CN108660137A

CN108660137A - 一种用于抑制miR-374a表达的sgRNA及其应用

Info

Publication number: CN108660137A
Application number: CN201810510416.6A
Authority: CN
Inventors: 李军锋; 周育森; 谢柱; 李�浩; 寇志华; 陈佳唯
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108660137B

Abstract

本发明公开了一种用于抑制miR‑374a表达的sgRNA及其应用。本发明首先保护一种sgRNA，其靶序列位于人基因组中miR‑374a的编码序列。所述sgRNA具体如序列表的序列7所示。编码所述sgRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护特定物质在沉默miR‑374a中的应用；所述特定物质为：(a)所述sgRNA；(b)所述sgRNA和编码Cas9蛋白的RNA；(c)编码所述sgRNA的DNA分子；(d)编码所述sgRNA的DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子；(e)具有编码所述sgRNA的DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子的重组载体。本发明获得的miR‑374a低表达细胞为进一步研究该分子的功能及在病原致病过程中的作用奠定了基础。

Description

一种用于抑制miR-374a表达的sgRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于抑制miR-374a表达的sgRNA及其应用。

背景技术

MicroRNA是一种短链非编码RNA，能特异性结合靶基因mRNA的3′非编码区域，从转录水平或转录后水平调控基因表达。

人体细胞中miR-374a编码基因位于人染色体Xq13.2。其在细胞和组织中的异常表达与肿瘤的发生有重要关系。在肺腺癌细胞中，miR-374a的过量表达，能使得靶基因TGFA的表达下调，从而抑制细胞的增殖、转移和侵袭。在非小细胞肺癌中，miR-374a能通过靶向结合LARP1，减弱LARP1启动子效应，下调STAT3信号通路，从而抑制细胞增殖、转移。在乳腺癌细胞中，miR-374a能抑制Wnt/β-catenin信号通路负调控因子，促进癌细胞转移。在骨肉瘤和食道癌组织中，miR-374a能够抑制靶基因的表达，促进癌细胞的增殖和转移，同样具有原癌基因作用。此外，miR-374a的异常表达与炎症性肠病有关，对保护细胞的化学性缺氧损伤也有作用。

miR-374a在机体中的作用广泛，许多仍有待进一步深入地研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于抑制miR-374a表达的sgRNA及其应用。

本发明首先保护一种sgRNA，其靶序列位于人基因组中miR-374a的编码序列。

所述sgRNA中，靶序列结合区如序列表的序列7第1至20位核苷酸所示。

所述sgRNA具体如序列表的序列7所示。

编码所述sgRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围。

编码所述sgRNA的DNA分子具体如序列表的序列6所示。

具有所述DNA分子的重组载体也属于本发明的保护范围。所述重组载体中具有编码所述sgRNA的DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子。所述重组载体具体可为将序列为“TAAGTGCTATAACACTTATC”的DNA分子插入pSpCas9(BB)-2A-Puro载体的BbsI酶切位点得到的重组质粒。

本发明还保护一种重组细胞，是将编码所述sgRNA的DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子导入出发细胞得到的。所述重组细胞具体是将所述重组载体导入出发细胞得到的。所述出发细胞为人胚肾上皮细胞或人肺癌细胞。所述出发细胞具体可为HEK-293T细胞或A549细胞。

本发明还保护一种抑制HEK-293T细胞增殖的方法，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统降低HEK-293T细胞中miR-374a的水平。所述crispr/cas9系统中，采用所述sgRNA。所述方法具体包括如下步骤：在HEK-293T细胞中导入编码Cas9蛋白的DNA分子和编码所述sgRNA的DNA分子。

本发明还保护一种促进A549细胞增殖的方法，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统降低A549细胞中miR-374a的水平。所述crispr/cas9系统中，采用所述sgRNA。所述方法具体包括如下步骤：在A549细胞中导入编码Cas9蛋白的DNA分子和编码所述sgRNA的DNA分子。

