CN108642139A - 一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种端粒酶活性检测方法,包括:利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶;利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应,反应产物与信号探针溶液进行杂交反应;用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测。本发明采用超分辨成像技术能够检测到低浓度端粒酶形成的微弱信号,实现了更高灵敏度的端粒酶活性检测;采用Cy5染料修饰的端粒互补序列DNA作为信号探针,获得更高分辨率的图像及更低的检测限;避免了PCR反应过程以及信号扩增过程,大大简化了端粒酶活性检测步骤,同时也提高了检测结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及端粒酶活性检测领域,涉及检测端粒酶活性方法,更为具体的说是涉及一种具体是通过超分辨成像技术检测端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一种特殊结构。端粒和端粒结合蛋白一起在染色体末端形成“帽状”结构,维持染色体的完整和细胞活性。端粒会随着细胞的不断分裂而缩短,这会严重影响细胞的增殖,最终导致细胞凋亡。端粒酶是一种由RNA和蛋白组成的核糖核蛋白,能在染色体末端不断合成端粒序列,从而在细胞分裂过程中维持端粒的长度。正常体细胞中的端粒酶的活性被抑制,然而85%以上的肿瘤细胞显端粒酶活性,因此端粒酶与肿瘤的发生有着密切的关系。端粒酶不仅可以作为癌症早期诊断依据和预后指标,还能够成为癌症治疗的有效靶点。因此,对于端粒酶结构、功能、活性及作用机理的研究具有实际应用价值。
端粒酶的检测方法主要可分为直接引物延伸法和端粒重复序列扩增法(telomeric repeatamplificationprotocol,TRAP)两类。其中端粒重复序列扩增法通过PCR扩增端粒酶合成的端粒序列,由于扩增过程受许多因素影响,在提高检测灵敏度的同时容易造成假阴性的结果。此外还有比色法、化学发光法、表面等离子激元共振法、荧光共振能量转移法等避免了PCR过程的检测端粒酶的方法,他们或多多少存在一些诸如检测灵敏度不够,过程复杂的缺点。因此,具有低检测限,高灵敏度,检测过程简便的端粒酶检测方法亟待提出。
发明内容
为解决上述问题,本发明公开了一种端粒酶活性检测方法,利用超分辨成像超越衍射极限的高空间分辨率能够检测低浓度的端粒酶活性,且无需复杂的信号扩增步骤。
为了达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,包括如下步骤:
第一步,利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶;
第二步,利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应,反应产物与信号探针溶液进行杂交反应;所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物;所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列;
第三步,用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测,根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。信号探针的荧光越强,说明端粒酶活性越高。
进一步的,所述第二步中延伸反应步骤为:取200-300μL捕获探针,与5μL 10mMdNTPs、1-2μL RNA酶抑制剂、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合,于30℃下振荡1-2小时进行端粒延伸反应;所述反应产物与信号探针的杂交反应步骤包括:延伸反应产物以2500-3000转,15分钟离心提纯1次;去除上清后,将沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中,再加入0.3-0.9μL10μM的信号探针进行杂交反应;该混合液30℃振荡2-3小时,以2500g,15min离心提纯,去除上清液,将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中。
进一步的,所述捕获探针的制备方法包括如下步骤:
配制10mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和10mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液,取10-20μL 10μM TS Primer(端粒酶引物,序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中,再分别加入10-20μL EDC溶液和10-20μLNHS溶液,加入50-60μL掺杂FITC(异硫氰酸荧光素)的二氧化硅纳米球溶液,置于摇床中振荡反应12-16小时;将反应物以2500-4000转,15分钟离心1-2次提纯;去除上清,沉淀分散于2mLPBS溶液中,即得到捕获探针。
