CN108676097B

CN108676097B - 一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN108676097B
Application number: CN201810511274.5A
Authority: CN
Inventors: 王全颖; 杨广孝
Original assignee: Beijing Peptide And Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Peptide And Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: WO2019223740A1; CN108676097A

Abstract

本发明公开了一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白及其应用，涉及生物技术领域。本发明公开的靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白，其包括：用于靶向目的肿瘤的iRGD肽和用于杀伤目的肿瘤的特异性肽或蛋白，iRGD肽连接至特异性肽或蛋白的羧基端。该嵌合肽或嵌合蛋白可以靶向目的肿瘤，特异性杀伤肿瘤细胞，对正常的二倍体细胞安全，实现预防或治疗肿瘤的目的，为治疗肿瘤提供了一种全新的治疗思路。

Description

一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白及其应用。

背景技术

肿瘤是人类健康的大问题，因此也是近代生物学和医学研究的热点问题。虽然每年的人力和物力投入巨大，但是收到成果远不能令人满意。肿瘤的发病原因不清，致病机制不明确。但近年来肿瘤的生物学研究和医学工作者一致的看法是免疫学出现了问题，因此都认为肿瘤的免疫学研究能够给肿瘤的诊断，治疗和预防带来希望。从理论上看免疫活性细胞，淋巴球能够识别肿瘤，攻击和驱逐和消灭肿瘤，同时淋巴细胞也会记忆肿瘤标志，迅速启动抗肿瘤免疫，不允许肿瘤复发和转移。但是研究也发现肿瘤组织建立了免疫抑制内环境，抑制和减低和取消了淋巴细胞识别肿瘤，攻击肿瘤和消灭肿瘤的能力。肿瘤组织的抑制性淋巴细胞和高表达免疫抑制因子，如TGF-beta，IL6和IL10，否定了肿瘤的免疫清除作用，促进了快速生长和转移。如何处理肿瘤的免疫状态，不同实验室走各自选择路线。激动免疫攻击肿瘤使用疫苗激活免疫反应，使用Th1细胞因子IL2，IL12，IL15和TNFa，IFN-r，GM-CSF来刺激淋巴细胞，建立了LIK和DC-CIK等等细胞免疫治疗，临床使用结果不令人满意。解除免疫抑制因子和抑制性细胞Treg和MDSCs依赖于化学性抗癌药，因此目前还没有特异对抗抑制性T细胞方法。PD-1和PD-1L是近年发现淋巴细胞免予抑制攻击肿瘤细胞的重要机制，FDA已经批准了针对PD-1和PD-1L双抗体治疗实体瘤。临床使用结果表明其有效率仅为接受病人的15％左右,而且停药后复发率很高，每天病人接受抗体剂量在150mg费用达到几万元，完成一个疗程用药需要150万元以上，是普通病人和家属承担不起的。而且近来发现PD1和PD1 L不是肿瘤特有细胞生物现象，高度抑制这一生物学过程，能够导致自身免疫疾病发生。

肿瘤细胞免疫治疗学近来最大进展是研究人员建立的CAR-T(嵌合抗原受体)T细胞治疗技术。技术的关键是找到癌细胞本身特有的抗原和高亲和该抗原的抗体，使用该抗体重链和轻链上可变区，然后利用基因工程技术将T细胞改造成CAR-T细胞，变成一个带着精确导航系统，可以针对癌细胞发动自杀性攻击的细胞。科学家就是对这个抗体进行改造，使得它可以识别癌细胞的抗原，嵌合到T细胞上从而发挥作用。链接到T细胞上，完成上述抗体的设计后，下一步是把这个抗体嵌合到T细体外大量培养这种CAR-T细胞，需要培养的细胞会是几十亿到上百亿量级。将这些能发动自杀性攻击癌细胞的CAR-T细胞输入患者体内进行治疗。针对B细胞未分化CD19抗原的CAT-T细胞，对B淋巴瘤和淋巴细胞白血病的实验应用中证实是有效的。体外大量培养这种CAR-T细胞，需要培养的细胞会是几十亿到上百亿量级。将这些能发动自杀性攻击癌细胞的CAR-T细胞输入患者体内进行治疗。中国人民解放军总医院(301医院)，使得中国研发团队跻身于全球CAR-T细胞技术转化医学研究领域的前列。已公布的关于CAR-T CD19针对急性淋巴细胞白血病，CAR-T CD20针对弥漫大B细胞淋巴瘤以及CAR-T CD30治疗霍奇金淋巴瘤的三项I期临床数据，初步显示了301医院CAR-T细胞靶向肿瘤免疫疗法相对安全、可行和有效。

CAR T疗法最常见的副作用有三个：细胞因子风暴、脑病、和B细胞发育不全(意思就是患者体内的B细胞是不能长成正常而有功能的淋巴B细胞)，那么这些副作用发生率有多高呢？严重的细胞因子风暴出现概率在27-53％，脑病发生率为25-47％，B细胞发育不全在接受了淋巴清除预处理和CAR T治疗的患者中则是86-100％发生率。这些副作用的症状是什么呢？出现细胞因子风暴时患者出现发热、心动过速、低血压、毛细血管渗透综合症、以及呼吸系统症状。出现脑病时的表现是，意识模糊，不会说话，抽搐。B细胞发育不良的患者则会出现反复感染，因为体内免疫力差不能攻击细菌病毒感染，给病人带来终生需要治疗的负担。但采用CAR-T治疗也存在诸多问题。

