CN108676767A - 一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法及其应用 - Google Patents

一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法，为：利用赤霉素促进厌氧氨氧化菌增殖。本发明还提供一种厌氧氨氧化菌的富集方法，包括：配制厌氧氨氧化菌的富集培养基；收集含有厌氧氨氧化菌菌群的污泥，去除氮素背景值，配制含有厌氧氨氧化菌的活性污泥溶液，并将其接种于所述富集培养基中；添加赤霉素，投加基质氨氮和亚硝酸盐氮，并调节体系的pH值至8.0‑8.3，得到反应体系；厌氧氨氧化反应，得到富集厌氧氨氧化菌的厌氧氨氧化反应系统。本发明中添加的赤霉素属于有机物不会被厌氧氨氧化细菌代谢利用，通过不同梯度浓度赤霉素的添加优选出较佳的赤霉素添加浓度，获得活性较高、丰度较高的厌氧氨氧化菌。相比于对照试验，当赤霉素浓度为1.0mg/L时，TN去除率提高了34.1％。

Description

一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法及其应用
技术领域
本发明属于环境工程微生物技术领域，具体涉及一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法及其应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，大量氮素排入水体，这会导致水体的富营养化。因此污水处理过程中氮素的去除受到研究者们的高度重视。传统污水生物脱氮技术不仅需要在好氧池中鼓入大量的空气来维持氧气的供给，还需要在缺氧池维持碳源的供给，消耗了大量的能源和资源。另外，传统的污水生物脱氮技术还具有工艺流程较长，产泥量大等缺点，所以低能耗物耗的脱氮技术的开发成为目前水污染治理领域的研究热点。
厌氧氨氧化现象是近年来环境科学领域的重大发现，厌氧氨氧化反应过程是利用厌氧氨氧化菌(化能自养细菌)，在厌氧环境、无需外加碳源的条件下以亚硝酸盐氮作为电子受体将氨氮氧化为氮气从而发挥脱氮作用。相比传统的活性污泥脱氮工艺，厌氧氨氧化工艺具有节省电耗、能耗、减少温室气体排放，不产生剩余污泥等优点，是一种具有可持续发展潜力的污水处理生物脱氮技术。
厌氧氨氧化菌生长速率十分缓慢，世代周期约11d，生长条件严苛，易受外界环境条件(pH、DO、基质浓度、温度、光照等)的影响，导致了当前厌氧氨氧化细菌菌源非常欠缺，制约着其工程化的应用。
厌氧氨氧化菌的富集存在诸多难点，ANAMMOX菌的细胞产率约为0.066mol C/molNH4 +，对外界环境条件的要求非常严苛，人们至今还不能通过纯培养而得到ANAMMOX菌株。另外厌氧氨氧化菌具有群聚效应，只有当ANAMMOX细菌的细胞密度达到1010个/mL以上时，才能显现出ANAMMOX活性。
为了促进厌氧氨氧化细菌的活性和生长速率的提高，目前主要通过物化方法如投加金属离子，电/磁场，超声或石墨烯来刺激厌氧氨氧化细菌的活性和生长。
赤霉素是一种植物生长激素，在农业生产中应用广泛，在植物生长发育到开花结果的不同阶段，均能发挥良好作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法。
本发明所提供的促进厌氧氨氧化菌增殖的方法，为：利用赤霉素促进厌氧氨氧化菌增殖。
上述方法中，所述赤霉素具体可为GA3。
本发明的另一目的是提供一种厌氧氨氧化菌的富集方法。
本发明所提供的厌氧氨氧化菌的富集方法，包括下述步骤：
1)配制厌氧氨氧化菌的富集培养基；
2)收集含有厌氧氨氧化菌菌群的污泥，去除氮素背景值，配制含有厌氧氨氧化菌的活性污泥溶液，并将其接种于所述富集培养基中；
3)添加赤霉素，投加基质氨氮和亚硝酸盐氮，并调节体系的pH值至8.0-8.3，得到反应体系；
4)进行厌氧氨氧化反应，得到富集厌氧氨氧化菌的厌氧氨氧化反应系统。
上述方法步骤1)中，所述富集培养基包括：KHCO3：2.25～2.85g/L；KH2PO4：0.003～0.008g/L；CaCl2·2H2O：0.6～0.9g/L；MgSO4·7H2O：0.25～0.55g/L；FeSO4·7H2O：0.015～0.025g/L；EDTA·2Na：0.015～0.018g/L和1.5mL微量元素。
其中，所述微量元素的配方为：MnCl2·4H2O：800mg/L；EDTA：1500mg/L；ZnSO4·7H2O：470mg/L；CuSO4·5H2O：285mg/L；CoCl2·6H2O：262mg/L；NaMoO4·2H2O：218mg/L；Na2SeO4：110mg/L；NiCl2·2H2O：175mg/L；H3BO4：15mg/L。
上述方法步骤2)中，所述含有厌氧氨氧化菌菌群的污泥取自实验室连续培养220d的SBR厌氧氨氧化反应器，其中厌氧氨氧化菌的基因丰度为(5.31±0.22)×109copies/g干污泥。
用磷酸盐缓冲溶液淋洗多次(具体可为三次)去除氮素背景值。
所述含有厌氧氨氧化菌的活性污泥溶液中污泥的浓度可为4500～5000mg/L。
上述方法步骤3)中，所述赤霉素具体可为GA3。
所述反应体系中，赤霉素的浓度可为0-1.5mg/L(端点0不取)，具体可为0.1-1.5mg/L、0.1-1mg/L、0.5-1mg/L或1mg/L。
所述基质氨氮和亚硝酸盐氮按质量比为1:1.3的比例投加。
投加的基质氨氮和亚硝酸盐氮的浓度分别为80～100mg/L、100～130mg/L。