进一步的,所述掺杂FITC的二氧化硅纳米球的制备方法包括如下步骤:
在1mL无水乙醇中加入0.5-1mg FITC粉末和50-100μL的APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷),涡旋搅拌均匀后于摇床中振荡反应6-8小时后获得FITC-APTMS(偶联了APTMS的FITC),该产物保存于4℃待用;之后,在50mL无水乙醇中加入1-1.5mL去离子水,1.5-2mL98%TEOS(正硅酸四乙酯)和100-120μL的FITC-APTMS,在缓慢搅拌的条件下滴入3-3.5mL 25%氨水,反应3-3.5小时后加入1mL 98%TEOS,继续反应三小时;将反应产物以3000-5000转,15分钟离心3-5次;每次离心后去除上清,将沉淀分散至3mL无水乙醇中,避光保存。
进一步的,所述信号探针为5'-Cy5-CCCTAACCCTAA-3'。
进一步的,所述信号探针的制备方法包括:将5'端修饰了Cy5染料的端粒互补序列的粉末离心后加入PBS溶液即获得10μM的DNA探针溶液。
进一步的,所述第一步具体包括如下过程:将1×106个对数生长期的细胞用冰PBS缓冲液离心清洗若干次后分散至100μLRNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中,冰上孵育一段时间后,将裂解液以12000rpm,20min离心,取出上清即得端粒酶提取物。
进一步的,所述端粒酶引物序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和有益效果:
1、本发明采用超分辨成像技术能够检测到低浓度端粒酶形成的微弱信号,实现了更高灵敏度的端粒酶活性检测。
2、本发明采用Cy5染料修饰的端粒互补序列DNA作为信号探针,Cy5本身就具有进行超分辨成像所需的闪烁特性,信号探针与目标DNA链的可逆杂交及解离过程可以实现单分子定位成像,从而获得更高分辨率的图像及更低的检测限。
3、本发明方法避免了PCR反应过程以及信号扩增过程,大大简化了端粒酶活性检测步骤,同时也提高了检测结果的可靠性。
附图说明
图1是本发明提出的端粒酶活性检测方法示意图;
图2是实施例1中样品的显微成像图,其中(a)、(b)为有端粒酶的样品分别在在绿色(FITC)荧光通道和红色(Cy5)荧光通道中检测到的荧光信号,(c)、(d)为无端粒酶的样品分别在在绿色(FITC)荧光通道和红色(Cy5)荧光通道中检测到的荧光信号;FITC:掺染料的二氧化硅纳米球荧光通道;Cy5:信号探针的荧光通道。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明,应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明采用基于单分子定位(SMLM)的超分辨光学成像技术对端粒酶延伸反应的产物进行检测。利用超分辨率成像的端粒酶活性检测方法无需PCR过程,超分辨率成像突破衍射极限的分辨率,使得这个方法的检测灵敏度明显高于其它方法。
本发明方法主要步骤如下:
第一步,利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶;
第二步,利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应,反应产物与信号探针溶液进行杂交反应;所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物;所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列;
第三步,用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测。
当样品中有端粒酶时,端粒酶将在端粒酶底物上合成并延伸出端粒序列,该序列与Cy5修饰的DNA信号探针杂交,使DNA探针被捕获,清洗后进行成像,在成像时可以分别在两个不同的通道检测到属于二氧化硅纳米球和DNA探针的荧光信号并分别成像,获得重叠的图案。当样品中没有端粒酶时,端粒酶底物上不会延伸出端粒序列,DNA探针不会被捕获,将样品清洗后,成像时样品上不会有属于DNA探针的荧光信号,而依然会检测到二氧化硅纳米球的荧光信号,两者的图像不能重叠。因此,通过观察获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小能够判断端粒酶的活性。DNA信号探针的荧光越强、亮斑越大,则端粒酶活性越高。
以下列举两个实施例来说明本发明方法的优越性。
实施例1
以FITC染料掺杂二氧化硅纳米球制备捕获探针,以Cy5染料修饰端粒互补序列形成DNA信号探针,以人子宫颈癌细胞(HeLa)为待测细胞,利用本发明的方法进行端粒酶活性检测实验。
在实验之前需预先准备捕获探针和信号探针。
一、制备偶联了APTMS的FITC
1mL无水乙醇中加入0.5-1mg FITC粉末和50-100μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)涡旋搅拌均匀后于摇床中振荡反应6-8小时后即可获得偶联了APTMS的FITC(记为FITC-APTMS),反应结束后于冰箱4℃保存。
二、制备掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球