例如：1.费用高昂：由于这种免疫疗法需要根据个体的差异来进行“私人订制”，因此，成本是非常高的。

2.适用范围较窄：这种疗法目前主要是应用于白血病、淋巴瘤、黑色素瘤尤其是在白血病的患者改善中作用明显，甚至对于无药可治的晚期白血病和淋巴瘤都效果很好。但是我们最常见的癌症是肺癌、肝癌这种实体瘤还缺乏证实的特异的肿瘤抗原的CAR-T疗法布可能的3.存在巨大风险：大部分跟免疫治疗有关的基本上都还处在实验阶段，跟前几篇说的免疫疗法相比，CAR-T思路的确挺好，但是操作起来相当麻烦，光是找到患者特异的癌症抗原而不损伤正常细胞就很麻烦了，更不用说接下来一些列的嵌合抗体、免疫细胞体外增值、癌细胞免疫逃避等等过程，需要非常强的技术实力。此外，输入患者的CAR-T细胞需要是患者本身的细胞，否则会像器官移植一样，产生排异反应等。因此，想法虽好，但CAR-T疗法具体能不能大规模应用，成为一种常规的治疗手段，还有很长的路要走。因此CAR-T研究还是处于学术阶段，不能满足临床医生和病人治疗肿瘤要求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白。该嵌合肽或嵌合蛋白可以靶向目的肿瘤，特异性杀伤肿瘤细胞，实现预防或治疗肿瘤的目的，为治疗肿瘤提供了一种全新的治疗思路。

本发明的另一目的在于提供一种核酸片段。该核酸片段可编码上述靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种嵌合表达盒。其含有上述的核酸片段，可表达上述靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种载体。该载体用于转染宿主细胞，表达上述靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种病毒。该病毒可用于体内体内直接基因治疗。

本发明的另一目的在于提供一种上述核酸片段、嵌合表达盒、载体、以及病毒的应用。

本发明的另一目的在于提供一种特异无毒副作用的现代恶性实体肿瘤治疗方法。

本发明是这样实现的：

一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白，其包括：用于靶向目的肿瘤的iRGD肽和用于杀伤所述目的肿瘤的特异性肽或蛋白，所述iRGD肽连接至所述特异性肽或蛋白的羧基端。

iRGD肽是一种环形膜渗透肽，其线性氨基酸序列为：CRGDRGPDC(SEQ ID NO.8)，连接有该iRGD肽的特异性肽或蛋白可以增加其靶向作用，使得特异性肽或蛋白能够特异性杀伤目的肿瘤或肿瘤细胞或肿瘤组织。

当该嵌合肽或嵌合蛋白到达肿瘤细胞时，肿瘤细胞分泌的金属蛋白酶在K-R或D-E肽键切开该环形膜渗透肽，这样即可实现iRGD的肿瘤靶向能力和膜渗透双向作用。而且正常的二倍体细胞，缺乏这种金属蛋白酶，具有环肽的重组蛋白或肽，对正常细胞缺乏膜渗透作用，提高了体内半衰期。

杀伤目的肿瘤的特异性肽或蛋白的类别可以根据肿瘤类别进行选择，其只要对肿瘤细胞具有杀伤作用即可。

其中，术语“杀伤”意指：特异性肽或蛋白对肿瘤细胞具有促进其凋亡、抑制增殖方面的作用和对于肿瘤细胞膜的打孔破坏或对细胞线粒体溶解直接使其坏死的二种作用总和。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特异性肽或蛋白选自SEQ ID NO.1-7所示的肽或蛋白中的任意一种。

SEQ ID NO.1所示的为P53氨基端15肽(以下可简称为N-15肽)。

SEQ ID NO.2所示的为P53羧基端22肽(以下可简称为C-22肽)。

SEQ ID NO.3所示的为Apoptin蛋白。

SEQ ID NO.4所示的为ORF4蛋白。

SEQ ID NO.5所示的为Sphervin肽。

SEQ ID NO.6所示的为par-4SAC肽。

SEQ ID NO.7所示的为P73激活肽。

P53作为细胞的转录子在组织发生，凋亡和监督细胞的突变中有着重要细胞生物学作用。超过50％的肿瘤具有P53基因突变，进而使其失去抗肿瘤发生作用。P53相关肽例如其氨基端15肽(SEQ ID NO.1)、羧基端22肽(SEQ ID NO.2)以及编码区P73激活肽(SEQ IDNO.7)等多个肽段(P53和P63，P73属于同一个转录因子家族，有相同癌症抑制机能，P53是其中最活跃因子，但也是最常发生突变，缺失和细胞定位和代谢异常的因子。但是P73和P53不同，是因为P73受到iASPP抑制在通常条件下和细胞恶变中不表现转录机能。在P53氨基酸序列中存在2段肽序列，长度为37aa能够和iASPP结合解除P73的转录活性，因此能够在P53缺欠肿瘤细胞中通过表达37aa激活肽来使肿瘤细胞凋亡)具备杀死肿瘤和诱发凋亡作用。

由于正常二倍体细胞没有P53突变，P53氨基端15肽和P53羧基端22肽无法对正常组织进行杀伤，其对正常组织是无毒无害的。这是在肿瘤治疗中利用P53氨基端15肽和P53羧基端22肽进行的特异杀肿瘤细胞理论依据。

但一些病人的组化学病理和P53基因检测没有异常，这些病人的肿瘤发生和发展可能是非P53依赖的。这种情况下，可采用非P53机制的肿瘤抑制蛋白或肽，例如小鸡贫血病毒的V3P蛋白Apoptin(SEQ ID NO.3所示)、腺病毒E4早期启动的ORF4蛋白(SEQ ID NO.4)、抑制生存素(survivin)的Sphervin肽(SEQ ID NO.5)、前列腺抗癌基因Par-4 SAC肽(SEQID NO.6)等。

