CN108670969B - 一种治疗骨髓造血功能障碍的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了SphK2抑制剂ABC294640提高造血干细胞功能、治疗造血功能障碍的用途。ABC294640可以用于治疗原发性造血功能障碍、或辐射、化学药物刺激所导致的造血功能障碍症状，并且可以通过提高造血干细胞功能增强病人在多次化疗后的造血功能的恢复和生存率的延长。本发明为治疗原发或诱导型的造血功能障碍性疾病提供了新的药物来源。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及ABC294640治疗原发性和化学药物、放射线所造成的造血功能障碍疾病中的应用。
背景技术
造血干细胞是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，其主要作用是分化产生红细胞、血小板以及白细胞等各类血液免疫细胞，支持机体造血和免疫系统的更新。造血干细胞对于机体正常造血功能的维持和损伤修复有重要意义。原发性病变、环境中的射线、临床治疗中的化学药物和射线辐射均会对造血干细胞有严重的损伤，导致病人造血功能障碍、血象降低和白细胞下降免疫功能紊乱甚至生存率降低。因此，提高造血干细胞的造血功能对治疗造血功能障碍及其相关疾病至关重要，但是目前尚无有效针对造血干细胞功能增强的治疗干预手段。
ABC294640，结构如式1所示，是鞘氨醇激酶2(SphK2)的抑制剂，可以抑制SphK2 的功能减少鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的产生。S1P是真核生物体的第二信使可以发挥多种重要生理功能，可促进癌组织生长和病理性炎症的发生。现在研究发现ABC294640对多种实体瘤包括胰腺肿瘤、肝癌、胆管癌和多发性骨肉瘤，有抑制肿瘤生长、减少免疫炎症反应的治疗作用，相关实验已经在美国开展临床二期实验，以色列生物制药公司 RedHill报导药物YelivaTM(ABC294640)在一期临床实验中，证实该药物具有良好的安全性和耐受性，主要副作用是1-2级的疲惫感和恶心感。然而ABC294640对造血干细胞的作用还未见报道。
发明内容
本申请是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：
通常认为，SphK2基因(小鼠NCBI登录号:NP_001166032，人Genbank Gene ID:56848)缺失会导致多种肿瘤细胞的生长缓慢、凋亡发生和成瘤能力减弱。发明人运用SphK2基因敲除小鼠模型首次发现，SphK2基因敲除使造血干细胞自我更新能力加强数量增加，表现为小鼠的造血干细胞数量增加。本发明还发现了SphK2基因敲除的小鼠放射和化疗药物刺激后，造血干细胞损伤修复速度明显加快，并且小鼠在多次化疗刺激下生存期显著延长。这说明SphK2基因是靶向造血干细胞治疗造血功能障碍性疾病的有效治疗靶点。
本发明还首次证明了SphK2抑制剂ABC294640在造血功能障碍性疾病治疗中的应用。发明人发现，小鼠腹腔注射ABC294640后可以使造血干细胞数量显著增加对原发性造血功能障碍有治疗作用；同时ABC294640可以有效促进化疗药物5-氟尿嘧啶刺激和放射线辐射损伤下，小鼠血小板和白血细胞的恢复速度，对损伤刺激后的血象恢复有显著治疗作用；并且接受ABC294640注射的小鼠在多次大剂量化疗刺激下，生存期显著延长，表明ABC294640对血液系统严重损伤所导致的生存率降低有治疗作用。
本发明将现有的SphK2抑制剂ABC294640这个小分子化合物发掘出新的药用价值，将其应用于原发性造血功能障碍和化学药物或射线、辐射损伤所造成的造血功能障碍均有治疗意义。
因此，本发明提供了
SphK2基因或蛋白作为药物筛选靶点的应用，所述的药物是治疗造血干细胞损伤的药物。
SphK2基因或蛋白作为药物筛选靶点的应用，所述的药物是治疗血液和免疫系统损伤的药物。
SphK2基因或蛋白作为药物筛选靶点的应用，所述的药物是治疗造血功能障碍、血象降低的药物。
其中，所述的造血干细胞损伤、造血功能障碍、血象降低是原发性的或由放射线照射、药物损伤引发的。所述药物抑制SphK2基因的表达或者SphK2蛋白的功能。