采用种子生长方法制备掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球。在50mL无水乙醇中加入1-1.5mL去离子水,1.5-2mL 98%正硅酸四乙酯(TEOS),120μLFITC-APTMS搅拌均匀,在缓慢搅拌的条件下滴入3-3.5mL 25%氨水,条件不变,反应3-3.5小时后加入1mL 98%TEOS,继续反应三小时。将反应产物以3000-5000转,15分钟离心3-5次,每次离心后去除上清,将沉淀分散至3mL无水乙醇中,锡纸中避光保存。制得粒径为50-150nm的二氧化硅纳米球胶体。
三、制备捕获探针
配制10mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的PBS溶液和10mMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的PBS溶液,取10-20μL 10μM TS Primer(端粒酶引物,序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中,再分别加入10-20μL EDC溶液和10-20μLNHS溶液,摇晃均匀后,加入50-60μL第二步中所获得的掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球乙醇溶液,置于摇床中振荡反应12-16h。将反应产物以2500-4000转,15分钟离心提纯1-2次,去除上清,沉淀分散于2mL PBS溶液中,即可获得修饰了底物的掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球,即捕获探针。
四、准备DNA探针溶液
将买来的5'端修饰了Cy5染料的端粒互补序列的粉末离心后加入PBS溶液获得10μM的DNA探针溶液。
五、端粒酶活性检测实验
首先利用CHAPS法提取细胞中的端粒酶。1×106个对数生长期的细胞(HeLa)用冰PBS缓冲液离心清洗2次后分散至100μLRNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液[10mMTris-HCL,pH 7.5;1mM MgCl2;1mM EGTA;0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF);5mMβ-巯基乙醇;质量分数为0.5%的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS);质量分数为10%的甘油]中,冰上孵育30min后,将裂解液以12000rpm,20min离心,取出上清即得端粒酶提取物,端粒酶提取物于-75℃保存待用。
然后进行端粒酶检测实验,首先进行延伸反应。取200μL第三步所获得的捕获探针,与5μL 10mM dNTPs、1μL RNA酶抑制剂、5μL第五步中得到的端粒酶提取物混合(空白对照组中端粒酶提取物用纯CHAPS裂解液代替),于30℃下振荡1-2h进行端粒延伸反应。反应产物以2500-3000转,15分钟离心提纯,去除上清后,将沉淀分散至200-300μLPBS溶液中,再加入0.3-0.9μL第四步中的DNA探针进行杂交反应。该混合液于30℃振荡2-3h,以2500g,15min离心提纯,去除上清液,将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中,最后进行超分辨成像检测其荧光信号。
加入端粒酶进行反应所获得的杂交产物在绿色(FITC)荧光通道和红色(Cy5)荧光通道中都检测到较强的荧光信号,且在两个通道的荧光图像中的点的位置重叠,两个通道中所分别获得的宽场图像如图2(a,b)所示,两个通道获得的点重合。反应过程中没有加端粒酶的杂交产物仅在绿色通道中检测到荧光信号,在红色荧光通道只有游离的DNA探针产生的微弱的背景信号,说明端粒酶底物没有延伸出端粒序列,不能捕获DNA探针。两个通道中所分别获得的宽场图像如图2(c,d)所示。根据红色通道所获得的荧光图像与绿色通道的荧光图像中点的重合率以及进行单分子定位成像后所获得的红色通道的点的粒径的大小可以进行端粒酶的定量检测。
实施例2
以FITC(异硫氰酸荧光素)染料掺杂二氧化硅纳米球,以Cy5染料修饰端粒互补序列形成DNA探针,以人乳腺癌细胞(SKBR3)为待测细胞,利用本发明的方法进行端粒酶活性检测实验。
一、制备偶联了APTMS的FITC
1mL无水乙醇中加入0.5-1mg FITC粉末和50-100μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)涡旋搅拌均匀后于摇床中振荡反应6-8小时后即可获得偶联了APTMS的FITC(记为FITC-APTMS),反应结束后于冰箱4℃保存。
二、制备掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球
采用种子生长方法制备掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球。在50mL无水乙醇中加入1-1.5mL去离子水,1.5-2mL 98%正硅酸四乙酯(TEOS),100μLFITC-APTMS搅拌均匀,在缓慢搅拌的条件下滴入3-3.5mL 25%氨水,条件不变,反应3-3.5小时后加入1mL 98%TEOS,继续反应三小时。将反应产物以3000-5000转,15分钟离心3-5次,每次离心后去除上清,将沉淀分散至3mL无水乙醇中,锡纸中避光保存。制得粒径为50-150nm的二氧化硅纳米球胶体。
