧光染料(Alexa Fluor 488)，识别人类17号染色体17q21。
所述复染液同实施例6。
本实施例所述探针溶液的制备方法、试剂盒的检测步骤和结果判定标准同实施例6。
实施例11
本实施例利用实施例6所述PML-RARα融合基因检测试剂盒和检测方法对20份样品进行检测，同时以TE缓冲液(含25mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)稀释探针制得的探针溶液(探针浓度10μmol/L)作为对照组1，以灭菌双蒸水稀释探针制得的探针溶液(探针浓度10μmol/L)作为对照组2；以广州安必平医药科技股份有限公司生产的PML-RARα(DF)融合基因检测试剂盒(荧光原位杂交法)作为参比阳性对照，计算本发明实施例1所述试剂盒、对照组1和对照组2的检测结果吻合率。检测结果见表2。
表2 20份样品进行检测的结果
备注：“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果。
由表2可知，本发明实施例6提供的试剂盒和对照组1的检测结果与阳性对照的吻合率达100％，对照组2在检测13、14和17号样品的结果与其他组不一致，其吻合率为85％，表明用灭菌双蒸水作为稀释液稀释探针可产生假阴性结果。对照组1在检测20号样品的结果与其他组不一致，其吻合率为95％，表明用TE缓冲液作为稀释液稀释探针时也有可能产生假阴性结果。
实施例12
本实施例研究本发明所述PML-RARα融合基因检测试剂盒的稳定性和准确性。
将本发明实施例6所述试剂盒、实施例11中对照组1和对照组2所述试剂盒于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月和36个月后，再对实施例11中的2号样本进行检测，检测方法同实施例6。检测结果如表3所示。
表3各组试剂盒在存放不同时间后对2号样品的检测结果
由表3的数据可知，本发明实施例6提供的PML-RARα融合基因检测试剂盒的在-20℃存放36个月后，其检测结果的准确性仍高达100％，而对照组1和2中的试剂盒在存在6个月以后即不能对样本进行准确检测，说明本发明试剂盒准确性和稳定性明显高于对照组1和对照组2。本发明实施例6提供的PML-RARα融合基因检测试剂盒包含基因探针稳定剂，能有效保护试剂盒中的基因探针，防止探针降解，保证试剂盒的准确性和稳定性，延长保质期，避免出现假阴性结果。
实施例13
本实施例研究本发明基因探针稳定剂组分的使用量对探针的保护效果。
本发明基因探针稳定剂组分的使用量是发明人经过大量研究和分析得出的，可有效保护基因探针，防止基因探针在存放过程中降解。为了研究基因探针稳定剂组分的使用量对探针的保护效果，设置实验组1～5和对照组3～4，其中，实验组1～5利用实施例1～5中的基因探针稳定剂制备试剂盒，对照组3～4利用表4中的基因探针稳定剂制备试剂盒，各组试剂盒中除了探针溶液中基因探针稳定剂的组分用量不同外，其余成分同实施例6。
表4实验设计
将实验组1～5和对照组3～4中的试剂盒于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月和36个月后，再对实施例11中的2号样本进行检测，检测方法同实施例6，检测结果如表5所示。
表5各组试剂盒存放不同时间点后对2号样品的检测结果
由表5可知，本发明实验组1～5提供的PML-RARα融合基因检测试剂盒(包含实施例1～5所述基因探针稳定剂)在存放36个月后，其检测结果的准确性达80％以上，尤其是实验组1(包含实施例1所述基因探针稳定剂)提供的PML-RARα融合基因检测试剂盒检测准确性最好，在-20℃存放36个月后其检测结果的准确性高达100％。而对照组3和对照组4中的PML-RARα融合基因检测试剂盒在存放12个月后，即不能将样本中的PML-RARα融合基因准确检出，检测结果也不稳定，其检测准确性明显下降。本发明试剂盒探针溶液中基因探针稳定剂组分的使用量是发明人经过大量研究和分析得出的，只有在本发明组分的使用量范围内，才能有效保护探针溶液中的探针，防止其降解，大大地延长探针的存放时间，提高检测结果的准确性和稳定性，避免出现假阴性结果。而基因探针稳定剂组分的使用量不在本发明范围内时，其使用效果与TE缓冲液相当，并不能保护探针溶液中的探针，从而使其检测准确性下降(对照组3和对照组4)。
实施例14
本实施例以海藻糖和叠氮钠为例，研究本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒探针溶液中基因探针稳定剂组分的选择对探针的保护效果。