Apoptin蛋白(SEQ ID NO.3)具有特异诱导转化细胞和肿瘤细胞的凋亡和坏死能力，不损坏正常人的二倍体细胞。Apoptin的治疗肿瘤作用同它的羧基端具有很强肿瘤细胞核定位信号和结合到细胞的染色质的DNA链相关。本发明实施例构建了分泌表达Apoptin-iRGD嵌合肽的scAAV病毒，细胞学实验和动物实验显示该分泌表达Apoptin-iRGD嵌合肽的病毒治疗肿瘤的潜在价值。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该嵌合肽或嵌合蛋白是由Apoptin蛋白(SEQ ID NO.3)和iRGD肽构成的嵌合肽或嵌合蛋白。

ORF4蛋白(SEQ ID NO.4)指腺病毒早期启动子控制的第四编码框架蛋白，ORF4蛋白和PP2A和Src结合导致了肿瘤细胞的凋亡。本发明实施例构建了分泌表达ORF4-iRGD嵌合肽的scAAV病毒，细胞学实验和动物实验显示该ORF4-iRGD嵌合肽治疗肿瘤的潜在价值。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该嵌合肽或嵌合蛋白是由ORF4蛋白(SEQID NO.4)和iRGD肽构成的嵌合肽或嵌合蛋白。

Sphervin肽(SEQ ID NO.5)是survivin的抑制物，它是通过肿瘤细胞高表达survivin，抑制了肿瘤细胞的凋亡。survivin是一个生命半衰期很短的细胞内抗凋亡蛋白，它是通过泛素化酶作用进入蛋白酶体降解过程。肿瘤细胞高表达热休克蛋白(HSP-90)，HSP-90和survivin结合阻断了它的泛素化和降解。因此Spherin肽能够阻断survivin和HSP-90结合，加速了survivin的降解，促进肿瘤的凋亡。本发明实施例构建了分泌表达Sphervin-iRGD嵌合肽的scAAV病毒，细胞和荷瘤动物实验观察到了理想效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该嵌合肽或嵌合蛋白是由Sphervin肽(SEQ ID NO.5)和iRGD肽构成的嵌合肽或嵌合蛋白。

par-4SAC肽(SEQ ID NO.6)是前列腺反应性凋亡基因的核心区结构域编码肽。对激素敏感的人和动物，患前列腺癌之后做去势后可以产生前列腺癌的自发凋亡。这一过程是前列腺反应性凋亡基因表达的结果。Par-4蛋白的结构和机能相关关系研究提示该蛋白质的核心区(SAC)有类似机能而且不受器官特异性限制。也就表明前列腺反应性凋亡蛋白SAC可以使不同器官肿瘤凋亡，而且不伤害正常细胞。具有临床治疗肿瘤的前景，本发明实施例克隆了编码Par-4SAC-iRGD嵌合肽的scAAV。在细胞、荷瘤动物、和少许人类晚期癌症病人看到满意效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该嵌合肽或嵌合蛋白是由par-4SAC肽(SEQ ID NO.6)和iRGD肽构成的嵌合肽或嵌合蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该嵌合肽或嵌合蛋白在所述特异性肽或蛋白与iRGD肽之间还具有连接肽。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，连接肽的氨基酸序列为GG或GS。

以GG或GS作为连接肽，可以使得嵌合肽或嵌合蛋白的稳定性更高，且确保各部分肽或蛋白能够发挥正常的生理活性。

一种核酸片段，其编码如上任一项所述的靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白。

一种嵌合表达盒，其含有如上所述的核酸片段。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合表达盒多种如上所述的核酸片段。需要说明的是，通过在表达盒中插入多种核酸片段，可以使得该嵌合表达盒可表达出多种类型的嵌合肽或嵌合蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述嵌合表达盒包括：编码信号肽的信号肽核酸序列；所述信号肽核酸序列位于所述核酸片段上游。

信号肽对于目的蛋白的分泌表达也是必需的，如果表达产物的初生蛋白的氨基酸长度超过60-70aa，通常使用长度20aa左右的信号肽，如分泌IgG的信号肽。如果翻译生成的重组前肽序列长度在60aa以下，必需使用长度大于40aa信号肽，初始生成的氨基酸序列短于60aa，核糖体的蛋白酶系统会依氨基酸的长度，不是氨基酸序列将其消化分解。

广义的信号肽是包括细胞结构蛋白质的细胞内定位信号，如核定位信号、线粒体定位信号、膜的锚定位信号等等，因此一些作者把它称为合成蛋白质的邮政编码。对于细胞合成的功能蛋白，必须分泌到细胞外间隙，通过细胞自分泌、间分泌和内分泌和靶细胞的膜受体实现生物效应。对于治疗性重组病毒必须通过感染细胞，分泌效应肽和蛋白，分泌表达的信号肽是非常重要的。

通过信号肽核酸序列的引入可以确保嵌合肽或嵌合蛋白不被分解，顺利分泌到胞外。

当然，具体选用的信号肽可以根据实际情况确定。例如80aa的NT4信号肽，完成短肽分泌表达。对于分泌表达肽链长度大于100aa前蛋白质可以使用IgG信号肽，长度通常在20-30aa之间。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，NT4信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，编码NT4信号肽的信号肽核酸序列如SEQID NO.25所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，当核酸片段的数量为多个时，所述嵌合表达盒中插入有用于控制上述特异性肽或蛋白的表达效率或比率的拼接子序列，相邻两个核酸片段之间插入有拼接子序列。

为了增强转录子的稳定性，需要在表达盒中插入拼接子序列，拼接子的插入有利于表达出稳定的mRNA。初转录生成的mRNA，拼接子序列都会被选择性切割掉，然后拼接生成成熟mRNA。

