CN108676798A - 针对AHI1基因编辑的sgRNA筛选及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对AHI1基因的sgRNA，通过白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系证实了上述序列的编辑效率，证明本发明的序列具有优异的编辑效率，为以后的AHI1基因疗法提供参考。

Description

针对AHI1基因编辑的sgRNA筛选及应用
技术领域
本发明属于基因技术，具体涉及针对AHI1基因的sgRNA，具有高的编辑效率。
背景技术
AHI1（Abelson Helper Integration Site 1） 基因可以促进人类小脑和皮质发育，若发生基因突变，可以出现Joubert综合症。CRISPR/Cas9 (Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)基因编辑系统是自ZFNs、TALENs发展而来的第三代基因编辑系统，是从细菌的适应性免疫防御系统中发现，用来对抗外源DNA以及入侵的病毒，目前已经被广泛的应用于生物医学领域。CRISPR/Cas9的特点是其设计简单、成本低廉、识别不受基因甲基化影响、编辑效率高、能同时靶向多个靶点以及含有PAM位点的任意序列等。以前的研究已经证明由crRNA的3'末端与tracrRNA的5'末端形成的sgRNA可以指导Cas9核酸酶剪切与crRNA序列互补的靶序列。剪切靶序列后，细胞修复DNA双链断裂的方式分为同源重组修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）两种。
在Shinmyo等人的研究中，3条sgRNA序列被设计用于小鼠大脑Satb2基因的敲除，但是它们之间的编辑效率差别巨大。所以，相对高效率且较低脱靶效应的sgRNA的选择对于CRISPR/Cas9基因编辑的广泛应用是决定性的。评价一个特定靶序列的sgRNA的特异性和有效性，目前有以下几种方法被广泛应用，如T7 endonuclease I 实验，PCR产物测序，Digenome-seq技术，GUIDE-seq技术，HTGTS技术，IDLV法和在线工具预测，但这些方法通常费时费力，需要的仪器设备要求较高或者预测不准确。针对特定的靶基因，大量的sgRNA序列可以被设计，因为Cas9酶可以酶切任何毗邻PAM位点的靶序列，但每一条sgRNA的编辑效率都不一样，如PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的高低受到多种因素影响，其中不同sgRNA序列之间特异性的高低对其影响尤为重要。
发明内容
本发明公开了一种AHI1基因最优sgRNA，为以后的基因疗法提供参考。
本发明采用如下技术方案：
一种针对AHI1基因的sgRNA，所述针对AHI1基因的sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。
一种针对AHI1基因的药物，包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA。
上述技术方案中，所述针对AHI1基因的药物还包括药物载体，比如常规聚合物载体、细胞载体等。
一种针对AHI1基因的质粒，包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA与载体。
优选的，所述针对AHI1基因的质粒中，载体为pCas9质粒。
本发明中所述SEQ ID NO.1的序列为：5'- GATAATGTCTCCGCGATGGATGG -3' 。
本发明通过白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系证实了上述序列的编辑效率，为60～62%。
因此本发明还公开了序列为SEQ ID NO.1的sgRNA在制备针对AHI1基因药物中的应用以及在制备针对Joubert综合症药物中的应用。
首先，pMD-19T质粒上编码β-gal区域的部分序列被一段含有靶序列的长序列替换，从而形成移码突变，替换后的质粒称为pMD-repeat质粒，单独转化在含有X-gal和IPTG的固体培养基中不能形成蓝色菌落；当与装载有靶序列对应sgRNA的pCas9质粒共转化时，pMD-repeat质粒中靶序列会被sgRNA引导的Cas9蛋白酶切，靶序列前后两段重复序列发生同源重组，使编码β-gal的基因序列由移码恢复为非移码状态，在X-gal和IPTG诱导下，形成蓝色菌落。
构建含有sgRNA序列的原核细胞基因敲除pCas9质粒和含有对应靶序列的pMD-repeat质粒，两种质粒等量共转化到DH5α感受态细胞，在含有X-gal-TPTG-氯霉素-氨苄青霉素的培养基培养，观察蓝色菌落占全部菌落比例。构建含有sgRNA序列的真核细胞基因敲除pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒，转染HeLa细胞，发挥基因编辑作用后，提取对照组和实验组中细胞基因组，在sgRNA上下游区域设计引物，Q5高保真酶PCR，产物纯化，T7E1酶消化，琼脂糖凝胶电泳，观察电泳后条带结果；设计测序引物，纯化后的产物测序，观察Cas9酶切位点附近有无套峰以及套峰的高低。数据证明，本发明公开了针对AHI1基因的sgRNA具有最优编辑效率。
附图说明
图1为pCas9质粒的sgRNA克隆示意图；
图2为pMD-repeat质粒lacZ基因部分碱基序列图；
图3为pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒图；
图4为白变蓝克隆形成实验原理示意图；
图5为白变蓝克隆形成实验AHI1-sgRNA双质粒共转化菌落图；