本发明基因探针稳定剂组分的选取是发明人经过大量研究和分析得出的，可有效保护基因探针，防止基因探针在存放过程中降解。为研究基因探针稳定剂组分的选择对探针的保护效果，设置对照组5和6，具体如表6所示，对照组5和对照组6试剂盒除了探针溶液中探针稳定剂不添加叠氮钠或海藻糖外，其他组分和组分使用量同实施例12中实验组1试剂盒。
表6稳定剂配方部分组分单一性试验设计
| 稳定剂成分 | 对照组5 | 对照组6 |
| 柠檬酸钠(g/L) | 7.5 | 7.5 |
| NaCl(mol/L) | 15.5 | 15.5 |
| 硫酸葡聚糖(g/L) | 115 | 115 |
| 去离子甲酰胺(％) | 68 | 68 |
| Tris-HCl(mmol/L) | 5.5 | 5.5 |
| EDTA(mmol/L) | 0.65 | 0.65 |
| 甘油(％) | 0.1 | 0.1 |
| 叠氮钠(％) | 0 | 0.05 |
| 海藻糖(mmol/L) | 20 | 0 |
将表6中对照组5、对照组6和实施例12中实验组1制备得到的试剂盒于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月和36个月后，再对实施例11中的2号样本进行检测，检测方法同实施例6，检测结果如表7所示。
表7各组试剂盒存放不同时间点后对2号样品的检测结果
由表7可知，对照组5和对照组6中的PML-RARα融合基因检测试剂盒在分别存放12个月和6个月之后，即不能将样本中的PML-RARα融合基因准确检出，其检测准确性明显下降，而实验组1中的PML-RARα融合基因检测试剂盒在存放36个月后仍能将PML-RARα融合基因准确检出。说明本发明基因探针稳定剂配方中缺少海藻糖或叠氮钠会明显降低其对探针溶液中探针的保护效果。本发明基因探针稳定剂的配方是发明人经过大量实验和数据分析得出的，缺少任何一种组分都会明显影响基因探针稳定剂对探针的保护效果，含完整配方的基因探针稳定剂才能有效保护探针溶液中的探针，防止其降解，大大地延长探针的存放时间，提高检测结果的准确性和稳定性，避免出现假阴性结果。其他缺少一种或多种组分的基因探针稳定剂对探针的保护实验结果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例15
本实施例以实施例6所述试剂盒为例，研究本发明PML-RARα融合基因检测试剂盒在运输过程中的稳定性。
研究证明，泡沫箱内装入泡沫箱体积十分之一量的干冰，封存后存放于自然温度环境中，一周内泡沫箱内温度不会高于8℃。根据产品上市后运输需求，将产品与定量干冰置入泡沫箱内封存后，分别进行实际运输实验(将产品自广州发往哈尔滨，再从哈尔滨发回广州，共6天的运输时间)与模拟运输实验(室温，装有产品与定量干冰的泡沫箱置于实验室运输震动仪上)。将分别在实际运输环境下和模拟运输环境下存放六天的产品进行即时检验与有效期(12个月和15个月)检验，证明模拟运输实验可客观反映实际运输实验。因此，选择模拟运输实验对试生产的三批产品进行运输稳定性研究。
从三批产品中各选取6个试剂盒(10人份/盒)进行模拟运输实验。产品在模拟运输条件下(室温，将产品与定量干冰置入泡沫箱内封存，置于实验室运输震动仪上)存放，分别在存放0天、4天、5天和6天时，各批产品各取出1盒对9份参考品进行检测。其余产品在模拟运输条件下存放4天、5天、6天后，依次各取出1盒对9份参考品进行检测，其余产品在模拟运输条件下存放6天后，按产品标签要求存放(-25℃至-18℃)，分别在存放12个月和15个月时，各批产品各取出1盒对9份参考品进行检测。检测流程参照实施例1进行。
运输稳定性实验结果如表8和表9所示。三批次产品在模拟运输条件下6个实验点的检测结果表明，各参考品均符合质量控制要求，检测结果描述如下：
1)阴性参考品：结果均为阴性；同一类型参考品经不同阅片人阅片得出的样本检测结果一致。
2)阳性参考品：结果均为阳性；同一类型参考品经不同阅片人阅片得出的样本检测结果一致。
3)特异性参考品：红绿荧光信号均可被肉眼识别，每份统计的20个染色体分散良好的中期分裂相细胞核中，每条染色体上均显示1个RARα基因位点(15q22)标记的红色信号和1个PML基因位点(17q21)标记的绿色信号。
表8运输稳定性实验结果(阴/阳性参考品)
表9运输稳定性实验结果(特异性参考品)