在调节系统的pH值至8.0-8.3，还包括采用高纯氮气曝气以保证厌氧环境的操作，所述曝气的时间可为20～30min。
上述方法步骤4)中，所述厌氧氨氧化反应在转动下进行，所述转动的转速可为80-100rpm/min。
所述厌氧氨氧化反应的温度可为30-35℃，具体可为33±1℃，时间可为一个代时(11d)以内，具体可为9天。
所述厌氧氨氧化反应可在避光气浴锅中进行。
上述方法还可进一步包括：在进行厌氧氨氧化反应过程中，每天检测进出水水质，连续培养完成后利用分子生物学技术检测厌氧氨氧化菌的群落结构和丰度。
所述分子生物学技术具体可为：DNA提取、PCR扩增、克隆文库的构建、系统发育树分析和/或实时荧光定量PCR。
所述厌氧氨氧化反应系统中，最终厌氧氨氧化菌的丰度的数量级可达1010以上，具体可为(1.87±0.28)×1010copies/g，经过9天的培养，在合适浓度的赤霉素刺激下，厌氧氨氧化细菌丰度可增加3倍以上，具体可为3.5倍。
所述厌氧氨氧化反应系统中的优势厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadiafulgida。
本发明还提供一种污水生物脱氮方法。
所述方法中，通过添加赤霉素促进厌氧氨氧化菌的增殖和富集，从而提高污水生物脱氮的TN去除率。
本发明采用以上技术方案，其优点在于，添加的赤霉素属于有机物不会被厌氧氨氧化细菌代谢利用，通过不同梯度浓度赤霉素的添加优选出较佳的赤霉素添加浓度，获得活性较高、丰度较高的厌氧氨氧化菌。合适的赤霉素浓度可以促进厌氧氨氧化菌的活性。相比于对照试验，当赤霉素浓度为1.0mg/L时，TN去除率提高了34.1％。
本发明提供了一种利用赤霉素促进厌氧氨氧化菌活性和增殖的方法，为获得更多的厌氧氨氧化菌菌源提供一种新的可选择途径。
附图说明
图1为本发明的试验系统装置示意图。图中各数字序号分别表示如下：1.气浴锅2.摇床转速控制器3.温度控制器4.取样口5.pH在线测定仪6.反应器(不添加赤霉素和添加不同浓度的赤霉素)。
图2表示初始污泥和培养9天后含不同赤霉素浓度的反应器中厌氧氨氧化菌基因拷贝数的对数。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用图1所示的试验系统装置。
实施例、
1、配制厌氧氨氧化菌的富集培养基于5个有效体积为500mL血清瓶反应器。
2、收集含有厌氧氨氧化菌菌群的活性污泥，该污泥取自实验室连续培养220d的SBR厌氧氨氧化反应器，厌氧氨氧化细菌的基因丰度为(5.31±0.22)×109copies/g干污泥。经磷酸盐缓冲液3次淋洗后配制浓度为5000mg/L的污泥。分别取200mL污泥接种到5个血清瓶中，补充水至500mL，最终污泥浓度为5000mg/L。
3、试验以人工配水为基础用水，具体配方如下：KHCO3：2.5g/L；KH2PO4：0.005g/L；CaCl2·2H2O：0.75g/L；MgSO4·7H2O：0.36g/L；FeSO4·7H2O：0.018g/L；EDTA·2Na：0.018g/L和1.5mL微量元素。
4、分别向反应器中添加赤霉素，使5个反应器中的赤霉素浓度依次为0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L。
5、按质量比接近1:1.3的比例投加氨氮和亚硝酸盐氮，浓度分别为85mg/L和110mg/L。将所述反应器的pH调节至8.0-8.3，高纯氮气曝气20～30min。
6、将所述反应器置于转速为80-100rpm/min，温度为35±1℃的避光气浴锅中进行厌氧氨氧化反应。
7、对反应器进行连续监测每天的进出水水质。连续培养9天后，对照组的氨氮和亚硝酸盐氮的浓度分别降到30mg/L和48mg/L，硝酸盐浓度增加了12mg/L，TN去除率为52％。添加赤霉素为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L的TN去除率分别为61.2％，72.8％，86.1％，75.4％。
合适的赤霉素浓度可以促进厌氧氨氧化菌的活性。相比于对照试验，当赤霉素浓度为1.0mg/L时，TN去除率提高了34.1％。
连续培养9天后，通过DNA的提取、PCR扩增、克隆文库构建，对厌氧氨氧化菌的进行系统发育树分析其菌群结构，在添加赤霉素的厌氧氨氧化反应器中的厌氧氨氧化菌的优势菌为Candidatus Brocadia fulgida。
因此，赤霉素的添加可以使厌氧氨氧化菌的菌群结构更加单一，CandidatusBrocadia anammoxidans从系统中淘汰。
通过实时荧光定量PCR检测，初始污泥的厌氧氨氧化菌的丰度为(5.31±0.22)×109copies/g干污泥。连续培养9天后，对照组的厌氧氨氧化菌的丰度为(6.8±0.35)×109copies/g干污泥，增长了21.8％。添加赤霉素为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L的厌氧氨氧化菌的丰度分别为了(8.9±0.43)×109copies/g干污泥，(1.26±0.31)×1010copies/g干污泥，(1.87±0.28)×1010copies/g干污泥和(7.32±0.17)×109copies/g干污泥。如图2所示。
赤霉素的添加可以促进厌氧氨氧化菌的增殖，经过9天的培养，当赤霉素浓度为1.0mg/L时，厌氧氨氧化细菌丰度增加了约3.5倍。
利用赤霉素促进厌氧氨氧化细菌增殖时，最佳的添加浓度为1mg/L，过高浓度赤霉素并不能对厌氧氨氧化菌的活性和增殖带来更大的促进作用。