本发明还保护特定物质在沉默miR-374a中的应用；

所述特定物质为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)所述sgRNA；

(b)所述sgRNA和编码Cas9蛋白的RNA；

(c)编码所述sgRNA的DNA分子；

(d)编码所述sgRNA的DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子；

(e)所述重组载体。

本发明还保护特定物质在制备miR-374a水平降低的细胞中的应用；

所述特定物质为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)所述sgRNA；

(b)所述sgRNA和编码Cas9蛋白的RNA；

(c)编码所述sgRNA的DNA分子；

(d)编码所述sgRNA的DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子；

(e)所述重组载体。

所述细胞为人胚肾上皮细胞或人肺癌细胞。

所述细胞具体可为HEK-293T细胞或A549细胞。

以上任一所述miR-374a为序列表的序列1所示的miRNA。

以上任一所述编码Cas9蛋白的DNA分子如序列表的序列8所示。

本发明的发明人成功构建了可以靶向miR-374a基因组的基因编辑载体，该载体在细胞中可使该区域基因组序列受到破坏，抑制miR-374a表达，从而影响细胞的增殖和其他功能。因其在基因组水平彻底破坏基因结构，使细胞实现miR-374a永久低表达,较反义核酸、海绵体等其他瞬时降低细胞中的miR-374a表达手段，抑制效果更好，且避免了寡核苷酸抵制、抑制同族其他microRNA等副反应。本发明获得的miR-374a低表达细胞为进一步研究该分子的功能及在病原致病过程中的作用奠定了基础。

附图说明

图1为实施例1的结果。

图2为实施例2的结果。

图3为实施例3的结果。

图4为实施例4的结果。

图5为实施例5的结果。

图6为实施例6的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中所用的基础培养基为：取无血清RPMI-1640培养基，加入胎牛血清至浓度为10％、加入青霉素至浓度为1％、加入链霉素至浓度为1％，每14天加入谷氨酰胺至浓度为2mmol/L。

HEK-293T细胞：人胚肾上皮细胞。A549细胞：人肺癌细胞。

TurboFect Transfection Reagent：Thermo公司。

实施例1、靶序列的筛选

pSpCas9(BB)-2A-Puro载体：Addgene公司。

一、序列分析

基因组中的相应DNA转录形成pri-RNA(300-1000bp)，剪切后形成pre-RNA，最后形成成熟的miRNA。

miR-374a如序列表的序列1所示。

miR-374a的pre-RNA对应的基因组中的DNA(正义链)如序列表的序列2所示。

基因组中miR-374a的编码序列及其周边序列(反义链)如序列表的序列3所示。

二、构建重组质粒

1、分别合成单链DNA分子Ⅰ-1和单链DNA分子Ⅰ-2，然后将单链DNA分子Ⅰ-1和单链DNA分子Ⅰ-2退火，得到两端均具有粘末端的双链DNA分子。

单链DNA分子Ⅰ-1(序列表的序列4)：5’-CACC TAAGTGCTATAACACTTATC-3’；

单链DNA分子Ⅰ-2(序列表的序列5)：5’-AAAC GATAAGTGTTATAGCACTTA-3’。

2、取pSpCas9(BB)-2A-Puro载体，用限制性内切酶BbsI酶切，得到线性化载体。

3、将步骤1得到的具有粘末端的双链DNA分子与步骤2得到的线性化载体连接，得到重组质粒Cas9-miR-374a。

经测序验证，重组质粒Cas9-miR-374a中，具有编码特异sgRNA的DNA分子(DNA如序列表的序列6所示，特异sgRNA如序列表的序列7所示)和编码Cas9蛋白的DNA分子(如序列表的序列8所示)。