在相连的两个表达目的肽(两个目的肽可以相同，也可以不相同)的核酸序列之间插入拼接序列，它具有内含子机能，含有受体点和供体点序列，可同时控制上下游表达转录和翻译表达比率。

拼接子的序列选择需要根据上下游所述表达的肽或蛋白的比率来确定。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，拼接子的序列选自SEQ ID NO.10-20中的一种。

下表1中给出了不同拼接子序列所控制的下游蛋白或肽与上游蛋白或肽的比率。

表1拼接子序列及其控制的上下游蛋白或肽的表达比率

进一步地，在本发明的一些实施方案中，多种核酸片段的种类为三种，分别是第一核酸片段、第二核酸片段以及第三核酸片段，其分别表达由N-15肽和iRGD肽融合构成的第一嵌合肽、由P73激活肽和iRGD肽融合构成的第二嵌合肽、由C-22肽和iRGD肽融合构成的第三嵌合肽。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述嵌合表达盒中，第一核酸片段下游和第二核酸片段上游之间插入有第一拼接子序列，第二核酸片段和第三核酸片段之间插入有第二拼接子序列。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一拼接子序列为SEQ ID NO.19，第二拼接子序列为SEQ ID NO.20。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在信号肽核酸序列的下游和核酸片段上游插入有人工内含子序列。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述人工内含子序列如SEQ ID NO.26所示。

在表达盒中使用人工内含子区别于天然内含子，是因为天然内含子核酸序列过长，人工内含子其结构和机能和天然内含子相同，但是其序列长度较短，易于剪切，生产成熟mRNA。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该表达盒包括依次连接如下表达元件：

编码NT4信号肽的核酸序列、人工内含子、编码第一嵌合肽的核酸序列、第一拼接子、编码第二嵌合肽的核酸序列、第二拼接子以及编码第三嵌合肽的核酸序列。

该表达盒的碱基序列如SEQ ID NO.27所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述嵌合表达盒在所述核酸片段的上游和/或下游插入有TRX部分核酸序列，所述TRX部分核酸序列编码硫氧化蛋白部分序列。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，硫氧化蛋白部分序列为TRX氨基端序列或TRX羧基端序列。

TRX氨基端序列如SEQ ID NO.21所示，TRX羧基端序列如SEQ ID NO.22所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，编码TRX氨基端序列的TRX部分核酸序列如SEQ ID NO.23所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，编码TRX羧基端序列的TRX部分核酸序列如SEQ ID NO.24所示。

在嵌合肽或嵌合蛋白的氨基端和/或羧基端加入TRX序列可以增强分泌蛋白在细胞内还原环境进入细胞外氧化环境的二硫键形成，确保分泌肽和蛋白分子高级高级结构和生物功能。

TRX表示硫氧化蛋白。

一种载体，其含有如上任一项所述的嵌合表达盒。

含有上述载体的病毒。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述病毒为双链腺相关病毒(scAAV)。

如上所述的靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白、核酸片段、嵌合表达盒、载体或病毒在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

一种特异无毒副作用的现代恶性实体肿瘤治疗方法，其包括：将含有上述载体的病毒转染需要肿瘤治疗的主体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述主体为人或非人动物。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白，其包括：用于靶向目的肿瘤的iRGD肽和用于杀伤目的肿瘤的特异性肽或蛋白，iRGD肽连接至特异性肽或蛋白的羧基端。该嵌合肽或嵌合蛋白可以靶向目的肿瘤，特异性杀伤肿瘤细胞，对正常的二倍体细胞安全，实现预防或治疗肿瘤的目的，为治疗肿瘤提供了一种全新的治疗思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的P53相关肽scAAV的嵌合表达盒的结构示意图；

图2为本发明实施例2中的非P53相关肽scAAV的嵌合表达盒的结构示意图；

图3为本发明实施例中的所用pscAAV载体的结构示意图；

图4为本发明实验例1中的Hela细胞感染P53相关肽scAAV的24,48和72小时后倒置显微镜下的细胞形态；

图5A-D为本发明实验例2中的Hela细胞感染P53相关肽scAAV的0，24,48和72小时后的流式细胞计检测结果；

图6为本发明实验例3中的Hela细胞感染P53相关肽scAAV的免疫组化染色结果；

图7为本发明实验例4中的ICR小鼠腹腔接种S180肿瘤细胞和未接种后的腹水腹型的观察结果；

图8为本发明实验例4中的腹水瘤形成的小鼠腹腔粘膜的解剖图；

图9为本发明实验例5中的ICR小鼠接种S180腹水瘤细胞形成腹水瘤后，于腹腔内注射P53相关肽scAAV一周后的体型观察结果；

图10为本发明实验例6中的ICR小鼠皮下接种H22肝癌细胞未经治疗6周后局部肿瘤生长情况；

图11为本发明实验例6中的ICR小鼠皮下接种H22肝癌细胞成瘤局部注射P53相关肽scAAV后的观察结果；

图12为本发明实验例6中的ICR小鼠皮下接种H22肝癌细胞成瘤局部注射非P53相关肽scAAV后的观察结果；

图13为本发明实验例7中的接种S180腹水瘤的ICR小鼠，腹腔注射分泌P53相关肽scAAV，肽和非P53相关肽scAAV，和未经治疗的腹水瘤小鼠(对照组)的在12周内的生存小鼠数和生存时间；

图14为本发明实验例8中的ICR小鼠皮下接种H22小鼠肝癌细胞成瘤后，局部注射P53相关肽scAAV和非P53相关肽scAAV，和未经治疗的荷瘤小鼠的在20周内的生存小鼠数和生存时间的比较；

图15为本发明实验例9中的注射P53相关肽scAAV的皮下肿瘤采用ABC法做免疫检测的结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1构建嵌合表达盒