图6为白变蓝克隆形成实验AHI1-sgRNA双质粒共转化蓝色菌落占总菌落比值图（n=3，mean ± SD）；
图7为pMD-repeat质粒修复测序图。
具体实施方式
1.1实验细胞
人宫颈癌HeLa细胞株由苏州大学药学院王光辉课题组提供。
1.2主要仪器
仪器名称 厂家
4℃冰箱 青岛海尔
-20℃低温冰箱 日本 SANYO 公司
-80℃低温冰箱 日本 SANYO 公司
梯度 PCR 仪 杭州朗基
5810R 低温高速离心机 德国 Eppendorf 公司
常温高速离心机 德国 Eppendorf 公司
Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司
微量移液器 德国 Eppendorf 公司
数显鼓风干燥箱 上海博讯
电子分析天平 美国 Sartorius 公司
DK-600B 电热恒温水槽 上海精宏公司
隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器公司
凝胶成像分析系统 复日科技
恒温震荡培养箱 上海一恒科学仪器公司
DDY-5 型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂
Air tech 净化工作台 苏净集团
高压灭菌锅 上海博讯
Nanodrop 2000/2000C分光光度计 美国Thermo 公司
CO2培养箱 美国Thermo 公司
IX71型荧光显微镜 日本Olympus公司
1.3主要试剂
1.3.1菌株与载体
菌株/载体名称 厂家
E Coli. DH5α 菌株 北京天根公司
PMD-19T (A1360 ) 美国 promega 公司
pCas9质粒 北京溯源精微科技有限公司
pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458） 美国Addgene公司
1.3.2相关试剂盒
试剂盒名称 厂家
离心柱型质粒小提试剂盒 北京天根公司(货号#DP103-03)
离心柱型 DNA 纯化回收试剂盒 北京天根公司(货号#DP214-02)
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 北京天根公司(货号#DP304-02)
1.3.3其他试剂
都为市购产品。
1.4试剂溶液配置
1.4.1 100 mg/mL 氨苄青霉素
用10mLddH2O溶解1g氨苄青霉素，0.22μm过滤膜过滤除菌。每份1mL分装，-20℃贮存。
1.4.2 25 mg/mL 氯霉素
用10mL无水乙醇溶解0.25g氯霉素，0.22μm过滤膜过滤除菌。每份1mL分装，-20℃贮存。
1.4.3 LB液体培养基
称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加入200 mL的ddH2O搅拌溶解，配置5mol/L的NaOH溶液调pH到7.0，用ddH2O定容到1L，进行分装（10mLEP管，每管加入5mL），高压蒸汽灭菌，121℃，40min；4℃保存。
1.4.4 LB固体培养基
称取酵母提取物2.5g，胰蛋白胨5g，氯化钠5g,琼脂粉7.4g，加入200mL的ddH2O搅拌溶解，配置NaOH溶液调pH到7.0，用ddH2O定容到500mL，高压蒸汽灭菌，121℃，40min，冷却至一定温度后，若配Amp固体培养基，加入300µL的100 mg/mL 氨苄青霉素；若配氯霉素固体培养基，加入25 mg/mL 氯霉素500µL；若配蓝白固体培养基，加入100mg/mL氨苄青霉素和25mg/mL氯霉素各500µL，20 mg/mL X-Gal 2100µL，24 mg/mL IPTG 500µL，混合均匀后铺板，晾干封口膜封口4℃保存。
1.4.5 50×TAE 电泳缓冲液
称取Tris碱24.2g，量取冰醋酸5.7mL，0.5mol/L EDTA 10mL，加入ddH2O定容至100mL。使用时稀释50倍至1×。
1.4.6 1×PBS
量筒量取10×PBS 50mL，加入双蒸水定容至500mL。
1.4.7 人宫颈癌细胞系HeLa培养基
取DMEM培养基450mL，加入胎牛血清50mL，青链霉素0.7mL，混合均匀，4℃保存。
1.4.8 琼脂糖凝胶制备
称取3g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150mL 1×TAE 缓冲液，混合，加热溶解，置室温冷却，加入7.5µLEB，轻轻摇匀，倒入合适的制胶盘的胶槽中，冷却。
实施例
针对AHI1基因的sgRNA，所述针对AHI1基因的sgRNA的序列为SEQ ID NO.1，具体为5'- GATAATGTCTCCGCGATGGATGG -3'。
对比例
选取另外三条sgRNA作为对比，具体如下：
SEQ ID NO.2：5'- CTCGGATAATGTCTCCGCGATGG -3'
SEQ ID NO.3：5'- AATTGGATATCCATCCCGGCTGG -3'
SEQ ID NO.4：5'- GATGAACTAACCATCCATCGCGG -3'
1、根据常规方法构建装载有上述4个AHI1 sgRNA的原核细胞基因敲除CRISPR/Cas9质粒，具体见附图1；pCas9质粒酶切体系见表1，37℃水浴锅酶切过夜，酶切后产物与未酶切质粒同时琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示切开后，加入到1.2%琼脂糖凝胶槽孔中，120V电泳约30min，以 1kb DNA Marker为参照，切胶纯化回收，纯化回收的实验步骤如下：
（1）向吸附柱加入500µL平衡液BL，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；
（2）从凝胶上切下目的条带，且可能多的切除多余凝胶，切下的凝胶称重；