4、分别合成单链DNA分子Ⅱ-1和单链DNA分子Ⅱ-2，然后将单链DNA分子Ⅱ-1和单链DNA分子Ⅱ-2退火，得到两端均具有粘末端的双链DNA分子。

单链DNA分子Ⅱ-1：5’-CACC CTTATCAGGTTGTATTATAA-3’；

单链DNA分子Ⅱ-2：5’-AAAC TTATAATACAACCTGATAAG-3’。

5、将步骤4得到的具有粘末端的双链DNA分子与步骤2得到的线性化载体连接，得到重组质粒A。

6、分别合成单链DNA分子Ⅲ-1和单链DNA分子Ⅲ-2，然后将单链DNA分子Ⅲ-1和单链DNA分子Ⅲ-2退火，得到两端均具有粘末端的双链DNA分子。

单链DNA分子Ⅲ-1：5’-CACC CCTGGGAAGAAATTTTACAT-3’；

单链DNA分子Ⅲ-2：5’-AAAC ATGTAAAATTTCTTCCCAGG-3’。

7、将步骤6得到的具有粘末端的双链DNA分子与步骤2得到的线性化载体连接，得到重组质粒B。

三、沉默效果比较

1、采用TurboFect Transfection Reagent并按说明书操作，将供试重组质粒转染HEK-293T细胞，然后37℃、5％CO₂静置培养48小时。供试重组质粒为重组质粒Cas9-miR-374a、重组质粒A或重组质粒B，进行平行试验。

2、取步骤1得到的细胞，提取miRNA。采用U6基因为内参基因，采用SYBR GreenRealtime PCR Master Mix(Toyobo)进行实时定量PCR，检测miR-374a成熟体的水平。用于检测miR-374a的反转录引物为RT-1，用于检测miR-374a的PCR引物为F1和R1。用于检测U6基因表达的反转录引物为RT-2，用于检测miR-374a的PCR引物为F2和R1。采用2^－ΔΔCt法计算miR-374a相对表达量。用GraphPad.Prism5对结果进行作图分析。

3、取HEK-293T细胞，代替步骤1得到的细胞，其他同步骤2，作为对照处理。

以对照处理中细胞的miR-374a相对表达量为1，计算各处理中细胞的miR-374a的相对表达水平。

RT-1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACTTATCAG-3’；

RT-2：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG-3’；

F1：5’-CGATCGCGCTTATAATACAACC-3’；

F2：5’-CGCAAATTAGTGAAGCGTTC-3’；

R1：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

结果见图1。转染重组质粒Cas9-miR-374a后的细胞，miR-374a的相对表达水平仅为10％。转染另外两种质粒(重组质粒A或重组质粒B)的细胞，miR-374a的相对表达水平均为50％。

实施例2、sgRNA的基因编辑效率

一、获得传代细胞

细胞培养条件均为：37℃、5％CO₂静置培养。

1、采用TurboFect Transfection Reagent并按说明书操作，将重组质粒Cas9-miR-374a转染HEK-293T细胞，然后培养48小时。

2、完成步骤1后，将细胞转移至含5μg/ml嘌呤霉素的基础培养基中，培养48小时。

3、完成步骤2后，将存活细胞转移至基础培养基中，培养至70％-80％汇合度。

4、完成步骤3后，收集细胞，进行胰酶消化，然后转移至基础培养基中，培养48小时。

5、收集细胞。

二、检测基因编辑效率

1、取步骤一的5得到的细胞，提取基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，然后回收PCR扩增产物。

F3：5’-GGTAGTAGGGTGGGGAGGTTAAGAGG-3’；

R3：5’-GACTGAAATCCAAACACAAAAATGGC-3’。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物连接至pMD-18T载体，然后导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后进行蓝白斑筛选，随机挑取10个阳性单克隆。

4、分别将步骤3得到的10个单克隆进行如下步骤：大量扩增，然后提取质粒。

5、以步骤4提取的质粒为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

6、取HEK-293T细胞，提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

步骤5和步骤6的琼脂糖凝胶电泳结果见图2A。图2A中，M为Trans15K的DNA分子量标准，+对应步骤6的扩增产物，1至10分别对应步骤5得到的10个阳性单克隆的扩增产物。

7、对步骤4获得的质粒进行插入片段部分的测序，回收步骤6得到的PCR扩增产物，进行测序。

步骤6的扩增产物为664bp，如序列表的序列9所示。

结果见图2B。图2B中，374a-0为步骤6的扩增产物中目标位置及其周边序列的测序结果，374a-1至374a-10分别对应步骤7的10个阳性单克隆的质粒中目标位置及其周边序列的测序结果。10个阳性单克隆中，有9个都在目标位置发生了缺失或插入突变，基因编辑效率为90％。