并且提供了
SphK2抑制剂在制备治疗造血功能障碍、造血干细胞损伤、血象降低或免疫细胞减少的疾病的药物中的应用，所述的疾病是原发性的，或者是由放射线辐射或药物损伤引发的。
以及
SphK2抑制剂在制备提高造血干细胞自我更新和造血功能的药物中的应用，其中，SphK2抑制剂抑制SphK2基因的表达或者抑制SphK2蛋白的功能，优选地，其是 ABC294640。
附图说明
图1.SphK2基因敲除导致造血干细胞数量增加。
左图方框中标示的是野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠骨髓细胞中造血干细胞的分析，显示SphK2基因敲除后造血干细胞比例增加；右图是统计野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠骨髓细胞中造血干细胞的数目。结果表明SphK2基因敲除小鼠中造血干细胞数量显著增加。
图2.SphK2基因敲除使造血干细胞损伤修复速度加快
左图方框中标示的是在化疗药物5-氟尿嘧啶处理后，野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠，骨髓中造血干细胞的比例增加；右图是统计野生型小鼠与SphK2基因小鼠在5-氟尿嘧啶化疗损伤后骨髓细胞中造血干细胞的数目，显示化疗损伤后SphK2基因敲除小鼠的造血干细胞数量显著多于对照组。
图3.SphK2基因敲除小鼠在大剂量化疗刺激后生存能力显著延长。连续5-氟尿嘧啶处理导致正常小鼠迅速死亡，但是SpkhK2敲除的小鼠生存率显著延长。
图4.抑制剂ABC294640注射使得造血干细胞数量显著增加。
左图方框中标示的是溶剂对照组与ABC294640治疗组小鼠在化疗药物5-氟尿嘧啶处理后骨髓细胞中造血干细胞的比例，显示ABC294640治疗组的小鼠较溶剂对照组小鼠，其造血干细胞数量显著增加；右图是统计溶剂对照组与ABC294640治疗组小鼠在化疗药物5-氟尿嘧啶处理后骨髓细胞中造血干细胞的数目，结果显示治疗组造血干细胞数量明显增加，说明ABC294640明显促进造血干细胞的损伤修复。
图5.抑制剂ABC294640注射显著增加化疗药物5-氟尿嘧啶刺激后白细胞的恢复速度。
图6.抑制剂ABC294640注射显著增加化疗药物5-氟尿嘧啶刺激后血小板的恢复速度。
图7.抑制剂ABC294640注射显著增加放射线辐照刺激后白细胞的恢复速度。
图8.抑制剂ABC294640注射显著增加放射线辐照刺激后血小板的恢复速度。
图9.抑制剂ABC294640注射小鼠在多次5-氟尿嘧啶刺激下生存能力显著增加。
具体实施方式
结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
利用SphK2敲除小鼠模型，说明SphK2敲除后能够提高正常生理状态下小鼠骨髓中造血干细胞的数目。
SphK2基因敲除小鼠由美国国立健康院(NIH)处引进，其系背景为C57BL/6J，在无特定病原体的洁净(SPF)环境中饲养。首先我们选用基因型为野生型小鼠与SphK2 基因敲除小鼠，6-8周大，数目各6只，将其脱颈处死，取其股骨与胫骨，用1毫升注射器冲出骨髓腔中骨髓，吹散为单细胞悬液，红细胞裂解液裂解2分钟去除红细胞，70um 滤网过滤，得到骨髓单细胞悬液。为计算小鼠中造血干细胞的数量，通过造血干细胞研究领域公认的分子标记物系统Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-，结合流式细胞仪对造血干细胞数量进行统计定量。具体方法为取出200万骨髓细胞，加入2ul Lin、Sca-1、c-Kit、 CD150、CD48抗体组合，冰上孵育1h。随后加入1毫升PBS清洗细胞，500g离心5min，弃掉上清，加入300ulPBS，进行流式细胞仪计数分析，得到小鼠骨髓中造血干细胞数目。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，在正常的生理状态下，SphK2基因敲除组小鼠骨髓细胞中造血干细胞的数目明显多于对照组(图1)。***P＜0.001.