本实施例提供的嵌合表达盒的结构如图1所示(图中箭头表示转录方向)，其上游至下游依次包括如下表达元件：

其中，第一嵌合肽为N-15肽和iRGD肽融合的融合肽，第二嵌合肽为P73激活肽和iRGD肽融合的融合肽，第三嵌合肽为C-22肽和iRGD肽融合构成的第三嵌合肽。

NT4信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码该NT4信号肽的核酸序列如SEQID NO.25所示。

人工内含子的碱基序列如SEQ ID NO.26所示。

第一嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，由N-15肽通过GS连接肽与iRGD肽融合。

第一拼接子的碱基序列如SEQ ID NO.19所示。

第二嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，由P73激活肽通过GS连接肽与iRGD肽融合。

第二拼接子的碱基序列如SEQ ID NO.20所示。

第三嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，由C-22肽通过GS连接肽与iRGD肽融合。

本实施例提供的表达盒的碱基序列如SEQ ID NO.27所示。其中，在NT4信号肽与人工内含子之间加入的“CG”两个碱基是为了内肽酶的识别和对框。

2构建载体

通过化学方法合成如上的嵌合表达盒，两端引入EcoR I和BamH I酶切位点，将该嵌合表达盒插入至pscAAV载体(其结构如图3所示，删除ITR的D区发生了△ITR突变的)，得到表达载体，命名为P53相关肽scAAV。

当将pscAAV转染细胞后，可表达出三种嵌合肽，分别是由N-15肽和iRGD肽融合构成的第一嵌合肽、由P73激活肽和iRGD肽融合构成的第二嵌合肽、由C-22肽和iRGD肽融合构成的第三嵌合肽。通过本实施例构建的表达盒结构这三种嵌合肽被表达并被分别同时可靶向肿瘤细胞，并发挥“杀伤”肿瘤细胞或抑制其增殖的作用，进行起到治疗肿瘤的目的。

使用单一表达盒，一个启动子Promoter来表达两个以上的蛋白或肽，是近年来重组表达重要进展，早期在一个重组体中使用两个以上Promoter驱动各自表达，增加重组体核酸容量，而且不同的Promote来自不同生物体，如CMV早期启动子和SV40启动子的启动能力不同，表达蛋白质和肽的量和比率是很难控制的，后来使用核糖体进入位点IRES驱动上下游蛋白或肽表达，存在上下游产物比率不可控制问题，同时IRES由500多个bp核酸组成，对于重组AAV微小病毒，常常超过了病毒包装容量。使用豬瘟病毒FA2裂解子在一个promoter下表达两个肽或蛋白质早有报告，但是需要在上下游表达产物间加装FA2识别序列，它才能在上下游翻译表达中生成具有缺壳(氨基酸链有不连续Nike)的蛋白质或肽，而且上下游产物都添加非需要氨基酸序列，影响表达肽的生物活性。不适合短小生物肽分泌表达中应用。因此本专利使用重组scAAV分泌表达技术，需要注意重组载体中不可缺少的AAV两侧ITR，发夹序列ΔITR，CMV promoter，MCS(多克隆位点)，SV40 Poly A，为了做短肽分泌表达加装长信号肽和引导肽序列，使可以插入载体能够成功包装有感染能力病毒核酸容量在1000bp左右，因此为了使用scAAV做基因治疗，必须有严密的重组设计。

本发明实施例使用人工内含子和mRNA的选择性切割和拼接技术，生成成熟mRNA表达，实现了一个表达盒3种生物短肽治疗肿瘤。在我们早期工作中使用了3种标签肽，6XHis，C-Myc,和Flage标签做标志，用商业提供抗体检测一个表达盒表达3种短肽的可行性。证实是完全可行性的，但是表达过度数量短肽，容易产生表达量不足和拼接错误。因此本发明实施例使用了一个scAAV含有一个表达盒表达3种抗肿瘤肽，在我们课题组称它为一弹3星技术。

实施例2

本实施例提供的嵌合表达盒的结构如图2所示，其上游至下游依次包括如下表达元件：

编码NT4信号肽的核酸序列、人工内含子、编码第四嵌合蛋白的核酸序列、第一拼接子、编码第五嵌合肽的核酸序列、第二拼接子、编码第六嵌合肽的核酸序列。

第四嵌合蛋白为Apoptin蛋白(SEQ ID NO.3所示)通过GS连接肽与iRGD肽融合的融合蛋白；对应的编码序列如SEQ ID NO.31所示。

第五嵌合肽为par-4SAC肽(SEQ ID NO.6所示)通过GS连接肽与iRGD肽融合的融合肽，对应的编码序列如SEQ ID NO.32所示。

第六嵌合肽为TRX氨基端(SEQ ID NO.21)、Sphervin肽(SEQ ID NO.5)、TRX羧基端(SEQ ID NO.22)通过GS连接肽与iRGD肽融合的融合肽，对应的编码序列如SEQ ID NO.33所示。

其余表达元件序列与实施例1基本相同。

本实施例提供的嵌合表达盒的碱基序列如SEQ ID NO.34所示。

2构建载体

通过化学方法合成本实施例的嵌合表达盒的核酸序列，在5～端加入EcoR Im酶切点和3～端加入BamH I酶切点便于将表达盒插入到pscAAV载体，得到表达载体，命名为非P53相关肽scAAV。

实验例1

图4显示Hela细胞感染P53相关肽scAAV的24,48和72小时后倒置显微镜下的细胞形态，可以见到24小时后细胞开始出现球形脱壁，48小时显示细胞圆形固缩和凋亡，72小时后细胞的坏死和溶解。