结果表明：采用Cas9技术，在序列表的序列7所示特异sgRNA的作用下，可以对基因组中miR-374a的编码序列进行有效的识别和编辑。

实施例3、基因编辑对细胞中miR-374a表达量的影响

一、获得传代细胞

细胞培养条件均为：37℃、5％CO₂静置培养。

1、采用TurboFect Transfection Reagent并按说明书操作，将重组质粒Cas9-miR-374a转染A549细胞，然后培养48小时。

5、收集细胞。

二、检测细胞中miR-374a成熟体的水平

1、取步骤一的5得到的细胞，提取miRNA。采用U6基因为内参基因，采用SYBR GreenRealtime PCR Master Mix(Toyobo)进行实时定量PCR，检测miR-374a成熟体的水平。用于检测miR-374a的反转录引物为RT-1，用于检测miR-374a的PCR引物为F1和R1。用于检测U6基因表达的反转录引物为RT-2，用于检测miR-374a的PCR引物为F2和R1。采用2^－ΔΔCt法计算miR-374a相对表达量。用GraphPad.Prism5对结果进行作图分析。

2、取A549细胞，代替步骤一的5得到的细胞，其他同步骤1，作为对照处理。

结果见图3。采用Cas9技术，在序列表的序列7所示特异sgRNA的作用下，细胞中mir-374a表达量明显降低(P<0.01)。因此针对miR-374a基因组的基因编辑可以有效地降低细胞内的miR-374a的转录表达。

实施例4、基因编辑后对miR-374a靶基因TGFA表达影响

TGFA基因为A549细胞中miR-374的靶基因。

一、获得传代细胞

细胞培养条件均为：37℃、5％CO₂静置培养。

5、收集细胞。

二、检测细胞中TGFA基因的表达水平

1、取步骤一的5得到的细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。采用GAPDH基因为内参基因，采用实时定量PCR，检测TGFA基因的表达水平。采用2^－ΔΔCt法计算TGFA基因的相对表达量。用GraphPad.Prism5对结果进行作图分析。

用于鉴定TGFA基因的引物如下：

TGFA-qPCRP1：5’-CCTGTTCGCTCTGGGTATTGT-3’；

TGFA-qPCRP2：5’-CAGATTCCCACACTCAGTTCTGC-3’。

用于鉴定GAPDH基因的引物如下：

GAPDH-qPCRP1：5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3’；

GAPDH-qPCRP2：5’-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

以对照处理中细胞的TGFA基因的相对表达量为1，计算各处理中细胞的TGFA基因的相对表达水平。

结果见图4。采用Cas9技术，在序列表的序列7所示特异sgRNA的作用下，细胞中TGFA的表达量明显升高(P<0.05)。

实施例5、敲低miR-374a对A549细胞的增殖活力的影响

一、获得传代细胞

细胞培养条件均为：37℃、5％CO₂静置培养。

5、收集细胞。

二、检测细胞的增殖活力

1、取步骤一的5得到的细胞，用Invitrogen公司的Countess对细胞自动计数，然后以5000个细胞/孔的细胞数量铺至96孔板；然后每孔加入10μl CCK8溶液，静置孵育3小时，然后开始计时，使用BioTek公司的多功能酶标仪，分别于0时刻、24小时后、48小时后和72小时后，在λ＝450nm检测细胞OD值(每个时间点5个重复处理)。用GraphPad.Prism5绘制生长曲线。

结果见图5。采用Cas9技术，在序列表的序列7所示特异sgRNA的作用下，A549细胞的增殖能力明显升高，符合预期。

实施例6、敲低miR-374a对HEK-293T细胞的增殖活力的影响

一、传代细胞的制备

用HEK-293T细胞代替A549细胞，其他同实施例5的步骤一。

二、检测细胞的增殖活力

1、取步骤一的5得到的细胞，用Invitrogen公司的Countess对细胞自动计数，然后以5000个细胞/孔的细胞数量铺至96孔板；然后每孔加入10μl CCK8溶液，静置孵育3小时，然后开始计时，使用BioTek公司的多功能酶标仪，分别于0时刻、24小时后、48小时后、72小时后、96小时和120小时后，在λ＝450nm检测细胞OD值(每个时间点5个重复处理)。用GraphPad.Prism5绘制生长曲线。