实施例2
利用化疗药物5-氟尿嘧啶诱导小鼠骨髓造血系统损伤，发现SphK2敲除小鼠的造血干细胞损伤修复能力显著加强。
分别选择实施例1中饲养环境的野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠，6-8周大，数目各6只，对于进行5-氟尿嘧啶腹腔注射，注射剂量为150mg/kg，12天后将其脱颈处死，取其股骨与胫骨，其他取材分析过程同实施例1。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，5-氟尿嘧啶刺激12天状态下，SphK2基因敲除组小鼠骨髓细胞中造血干细胞的数目明显多于野生型小鼠组(图2)，说明SphK2基因敲除确实能够提高骨髓造血系统损伤状态下造血干细胞的损伤修复速度，抵抗化疗损伤。**P＜0.01.
实施例3
SphK2基因敲除小鼠较野生型小鼠组，其小鼠的生存周期明显延长
分别选择实施例1中饲养环境的野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠，8周大，数目各10只，对于进行5-氟尿嘧啶腹腔注射，注射剂量为150mg/kg，每7天打一次，连续打3周，观察小鼠的生存周期(图3)。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜ 0.05标示差异的显著性。
结果显示，SphK2基因敲除小鼠组在多次5-氟尿嘧啶刺激下生存周期较野生型小鼠组明显延长，说明SphK2基因敲除小鼠更能够抵抗5-氟尿嘧啶所诱导的化疗损伤，***P＜0.001。
实施例4
SphK2抑制剂ABC294640可有效的增加造血干细胞的在化学药物刺激后的损伤修复能力。
实验用小鼠选用20只8周大C57小鼠(中山大学实验动物中心购买)，分别给予 5-氟尿嘧啶腹腔注射，剂量：150mg/kg，同时每两天进行一次ABC294640的腹腔注射溶剂，对照组注射溶剂对照(1：1生理盐水：PEG400)溶液。用药方案是第一天注射 5-氟尿嘧啶溶液，第二天开始注射抑制剂与溶剂对照，随后每两天进行一次给药注射，共注射5次。第12天提取对照组与ABC294640处理组小鼠骨髓细胞，分析造血干细胞数量，方法与分析同实施例1。
SphK2抑制剂ABC294640购置于Selleck公司，溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，最终用聚乙二醇400(PEG400)与生理盐水的混合液(1：1)稀释为终浓度10mg/kg。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，在化疗药物5-氟尿嘧啶刺激下ABC294640治疗组中造血干细胞数量显著增加，说明ABC294640可有效增强造血干细胞的自我更新能力和损伤修复速度，帮助化疗药物损伤后造血功能障碍的治疗(图4)。**P＜0.01。
实施例5
SphK2抑制剂ABC294640注射显著增加化疗药物刺激后白细胞的恢复速度
SphK2抑制剂的配制与实施例4一致，选用中山大学动物中心购买的12只8周大C57小鼠，分为两组，每组各6只，对其进行5-氟尿嘧啶腹腔注射，剂量为150mg/kg，注射1次，抑制剂ABC294640与溶剂对照的注射与实施例4类似，也是5-氟尿嘧啶注射后第二天开始注射，随后每两天注射一次，剂量为10mg/kg，一直注射到该实验结束。分别在第0天，第1天，第5天和第11天小鼠尾静脉取血于抗凝管中，采用血常规检测外周血白细胞数目。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，ABC294640治疗组较溶剂对照组，外周血中白细胞数量显著增加，说明其可以有效治疗化疗药物所诱发的造血功能障碍和免疫细胞降低等症状(图5)。**P ＜0.01，***P＜0.001。
实施例6
SphK2抑制剂ABC294640注射显著增加化疗药物刺激后血小板的恢复速度
实验实施方法与实施例5一致，将抑制剂组与溶剂对照组小鼠第0天，第1天，第5天和第11天尾静脉采血后，进行血常规检测外周血血小板数目。我们应用Graphpad6.0进行 t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，ABC294640治疗组较溶剂对照组，外周血中血小板数量显著增加，说明其可以有效促进化学药刺激下的血小板恢复(图6)。*P＜0.05，***P＜0.001。