实验例2

图5A-D显示Hela细胞感染P53相关肽scAAV的24,48和72小时后的流式细胞计检测结果，可见随着感染重组病毒时间延长，出现的凋亡细胞不断增加，72小时后S期细胞减少和消失，G1期细胞生长停滞。

实验例3

图6显示了Hela细胞感染P53相关肽scAAV的免疫组化染色结果，图6-A和图6-B是未感染P53相关肽scAAV的细胞，使用P53的C22和N15抗体均为阴性。图6-C和图6-D是感染P53相关肽scAAV的细胞均为阳性。图6-C是P53的N15肽的表达，为胞浆均匀着色。图6-D是P53的肽表达表现以核周为主着色。

实验例4

图7显示ICR小鼠腹腔接种S180肿瘤细胞(3×10⁴个细胞/只)后20天腹水腹型的观察结果，注射S180肿瘤细胞的小鼠体重达到41克，腹腔内大量腹水(图7-A)；正常腹腔未接种肿瘤细胞的小鼠的腹型，体重仅有21克(图7-B)，；腹水瘤形成的小鼠排出腹水后可见腹腔粘膜上大量种植瘤，如图8-A所示，腹腔肿瘤的病理检测结果如图8-B所示；

实验例5

图9显示ICR小鼠接种S180腹水瘤细胞形成腹水瘤后，于腹腔内注射P53相关肽scAAV一周后的体型观察结果(图中4只小鼠代表4个重复)，注射量3×10⁵pfu/只；可见一周后腹水消失，继续饲养60天未见肿瘤复发。显示了重组病毒P53相关肽的scAAV有效的治疗作用。

实验例6

图10显示ICR小鼠皮下接种H22肝癌细胞，未经治疗6周后局部肿瘤生长情况，虽然小鼠品系，周龄和接种相同数量肿瘤细胞相同，但是每只小鼠的肿瘤大小，肿瘤生长行为差异很大。

图11显示了ICR小鼠皮下接种H22肝癌细胞成瘤局部注射P53相关肽scAAV后的观察结果(图中显示的2只接受注射的小鼠)，注射量3×10⁵pfu/只、次数3次，注射6周小鼠局部瘤结节消失，

图12显示了ICR小鼠皮下接种H22肝癌细胞成瘤局部注射非P53相关肽scAAV后的观察结果(图中显示的2只接受注射的小鼠)，注射量3×10⁵pfu/只、次数3次，注射6周后小鼠局部瘤结节消失。

实验例7

图13显示接种S180腹水瘤的ICR小鼠，腹腔注射分泌P53相关肽scAAV，肽和非P53相关肽scAAV，和未经治疗的腹水瘤小鼠(对照组)的在12周内的生存小鼠数和生存时间。注射P53相关肽scAAV小鼠20只，有小鼠19只存活，注射非P53相关肽scAAV的小鼠20只，有小鼠18只存活，治疗组小鼠(P53相关肽scAAV和非P53相关肽scAAV)生存期超过12周时无腹水瘤复发，小鼠进食和活动如常。对照组小鼠从第3周开始死亡，第7周已经全部死亡。

实验例8

图14显示ICR小鼠皮下接种H22小鼠肝癌细胞成瘤后，局部注射P53相关肽scAAV和非P53相关肽scAAV，和未经治疗的荷瘤小鼠的在20周内的生存小鼠数和生存时间比较。局部注射P53相关肽scAAV，死亡2只，有18只20周依然存活。局部非P53相关肽scAAV，死亡4只，有16只20周依然存活。局部仅注射报告病毒scAAV和不做处理的小鼠16只死亡，但依然有4只小鼠带瘤生存。

实验例9

图15显示注射P53相关肽scAAV的皮下肿瘤96小时后使用抗P53抗体做一抗，ABC法做免疫检测的结果，可见，不仅在X100显微镜下见到P53相关肽表达，而且在高倍镜X200和X400看到感染病毒肿瘤细胞的凋亡和坏死形态。

综上，使用本发明提供的重组病毒(P53相关肽scAAV或非P53相关肽scAAV)治疗实体瘤的目的是基于转导了治疗重组病毒的病人自身淋巴细胞，它在MHC或HLA和病人自身细胞MHC同源，不会出现移植物和宿主间排斥反应，而且淋巴细胞具有富聚于瘤灶趋化能力，更重要的是基因治疗的重组病毒WHO要求必需是非复制病毒性的以确保基因治疗安全性。虽然目前有条件性复制病毒用于肿瘤治疗报告，但是其安全性依然受到质疑。但是目前的包装和生产无法达到治疗肿瘤要求的病毒数，MOI(每一个肿瘤细胞被杀死需要1000pfu,一例肿瘤病人体内瘤负荷在10^15-18瘤细胞，理论要求需要10^18-22Pfu重组病毒生产技术是难有可能的，也是目前基因治疗肿瘤疗效低的主要原因。本专利技术使用真核细胞分泌表达原理和方法，产生的治疗蛋白和肽能够扩大10^5-7数量级，虽然如此但是一次给病人输入10^15- ¹⁷pfu重组病毒也有许多技术困难。解决重组病毒剂量问题最容易的方法是使用复制型病毒，一些报告使用条件性复制病毒，但它的生物安全性还存在质疑。WHO在开始使用重组病毒作基因载体文件就要求必需使用非复制性病毒，这给体内直接使用重组病毒治疗肿瘤设置技术上难以克服障碍，但是它确保了重组病毒技术的安全性，本发明技术提供了安全，有效和可以工业化生产的重组病毒基因技术。