2、取HEK-293T细胞，代替步骤一的5得到的细胞，其他同步骤1，作为对照处理。

结果见图6。采用Cas9技术，在序列表的序列7所示特异sgRNA的作用下，HEK-293T细胞的增殖能力明显下降。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种用于抑制miR-374a表达的sgRNA及其应用

<130> GNCYX180853

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

uuauaauaca accugauaag ug 22

<210> 2

<211> 72

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

tacatcggcc attataatac aacctgataa gtgttatagc acttatcaga ttgtattgta 60

attgtctgtg ta 72

<210> 3

<211> 105

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ggaagagaga caggcatata cacagacaat tacaatacaa tctgataagt gctataacac 60

ttatcaggtt gtattataat ggccgatgta aaatttcttc ccagg 105

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cacctaagtg ctataacact tatc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

aaacgataag tgttatagca ctta 24

<210> 6

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

taagtgctat aacacttatc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 102

<210> 7

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

uaagugcuau aacacuuauc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 8

<211> 4101

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 720

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080

ctgtctcagc tgggaggcga c 4101

<210> 9

<211> 664

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

ggtagtaggg tggggaggtt aagaggagta taagcaaaaa ggaaaaaaaa aagctcatat 60

tttagaggag gggattgaga agttccttta ttggaagtct gtgcatggaa gtcccatttt 120

acatcatgcc agtgtctagt tcccaattcc gtctatggcc acgggttagg gaaagcctga 180

atatttgaaa taaccgaaaa gcatttaacc tttgatttct ataatttgtt cctcacctct 240

cttgatgtta cagccagcag cagcctggag cagcaccccc tgggaagaaa ttttacatcg 300

gccattataa tacaacctga taagtgttat agcacttatc agattgtatt gtaattgtct 360

gtgtatatgc ctgtctctct tcctgttatc agttagactg tgagctcctt gagggcaagg 420

aaggtgtctt catctccaga gcccagcctg gcacattagt aggcctcagt aaatgtttat 480

tagatgaata aatgaatgac tcatcagcaa acatttattg tgtgcctgct aaagtgagct 540

ccacaggctc tggattgtca gctgtttctt caaaaagcat gtggtcagaa atttgatatt 600

tctgtatata tcttcctaag agtttctcat gagacaatgc catttttgtg tttggatttc 660

agtc 664

Claims

1.一种sgRNA，其靶序列为基因组中miR-374a的编码序列。

2.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于：其中的靶序列结合区如序列表的序列7第1至20位核苷酸所示。

3.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于：如序列表的序列7所示。

4.编码权利要求1或2或3所述sgRNA的DNA分子。

5.具有权利要求4所述DNA分子的重组载体。

6.一种重组细胞，是将权利要求4所述DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子导入出发细胞得到的。

7.一种抑制HEK-293T细胞增殖的方法，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统降低HEK-293T细胞中miR-374a的水平；所述crispr/cas9系统中，采用权利要求1或2或3所述sgRNA。

8.一种促进A549细胞增殖的方法，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统降低A549细胞中miR-374a的水平；所述crispr/cas9系统中，采用权利要求1或2或3所述sgRNA。

9.特定物质在沉默miR-374a中的应用；

所述特定物质为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)权利要求1或2或3所述sgRNA；

(b)权利要求1或2或3所述sgRNA和编码Cas9蛋白的RNA；

(c)权利要求4所述DNA分子；

(d)权利要求4所述DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子；

(e)权利要求5所述重组载体。

10.特定物质在制备miR-374a水平降低的细胞中的应用；

所述特定物质为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)权利要求1或2或3所述sgRNA；

(b)权利要求1或2或3所述sgRNA和编码Cas9蛋白的RNA；

(c)权利要求4所述DNA分子；

(d)权利要求4所述DNA分子和编码Cas9蛋白的DNA分子；

(e)权利要求5所述重组载体。