（3）根据凝胶重量，向凝胶中加入等体积PC（若凝胶为0.1g，则体积视为100µL，加入的PC体积为100µL），56℃水浴10min，期间不断颠倒混匀；
（4）将溶解得到的液体冷却室温，吸取到吸附柱中，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；
（5）向吸附柱中加入600µL PW（漂洗液PW中已加无水乙醇），静置2~4min，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管，重复此操作一次；
（6）将含有吸附柱的收集管以12000rpm空离2min，于室温晾干；
（7）取一个新的离心管，将吸附柱放入，吸取50µL ddH2O于吸附柱中，放置2min，12000rpm离心2min，所得溶液即为纯化后质粒酶切产物。
表1 pCas9载体酶切体系
2、sgRNA序列的磷酸化
将金唯智公司合成的Oligo稀释成10μM，磷酸化，Oligo sgRNA序列见表2，磷酸化体系见表3，37℃，30min。
表2 用于插入pCas9质粒的sgRNA序列
表3 磷酸化体系
sgRNA退火，加入2.5μL 1M氯化钠到磷酸化产物中，使用PCR仪退火2h，从95℃慢慢冷却至室温，终产物稀释10倍。
3、连接，连接体系见表4，体系16℃反应过夜。
表4 连接反应体系
4、转化
（1）取50µL DH5α感受态细胞置于冰上，加入上述连接后20℃产物，轻轻混匀，放置30min；
（2）在42℃水浴锅中热击45s，迅速放于冰中放置10min；
（3）加入无抗生素的LB液体培养基800µL，37℃，220rpm恒温振荡培养50min；
（4）在超净台中，将菌液用移液枪转移到含氯霉素的LB固体培养基上，静置20min，倒置于37℃恒温培养箱培养；
（5）12h后，挑取10个菌落到含有氯霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒。
5、质粒DNA的提取
按照天根公司的质粒小提试剂盒(货号#DP103-03)操作说明进行操作：
（1）向吸附柱加入500µL平衡液BL，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；
（2）5mL过夜培养的菌液，12000rpm离心15min，倒掉上清；
（3）加入250µL溶液P1（试剂盒自带，已加RNaseA）到含有菌体沉淀的离心管中，漩涡振荡，使沉淀溶解；
（4）加入250µL溶液P2（试剂盒自带），上下颠倒温和混匀8~10次，使菌体裂解；
（5）立即加入350µL溶液P3（试剂盒自带），上下颠倒温和混匀10次，此时有白色絮状沉淀出现，12000rpm离心10min；
（6）将离心管中上清液用移液枪转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；
（7）向吸附柱中加入600µL PW（漂洗液PW中已加无水乙醇），静置3min，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管，重复此操作一次；
（8）将含有吸附柱的收集管以12000rpm空离2min，于室温晾干；
（9）取一个新的离心管，将吸附柱放入，吸取100µL ddH2O于吸附柱中，放置2min，12000rpm离心2min，用Nanodrop 2000测其质粒浓度和纯度。
鉴定
提取的质粒送苏州金唯智公司测序，检测目的片段是否正确插入到质粒中，保存备用。
6、重组pMD-repeat质粒-靶序列的构建
pMD-repeat质粒是从pMD-19T质粒改造而来。以HIV部分序列为参照，设计一个长序列去取代pMD-19T质粒lacZ基因中KpnI和HindIII酶切位点间的原始序列，长序列中包含两段HIV重复序列和一段靶序列，长序列连接后，质粒上原有的KpnI和HindIII酶切位点突变消失，两段重复序列和靶序列之间的KpnI和HindIII酶切位点可以用于插入sgRNA对应的目的靶序列。改造后质粒lacZ基因的阅读框发生移码，产生终止密码子，不能形成α-互补，称为pMD-repeat质粒，pMD-repeat质粒lacZ基因的阅读框被改造后的碱基序列如图2，pMD-repeat质粒lacZ基因部分碱基序列，红框代表HIV重复序列；黑框代表靶序列，红框与黑框之间是KpnI和HindIII酶切位点。
7、pMD-repeat质粒酶切、胶纯化回收
pMD-repeat质粒中含有的长序列包含有KpnI和HindIII酶切位点，在重复序列和靶序列之间，酶切后，可以插入目的靶序列。pMD-repeat质粒用KpnI和HindIII酶切，酶切体系见表5，37℃水浴反应2h；酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶纯化回收。
表5 PMD-repeat质粒的酶切体系
sgRNA对应靶序列的寡核苷酸互补
将苏州金唯智公司合成的与4条AHI1 sgRNA对应的靶序列寡核苷酸链互补。反应体系为：10×Anneal Buffer 2μL，Oligo F 1μL（10μM），Oligo R 1μL（10μM），加ddH2O16μL，总体积20μL。反应条件为：95℃，2min；每30sec降1℃至65℃；65℃，5min；每1min降1℃至25℃；25℃，1min，再冷却至4℃，靶序列寡核苷酸链序列见表6。
表6 用于插入pMD-repeat的靶序列寡核苷酸链
连接
将纯化回收后的pMD-repeat质粒与退火后的互补寡核苷酸链进行连接，体系见表7，16℃过夜反应。
表7 pMD-repeat质粒载体的连接体系
转化