三、制备捕获探针
配制10mM EDC的PBS溶液和10mM NHS的PBS溶液,取10-20μL 10μM TS Primer溶于PBS溶液中,再分别加入10-20μL EDC溶液和10-20μLNHS溶液,摇晃均匀后,加入50-60μL第二步中所获得的掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球乙醇溶液,置于摇床中振荡反应12-16h。将反应产物以2500-4000转,15分钟离心提纯1-2次,去除上清,沉淀分散于2mL PBS溶液中,即可获得修饰了底物的掺杂FITC染料的二氧化硅纳米球,即捕获探针。
四、准备DNA探针溶液
本例中信号探针(即修饰了染料的端粒互补序列)为Cy5染料修饰的5'-Cy5-CCCTAACCCTAA-3'。制备方法为:将买来的5'端修饰了Cy5染料的端粒互补序列的粉末离心后加入PBS溶液获得10μM的DNA探针溶液。
五、端粒酶活性检测实验
首先利用CHAPS法提取细胞中的端粒酶。1×106个对数生长期的细胞(SKBR3)用冰PBS缓冲液离心清洗2次后分散至100μLRNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液[10mMTris-HCL,pH 7.5;1mM MgCl2;1mM EGTA;0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF);5mMβ-巯基乙醇;质量分数为0.5%的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS);质量分数为10%的甘油]中,冰上孵育30min后,将裂解液以12000rpm,20min离心,取出上清即得端粒酶提取物,端粒酶提取物于-75℃保存待用。
然后进行端粒酶检测实验,首先进行延伸反应。取300μL第三步所获得的捕获探针,与5μL 10mM dNTPs、1μL RNA酶抑制剂、5μL第五步中得到的端粒酶提取物混合(空白对照组中端粒酶提取物用纯CHAPS裂解液代替),于30℃下振荡1-2h进行端粒延伸反应。反应产物以2500-3000转,15分钟离心提纯,去除上清后,将沉淀分散至200-300μLPBS溶液中,再加入0.3-0.9μL第四步中的DNA探针进行杂交反应。该混合液于30℃振荡2-3h,以2500g,15min离心提纯,去除上清液,将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中,最后进行超分辨成像检测其荧光信号。
加入端粒酶进行反应所获得的杂交产物在绿色(FITC)荧光通道和红色(Cy5)荧光通道中都检测到较强的荧光信号,且在两个通道的荧光图像中的点的位置重叠。反应过程中没有加端粒酶的杂交产物仅在绿色通道中检测到荧光信号,在红色荧光通道只有游离的DNA探针产生的微弱的背景信号,说明端粒酶底物没有延伸出端粒序列,不能捕获DNA探针。根据红色通道所获得的荧光图像与绿色通道的荧光图像中点的重合率以及进行单分子成像后所获得的红色通道的点的粒径的大小可以进行端粒酶的定量检测。本实施例所获得的成像结果与实施例1中所得图像类似。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段,还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶;
第二步,利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应,反应产物与信号探针溶液进行杂交反应;所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物;所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列;
第三步,用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测,根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。
2.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于,所述第二步中延伸反应步骤为:取200-300μL捕获探针,与5μL 10mM dNTPs、1-2μL RNA酶抑制剂、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合,于30℃下振荡1-2小时进行端粒延伸反应;所述反应产物与信号探针的杂交反应步骤包括:延伸反应产物以2500-3000转,15分钟离心提纯1次;去除上清后,将沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中,再加入0.3-0.9μL10μM的信号探针进行杂交反应;该混合液30℃振荡2-3小时,以2500g,15min离心提纯,去除上清液,将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中。
3.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于,所述捕获探针的制备方法包括如下步骤:
配制10mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和10mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液,取10-20μL 10μM TS Primer(端粒酶引物,序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中,再分别加入10-20μL EDC溶液和10-20μLNHS溶液,加入50-60μL掺杂FITC(异硫氰酸荧光素)的二氧化硅纳米球溶液,置于摇床中振荡反应12-16小时;将反应物以2500-4000转,15分钟离心1-2次提纯;去除上清,沉淀分散于2mLPBS溶液中,即得到捕获探针。
4.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于,所述掺杂FITC的二氧化硅纳米球的制备方法包括如下步骤:
在1mL无水乙醇中加入0.5-1mg FITC粉末和50-100μL的APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷),涡旋搅拌均匀后于摇床中振荡反应6-8小时后获得FITC-APTMS(偶联了APTMS的FITC),该产物保存于4℃待用;之后,在50mL无水乙醇中加入1-1.5mL去离子水,1.5-2mL 98%TEOS(正硅酸四乙酯)和100-120μL的FITC-APTMS,在缓慢搅拌的条件下滴入3-3.5mL 25%氨水,反应3-3.5小时后加入1mL 98%TEOS,继续反应三小时;将反应产物以3000-5000转,15分钟离心3-5次;每次离心后去除上清,将沉淀分散至3mL无水乙醇中,避光保存。
5.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于:所述信号探针为5'-Cy5-CCCTAACCCTAA-3'。
6.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于:所述信号探针的制备方法包括:将5'端修饰了Cy5染料的端粒互补序列的粉末离心后加入PBS溶液即获得10μM的DNA探针溶液。
7.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于:所述第一步具体包括如下过程:将1×106个对数生长期的细胞用冰PBS缓冲液离心清洗若干次后分散至100μL RNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中,冰上孵育一段时间后,将裂解液以12000rpm,20min离心,取出上清即得端粒酶提取物。
8.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法,其特征在于:所述端粒酶引物序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
CN112592963A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-04-02 | 东南大学 | 一种端粒和着丝粒超分辨成像方法及其探针 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103529023A (zh) * | 2013-10-11 | 2014-01-22 | 东南大学 | 一种端粒酶活性检测方法 |
CN107723342A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-02-23 | 东南大学 | 一种端粒探针及其制备方法和应用 |
-
2018
- 2018-05-21 CN CN201810490109.6A patent/CN108642139A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103529023A (zh) * | 2013-10-11 | 2014-01-22 | 东南大学 | 一种端粒酶活性检测方法 |
CN107723342A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-02-23 | 东南大学 | 一种端粒探针及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BRIAN J. BELIVEAU等: "Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
谢春娟等: "新型 FITC 掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子的合成及其应用于pH 传感的研究", 《分析化学》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112592963A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-04-02 | 东南大学 | 一种端粒和着丝粒超分辨成像方法及其探针 |
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