本发明的scAAV在分泌肿瘤特异杀伤肽和蛋白嵌合iRGD环肽，它一方面减少羧基肽酶对表达产物的降解，同时通过RGD肽序列使目的肽和肿瘤和肿瘤血管内皮细胞整合素受体结合达到iRGD嵌合肽具有肿瘤治疗的靶向性，同时肿瘤细胞分泌金属蛋白酶消化嵌合肽暴漏C-R-G-D-K/R和肿瘤细胞膜的Neuropilin受体结合和穿孔进入细胞，达到了肿瘤靶向肽杀死肿瘤作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京肽和生物科技有限公司

<120> 一种靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白及其应用

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys

1 5 10 15

Leu Met Phe Lys Thr Glu

20

<210> 3

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu

20 25 30

Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly

35 40 45

Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn

50 55 60

Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln

65 70 75 80

Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg

85 90 95

Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro

100 105 110

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu Glu Val Val Arg Arg Cys Pro

115 120 125

His His Glu Leu

130

<210> 4

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Leu Pro Arg His Ser Cys Ser Leu Leu Leu Phe Leu Phe Leu Leu

1 5 10 15

Pro Ser Val Pro Met Glu Pro His Pro Pro Ser Ser Thr Leu Pro Pro

20 25 30

Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Ala Leu Ser

35 40 45

Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly

50 55 60

Ala Tyr Gly Glu Pro Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg

65 70 75

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu

1 5

<210> 6

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ala Arg Lys Gly Lys Gly Gln Ile Glu Lys Arg Lys Leu Arg Glu Lys

1 5 10 15

Arg Arg Ser Thr Gly Val Val Asn Ile Pro Ala Ala Glu Cys Leu Asp

20 25 30

Glu Tyr Glu Asp Asp Glu Ala Gly Gln Lys Glu Arg Lys Arg Glu Asp

35 40 45

Ala Ile Thr Gln Gln Asn Thr Ile Gln Asn

50 55

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met

1 5 10 15

Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Glu Val Val Arg Arg Cys Pro

20 25 30

His His Glu Arg

35

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Cys Arg Gly Asp Arg Gly Pro Asp Cys

1 5

<210> 9

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro

20 25 30

Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu

35 40 45

Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala

50 55 60

Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg

65 70 75

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctttctctc cacaggt 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctttctctc gacaggt 17

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccttcctctc aacaggt 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccttcctctc cacaggt 17

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccttactctc cacaggt 17

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccttgctctc aataggt 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccttactctc aaaaggt 17

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccttcctctc cagaggt 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccttgctctc gagaggt 17

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccttgctctc aataggt 17

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccttactctc cacaggt 17

<210> 21

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Glu Phe Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala

1 5 10 15

Leu Asp Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr

20 25 30

Trp Gly Gly Pro Gly Ser Glu Ser

35 40

<210> 22

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys Tyr Ser Asn

1 5 10 15

Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp Val Ala Ser

20 25 30

Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe Lys Lys Gly

35 40 45

Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys Leu Glu Ala

50 55 60

Thr Ile Asn Glu Leu Val

65 70

<210> 23

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atggtgaagc agatcgagag caagactgct tttcaggaag ccttggacgc tgcaggtgat 60

aaacttgtag tagttgactt ctcagccacg tggggcggtc cgggatccga atcc 114

<210> 24

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aaaatgatca agcctttctt tcattccctc tctgaaaagt attccaacgt gatattcctt 60

gaagtagatg tggatgactg tcaggatgtt gcttcagagt gtgaagtcaa atgcatgcca 120

acattccagt tttttaagaa gggacaaaag gtgggtgaat tttctggagc caataaggaa 180

aagcttgaag ccaccattaa tgaattagtc taa 213

<210> 25

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60

ccaattgagt cccaaccccc accctcaaca ttgccccctt ttctggcccc tgagtgggac 120

cttctctccc cccgagtagt cctgtctagg ggtgcccctg ctgggccccc tctgctcttc 180

ctgctggagg ctggggcctt tcgggagtca gcaggtgccc cggccaaccg cagccgg 237

<210> 26

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtaagtatct cgatcgaggt tacaagacag gtttaaacgc gtcacctatt ggttcttact 60

gacatccaca ctttgccttt ctcccgatat cctgcaggc 99

<210> 27

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60

ccaattgagt cccaaccccc accctcaaca ttgccccctt ttctggcccc tgagtgggac 120

cttctctccc cccgagtagt cctgtctagg ggtgcccctg ctgggccccc tctgctcttc 180

ctgctggagg ctggggcctt tcgggagtca gcaggtgccc cggccaaccg cagccggcgg 240

taagtatctc gatcgaggtt acaagacagg tttaaacgcg tcacctattg gttcttactg 300

acatccacac tttgcctttc tcccgatatc ctgcaggccc ccctctgagt caggaaacat 360

tttcagacct atggaaacta cttggttctt gtcgtggtga tcgtggtcct gattgctgac 420

cttgctctaa taggtacagc caagtctgtg acttgcacgt actcccctgc cctcaacaag 480

atgttttgcc aactggccaa gacctgccct gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540

cgcggttctt gtcgtggtga tcgtggtcct gattgctgac cttactctcc aacaggtagc 600

cacctgaagt ccaaaaaggg tcagtctacc tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca 660

gaaggttctt gtcgtggtga tcgtggtcct gattgctga 699

<210> 28

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Cys Arg Gly Asp Arg Gly Pro Asp Cys

20 25

<210> 29

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met

1 5 10 15

Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Glu Val Val Arg Arg Cys Pro

20 25 30

His His Glu Arg Gly Ser Cys Arg Gly Asp Arg Gly Pro Asp Cys

35 40 45

<210> 30

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys

1 5 10 15

Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Ser Cys Arg Gly Asp Arg Gly Pro Asp