将连接后的产物转化到DH5α感受态细胞中，加入800μL LB液体培养基，37℃，40min振荡培养，在含有氨苄青霉素抗性的平板上37℃培养，12h后，挑取5个菌落到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒；提取的质粒送苏州金唯智公司测序，检测靶序列是否正确插入到质粒中，保存备用。
8、重组pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒-sgRNA的构建
构建4个装载有AHI1 sgRNA的真核细胞基因敲除CRISPR/Cas9质粒，见图3。
pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒酶切、胶纯化回收，pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒酶切体系见表8，37℃水浴反应4h；酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶纯化回收。
表8 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体酶切体系
将金唯智公司合成的Oligo稀释成10μM，磷酸化，Oligo sgRNA序列见表9；磷酸化体系见表10 ，37℃，30min。磷酸化后的产物使用PCR仪退火2h，95℃，5min；每1min降1℃至25℃；25℃，1min，再冷却至4℃。慢慢冷却至室温，终产物稀释10倍；然后连接，连接体系见表11，16℃反应过夜；将连接后产物转化到DH5α感受态细胞中，加入800μL LB液体培养基，37℃，40min振荡培养，在含有氨苄青霉素抗性的平板上37℃培养，12~14h后，挑取3~5个菌落到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，提取的质粒送苏州金唯智公司测序，检测靶序列是否正确插入到质粒中，保存备用。
表9 用于插入pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒的sgRNA序列
表10 磷酸化体系
表11 连接反应体系
9、白变蓝克隆形成实验
当含有sgRNA序列的pCas9质粒和含有该sgRNA对应的靶序列的pMD-repeat质粒共转化DH5α感受态细胞时，Cas9酶会在sgRNA介导下识别并切割靶序列，引起DNA双链的断裂，两段重复序列之间会发生同源重组，仅仅只有一条重复序列会存在lacZ基因的阅读框，由移码状态变成非移码状态，在X-gal和IPTG诱导下，形成蓝色菌落，实验原理示意图见图4。
共转化实验
含有sgRNA序列的pCas9质粒和含有该sgRNA对应的靶序列的pMD-repeat质粒等量转化到50μL DH5α感受态细胞时，加入800μL LB液体培养基，37℃，40min振荡培养，在含有X-gal-TPTG-氯霉素-氨苄青霉素的平板上37℃培养，观察蓝色菌落占总菌落的比例；挑取蓝色菌落，在含有氯霉素-氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养12h，用pMD-19T的通用引物测序，观察靶序列是否被酶切并发生重复序列间的同源重组。
10、白变蓝克隆形成实验结果
装载有AHI1 sgRNA的pCas9质粒分别和对应的装载有靶序列的pMD-repeat质粒等量共转化DH5α感受态细胞，在X-gal-IPTG-Cl-Amp平板上培养，重复三次，代表性的菌落生长图如图5。通过AHI1的4条sgRNA的菌落图，可以发现本发明的sgRNA（SEQ ID NO.1）的蓝菌占全部菌落比值较高（61%）而对比sgRNA（SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4）的蓝菌占全部菌落比值低（约8%，约4%，<1%），如图6。说明本发明sgRNA的编辑效率高。在每个平板中都挑取蓝色菌落到含有Cl-Amp的LB液体培养基培养，送菌液测序，pMD-repeat质粒修复测序图都一致，如图7。
在白变蓝克隆形成实验中，pMD-19T质粒lacZ基因部分序列的替换破坏了β-gal的阅读框，单独转化时，不能产生β-gal，表现白色菌落；当与含有靶序列对应的sgRNA序列的pCas9质粒共转化时，Cas9酶会在sgRNA的引导下剪切对应的靶序列，形成DNA双链断裂（DSB），两段重复序列发生同源重组，纠正了β-gal的阅读框，在X-gal和IPTG诱导下，形成蓝色菌落。蓝色菌落占所有菌落的比例反映了该sgRNA的编辑活性，若sgRNA编辑活性低，靶序列被酶切的pMD-19T质粒少，菌落中白色菌落占全部菌落比值就高。从上可以看出，本发明公开的sgRNA具有优异的编辑效率，取得了意想不到的技术效果。
序列表
<110> 苏州大学张家港工业技术研究院
苏州大学
<120> 针对AHI1基因编辑的sgRNA筛选及应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gataatgtct ccgcgatgga tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcggataat gtctccgcga tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattggatat ccatcccggc tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatgaactaa ccatccatcg cgg 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacctcgga taatgtctcc gcgag 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaactcgcg gagacattat ccgag 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacgataat gtctccgcga tggag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaactccat cgcggagaca ttatc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacaattgg atatccatcc cggcg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaacgccgg gatggatatc caatt 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacgatgaa ctaaccatcc atcg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaacgatgg atggttagtt catc 24
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcttactcg gataatgtct ccgcgatggg gtac 34
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccatcgcgg agacattatc cgagta 26
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcttggata atgtctccgc gatggatggg gtac 34
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccatccatc gcggagacat tatcca 26
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agctttaatt ggatatccat cccggctggg gtac 34
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccagccggg atggatatcc aattaa 26
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agcttagatg aactaaccat ccatcgcggg gtac 34
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccgcgatgg atggttagtt catcta 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccgctcgg ataatgtctc cgcga 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaactcgcgg agacattatc cgagc 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caccgataat gtctccgcga tgga 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaactccatc gcggagacat tatc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccgaattg gatatccatc ccggc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaacgccggg atggatatcc aattc 25
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caccgatgaa ctaaccatcc atcg 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaaccgatgg atggttagtt catc 24

Claims (10)

1.一种针对AHI1基因的sgRNA，所述针对AHI1基因的sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述针对AHI1基因的sgRNA，其特征在于，所述针对AHI1基因的sgRNA的编辑效率为60～62%。
3.一种针对AHI1基因的药物，包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA。
4.根据权利要求3所述针对AHI1基因的药物，其特征在于，所述针对AHI1基因的药物还包括药物载体。
5.根据权利要求4所述针对AHI1基因的药物，其特征在于，所述药物载体为聚合物载体、细胞载体。
6.一种针对AHI1基因的质粒，包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA与载体。
7.根据权利要求5所述针对AHI1基因的质粒，其特征在于，所述针对AHI1基因的质粒中，载体为pCas9质粒。
8.序列为SEQ ID NO.1的sgRNA在制备针对AHI1基因药物中的应用。
9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO.1的sgRNA的编辑效率为60～62%。
10.序列为SEQ ID NO.1的sgRNA在制备针对Joubert综合症药物中的应用。
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