Claims (10)

1.一种促进厌氧氨氧化菌增殖的方法，为：利用赤霉素促进厌氧氨氧化菌增殖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述赤霉素为GA3。
3.一种厌氧氨氧化菌的富集方法，包括下述步骤：
1)配制厌氧氨氧化菌的富集培养基；
2)收集含有厌氧氨氧化菌菌群的污泥，去除氮素背景值，配制含有厌氧氨氧化菌的活性污泥溶液，并将其接种于所述富集培养基中；
3)添加赤霉素，投加基质氨氮和亚硝酸盐氮，并调节体系的pH值至8.0-8.3，得到反应体系；
4)进行厌氧氨氧化反应，得到富集厌氧氨氧化菌的厌氧氨氧化反应系统。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法步骤1)中，所述富集培养基包括：KHCO3：2.25～2.85g/L；KH2PO4：0.003～0.008g/L；CaCl2·2H2O：0.6～0.9g/L；MgSO4·7H2O：0.25～0.55g/L；FeSO4·7H2O：0.015～0.025g/L；EDTA·2Na：0.015～0.018g/L和1.5mL微量元素；
其中，所述微量元素的配方为：MnCl2·4H2O：800mg/L；EDTA：1500mg/L；ZnSO4·7H2O：470mg/L；CuSO4·5H2O：285mg/L；CoCl2·6H2O：262mg/L；NaMoO4·2H2O：218mg/L；Na2SeO4：110mg/L；NiCl2·2H2O：175mg/L；H3BO4：15mg/L。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述含有厌氧氨氧化菌菌群的污泥中厌氧氨氧化菌的基因丰度为(5.31±0.22)×109copies/g干污泥；
所述含有厌氧氨氧化菌的活性污泥溶液中污泥的浓度为4500～5000mg/L。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述赤霉素为GA3；
所述反应体系中，赤霉素的浓度为0-1.5mg/L。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述基质氨氮和亚硝酸盐氮按质量比为1：1.3的比例投加；
投加的基质氨氮和亚硝酸盐氮的浓度分别为80～100mg/L、100～130mg/L；
在调节系统的pH值至8.0-8.3，还包括采用高纯氮气曝气以保证厌氧环境的操作，所述曝气的时间为20～30min。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述厌氧氨氧化反应在转动下进行，所述转动的转速为80-100rpm/min；
所述厌氧氨氧化反应的温度为30-35℃，时间为一个代时以内。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述厌氧氨氧化反应系统中，厌氧氨氧化菌的丰度的数量级可达1010，系统运行9天，厌氧氨氧化细菌丰度增加了约3.5倍；
所述厌氧氨氧化反应系统中的优势厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadia fulgida。
10.一种污水生物脱氮方法，为：通过添加赤霉素促进厌氧氨氧化菌的增殖和富集，从而提高污水生物脱氮的TN去除率。
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