20 25 30

Cys

<210> 31

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atgaacgctc tccaagaaga tactccaccc ggaccatcaa cggtgttcag gccaccaaca 60

agttcacggc cgttggaaac ccctcactgc agagagatcc ggattggtat cgctggaatt 120

acaatcactc tatcgctgtg tggctgcgcg aatgctcgcg ctcccacgct aagatctgca 180

actgcggaca attcagaaag cactggtttc aagaatgtgc cggacttgag gaccgatcaa 240

cccaagcctc cctcgaagaa gcgatcctgc gacccctccg agtacagggt aagcgagcta 300

aaagaaagct tgattaccac tactcccagc cgaccccgaa ccgcaagaag gcgtataaga 360

ctggaggttg tgaggcgctg cccccaccat gagctttag 399

<210> 32

<211> 212

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gccaggaaag gcaaagggca gatcgagaag aggaagctgc gggagaagcg ccgctccacc 60

ggcgtggtca acatccccgc ggcggagtgc ttagatgagt acgaagatga cgaagcagga 120

cagaaggaac ggaagcgaga ggatgctatc acacagcaga acaccatcca gaatgagagg 180

ttgtgaggcg ctgcccccac catgagcttt ag 212

<210> 33

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atggtgaagc agatcgagag caagactgct tttcaggaag ccttggacgc tgcaggtgat 60

aaacttgtag tagttgactt ctcagccacg tggggcggtc cgggatccga atccaaacat 120

tcttccggtt gtgctttttt aaaatgatca accctttctt tcattccctc tctgaaaagt 180

attccaacgt gatattcctt gaagtagatg tggatgactg tcaggatgtt gcttcagagt 240

gtgaagtcaa atgcatgcca acattccagt tttttaagaa gggacaaaag gtgggtgaat 300

tttctggagc caataaggaa aagcttgaag ccaccattaa tgaattagtc taagtcgacg 360

gttcttgtcg tggtgatcgt ggtcctgatt gctga 395

<210> 34

<211> 1438

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60

ccaattgagt cccaaccccc accctcaaca ttgccccctt ttctggcccc tgagtgggac 120

cttctctccc cccgagtagt cctgtctagg ggtgcccctg ctgggccccc tctgctcttc 180

ctgctggagg ctggggcctt tcgggagtca gcaggtgccc cggccaaccg cagccggcgg 240

taagtatctc gatcgaggtt acaagacagg tttaaacgcg tcacctattg gttcttactg 300

acatccacac tttgcctttc tcccgatatc ctgcaggcat gaacgctctc caagaagata 360

ctccacccgg accatcaacg gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc 420

ctcactgcag agagatccgg attggtatcg ctggaattac aatcactcta tcgctgtgtg 480

gctgcgcgaa tgctcgcgct cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaagca 540

ctggtttcaa gaatgtgccg gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc 600

gatcctgcga cccctccgag tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta 660

ctcccagccg accccgaacc gcaagaaggc gtataagact ggaggttgtg aggcgctgcc 720

cccaccatga gcttggttct tgtcgtggtg atcgtggtcc tgattgctga ccttgctcta 780

ataggtgcca ggaaaggcaa agggcagatc gagaagagga agctgcggga gaagcgccgc 840

tccaccggcg tggtcaacat ccccgcggcg gagtgcttag atgagtacga agatgacgaa 900

gcaggacaga aggaacggaa gcgagaggat gctatcacac agcagaacac catccagaat 960

gagaggttgt gaggcgctgc ccccaccatg agcttggttc ttgtcgtggt gatcgtggtc 1020

ctgattgctg accttactct ccaacaggta tggtgaagca gatcgagagc aagactgctt 1080

ttcaggaagc cttggacgct gcaggtgata aacttgtagt agttgacttc tcagccacgt 1140

ggggcggtcc gggatccgaa tccaaacatt cttccggttg tgctttttta aaatgatcaa 1200

gcctttcttt cattccctct ctgaaaagta ttccaacgtg atattccttg aagtagatgt 1260

ggatgactgt caggatgttg cttcagagtg tgaagtcaaa tgcatgccaa cattccagtt 1320

ttttaagaag ggacaaaagg tgggtgaatt ttctggagcc aataaggaaa agcttgaagc 1380

caccattaat gaattagtct aaggttcttg tcgtggtgat cgtggtcctg attgctga 1438

Claims

1.一种嵌合表达盒，其特征在于，其含有多种核酸片段；每种核酸片段编码靶向肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白；所述嵌合肽或嵌合蛋白包括：用于靶向目的肿瘤的iRGD肽和用于杀伤所述目的肿瘤的特异性肽或蛋白，所述iRGD肽连接至所述特异性肽或蛋白的羧基端；

所述嵌合表达盒中插入有用于控制上述特异性肽或蛋白的表达效率或比率的拼接子序列，相邻两个核酸片段之间插入有拼接子序列；

所述嵌合表达盒其上游至下游依次包括如下表达元件：编码NT4信号肽的核酸序列、人工内含子、编码第一嵌合肽的核酸序列、第一拼接子、编码第二嵌合肽的核酸序列、第二拼接子以及编码第三嵌合肽的核酸序列，该嵌合表达盒的碱基序列如SEQ ID NO.27所示；

或者，所述嵌合表达盒其上游至下游依次包括如下表达元件：编码NT4信号肽的核酸序列、人工内含子、编码第四嵌合蛋白的核酸序列、第一拼接子、编码第五嵌合肽的核酸序列、第二拼接子、编码第六嵌合肽的核酸序列，该嵌合表达盒的碱基序列如SEQ ID NO.34所示。

2.一种载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的嵌合表达盒。

3.含有权利要求2所述的载体的病毒。

4.权利要求1所述的嵌合表达盒、权利要求2所述的载体、或权利要求3所述的病毒在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。