实施例7
SphK2抑制剂ABC294640注射显著增加射线辐照刺激后白细胞的恢复速度
SphK2抑制剂的配制与实施例4一致，选用中山大学动物中心购买的12只8周大C57小鼠，分为两组，每组各6只，对其进行X射线辐射损伤，剂量为450cGy。抑制剂与溶剂对照的注射与实施例4类似，X射线辐射后第二天开始腹腔注射，随后每两天注射一次，剂量为10mg/kg，一直注射到该实验结束。分别在第0天，第1天，第7天和第14天小鼠尾静脉取血于抗凝管中，进行血常规检测外周血白细胞数目。我们应用 Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，ABC294640治疗组较溶剂对照组，外周血中白细胞数量显著增加，证明ABC294640可有效增强外周血中白细胞恢复速度，说明其可以有效促进辐射损伤所造成的造血功能障碍(图7)。*P＜0.5，***P＜0.001。
实施例8
SphK2抑制剂ABC294640注射显著增加辐射刺激后血小板的恢复速度
实验实施方法与实施例7一致，将抑制剂组与溶剂对照组小鼠第0天，第1天，第7天和第14天尾静脉采血后，进行血常规检测外周血血小板数目。我们应用Graphpad6.0进行 t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，ABC294640治疗组较溶剂对照组，外周血中血小板数量显著增加，说明其可以有效治疗射线辐射损伤所导致的血小板降低的造血功能障碍(图8)。**P＜ 0.01。
实施例9
SphK2抑制剂ABC294640可靶向造血干细胞有效增加小鼠在多次大剂量化疗反复刺激下的生存率。
SphK2抑制剂的配制与实施例4一致，选用中山大学动物中心购买的12只8周大C57小鼠，分为两组，每组各6只，对其进行5-氟尿嘧啶腹腔注射，剂量为150mg/kg，每7天注射一次，共注射两次，抑制剂ABC294640与溶剂对照的注射与实施例4类似，抑制剂ABC294640也是5-氟尿嘧啶注射后第二天开始注射，随后每两天注射一次，剂量为10mg/kg，一直注射到该实验结束。记录小鼠死亡情况，结果见图9。我们应用 Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。
结果显示，ABC294640处理组小鼠较对照组小鼠，在大剂量化疗药物反复刺激下，小鼠生存周期明显延长，说明ABC294640能够有效抵抗化疗药物的损伤，***P＜0.001.
以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.SphK2抑制剂在制备药物中的应用，所述药物用于治疗化疗或放疗引起的造血功能障碍；其中的SphK2抑制剂是ABC294640。
2.权利要求1所述的应用，其中的SphK2抑制剂抑制SphK2基因的表达或者抑制SphK2蛋白的功能。
3.权利要求1所述的应用，其中所述化疗包括使用化疗药物5-氟尿嘧啶。
4.权利要求1所述的应用，其中所述放疗包括使用X射线辐射。
5.权利要求1所述的应用，其中所述造血功能障碍包括骨髓细胞中造血干细胞的损伤。
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| Mobilization studies in mice deficient in sphingosine kinase 2 support a crucial role of the plasma level of sphingosine-1-phosphate in the egress of hematopoietic stem progenitor cells;Mateusz Adamiak et al.;《Oncotarget》;20170724;第8卷(第39期);65588-65600 * |
| Targeting Sphingosine Kinase Induces Apoptosis and Tumor Regression for KSHV-Associated Primary Effusion Lymphoma;Zhiqiang Qin et al;《Molecular Cancer Therapeutics》;20140131;第13卷(第1期);154-165 * |
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