上述实验结果显示，三批次产品在模拟运输条件下分别存放0天、4天、5天和6天后即时检测，产品检测结果准确。三批次产品在模拟运输条件下存放6天后，按储存条件存放12个月和15个月后检测，产品检测结果准确。说明产品的运输稳定性良好，能完全满足临床检测应用要求。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种PML-RARα融合基因检测试剂盒
<130> 2018424
<160> 80
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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Claims (10)
1.一种基因探针稳定剂，其特征在于，包含以下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl、EDTA、海藻糖、甘油和叠氮钠。
2.根据权利要求1所述的基因探针稳定剂，其特征在于，包含以下组分：2～10g/L柠檬酸钠、5～15g/L NaCl、80～150g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为30～80％的去离子甲酰胺、1～8mmol/L Tris-HCl、0.05～1mmol/L EDTA、15～30mmol/L海藻糖、体积百分比为0.1～0.25％的甘油和体积百分比为0.05～0.1％的叠氮钠。
3.根据权利要求2所述的基因探针稳定剂，其特征在于，包含以下组分：6.5g/L柠檬酸钠、13g/L NaCl、145g/L硫酸葡聚糖、体积百分比为65％去离子甲酰胺、4.5mmol/L Tris-HCl、0.4mmol/L EDTA、20mmol/L海藻糖、体积百分比为0.1％的甘油和体积百分比为0.05％的叠氮钠。
4.根据权利要求1～3任一项所述的基因探针稳定剂在制备基因检测试剂或试剂盒中的用途。
5.一种基因检测试剂盒，其特征在于，包含探针溶液，所述探针溶液包含权利要求1～3任一项所述的基因探针稳定剂和基因探针。
6.一种PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，包含探针溶液，所述探针溶液包含以下组分：权利要求1～3任一项所述的基因探针稳定剂、针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针。
7.根据权利要求6所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述针对PML基因的第一组探针和针对RARα基因的第二组探针为以人基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到的扩增产物；所述两组探针均标记有荧光染料，同一组探针标记的荧光染料相同，不同组探针间标记的荧光染料不同；
针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQID NO.38、以及SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40中的至少10对；
针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.77和SEQ ID NO.78、以及SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80中的至少10对。
8.根据权利要求6所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述针对PML基因的第一组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为10～100μmol/L；所述针对RARα基因的第二组探针中每条探针在探针溶液中的浓度为10～100μmol/L。
9.根据权利要求7所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor633和Alexa Fluor 647。
10.根据权利要求6～9任一项所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，还包含复染液。
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