CN108635587A - 一种石墨烯槲皮素复合物和制备方法及其在抗肿瘤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种还原氧化石墨烯槲皮素复合物和制备方法及其在抗肿瘤中的用途，该还原氧化石墨烯槲皮素复合物是以由维生素C还原的氧化石墨烯作为药物载体材料，槲皮素通过π‑π共轭作用和氢键结合作用负载于载体材料上，形成还原氧化石墨烯槲皮素复合物。所得复合物的载药率高，生物相容性好，改善口服吸收利用度，对今后开发抗肿瘤用槲皮素制剂有重大意义。

Description

一种石墨烯槲皮素复合物和制备方法及其在抗肿瘤中的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种石墨烯槲皮素复合物和制备方法及其在抗肿瘤中的用途。

背景技术

槲皮素，又名栎精、槲皮黄素，能溶于冷乙醇(1:290)，易溶于热乙醇(1:23)，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水，味苦。可作为药品。

式1：槲皮素结构式

槲皮素是一种天然的黄酮醇类化合物，存在于多种植物的花、叶和果实中。如存在于洋葱、辣椒、胡椒、花菜、小茴香、甘蓝、菠菜、可可豆、杏、苹果、葡萄、银杏、山楂等食用蔬菜和水果中；烟叶、茶叶、荞麦、红酒等中也含有槲皮素；许多中草药如槐米、金荞麦、紫花杜鹃、小叶枇杷、鱼腥草、照山白、银杏叶、红花、金银花、沙棘、菟丝子、高良姜、连翘、番石榴叶、地锦草、满山红、三七、柴胡、蒲公英等都含有槲皮素。

研究表明，槲皮素具有多方面的药理作用。具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用，用于治疗慢性支气管炎。此外，槲皮素具有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、改善毛细血管通透性、降低胆固醇、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量、改善脑循环等作用。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。槲皮素还具有明显增强免疫功能、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗耐药性、止腹泻、镇痛作用；抗炎、抗心肌损伤、抗DNA 损伤、保护肝脏和肾脏、提高免疫能力、增强心肌收缩力、舒张肠平滑肌、免疫抑制、抗过敏、抗粘附、抗血栓、抗病毒以及免疫调节作用。自由基与多种慢性疾病的发生有关，如与牙龈炎、消化性溃疡、慢性阻塞性肺疾病、癌症等的发生有密切关系。研究表明，槲皮素具有较强的抗氧化和自由基清除功能，它能有效地阻止环境中致癌物在人体内的活化，从而防止潜在的致癌物成为最终的致癌物，加快致癌物在人体内的降解，并促进其排出；还能诱导肿瘤细胞的分化，促进肿瘤细胞的凋亡。国外已将其作为抗癌药物应用于临床。

石墨烯由单层碳原子排列组合而成，是世界上最薄的二维材料。近几年，石墨烯作为一种新兴的研究热点，其结构、理化性质、制备方法和应用的研究文章纷纷见诸各学科的高端杂志，对于探究石墨烯的性质及应用起到极大的推动作用。

自以聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为疏水性药物载体的第一篇研究论文发表以来，由于氧化石墨烯具有以sp2杂化的平面结构,以及存在多种含氧基团，如羟基、羰基、环氧基和羧基等，比表面积大，两面均能修饰，载药量高，亲水性良好，表面功能化可调剂，具有光热效应的优点，已成为优良的药物递送载体材料。通过氧化石墨烯还原处理制得的还原氧化石墨烯由于结构中sp2链接的π-π结构有所恢复，使得载药量提高，光热效应增强。

式2：氧化石墨烯(A)和还原氧化石墨烯(B)

发明内容

槲皮素在水溶液中溶解度低，口服吸收率低，口服给药吸收无法达到有效血药浓度，因此，将槲皮素进行必要的结构修饰，增加其水溶液的溶解度，解决口服吸收利用率低的问题，并可以减少对正常组织的毒副作用。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种还原氧化石墨烯槲皮素复合物，以还原氧化石墨烯作为载体材料，槲皮素通过π-π共轭和氢键结合作用负载于载体再来上，形成纳米级还原氧化石墨烯-槲皮素复合物。

进一步地，还原氧化石墨烯槲皮素复合物中槲皮素的载药量为53％～75％。

进一步地，还原氧化石墨烯由维生素C对氧化石墨烯进行还原反应制备而得，其中所用氧化石墨烯的粒径范围为400～700nm。

进一步地，所述还原氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨烯加入适量水得到氧化石墨烯的胶体溶液，然后加入还原剂，将氧化石墨烯进行还原，制备得到还原氧化石墨烯。其中，所述还原剂优选维生素C。

本发明还提供了一种还原氧化石墨烯槲皮素复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤(1)，氧化石墨烯的还原：将氧化石墨烯加适量水，制成0.1～1mg/ml氧化石墨烯胶体水溶液，加入维生素C，50～80℃下加热反应1～2小时，加入20％(w/v)氯化钠溶液，搅拌，0℃下静置1～2小时，过滤，将沉淀在水中洗涤两次后减压干燥，得还原氧化石墨烯；

步骤(2)，槲皮素负载：将含有5％的DMSO的还原氧化石墨烯水溶液5ml与5％DMSO的槲皮素乙醇水溶液5ml混合均匀，超声震荡，30～37℃条件下反应36～48小时，之后离心分离，沉淀物用少量去离子水洗后减压干燥即得。

进一步地，步骤(1)氧化石墨烯的还原可为一次还原，也可为多次还原。优选地，还原 1～3次。

进一步地，步骤(1)中，氧化石墨烯所制成的水溶液浓度为0.1～0.5mg/ml。

进一步地，步骤(1)中，维生素C与氧化石墨烯的质量比为10:1～20:1。

进一步地，步骤(2)中，还原氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1～1.0mg/ml。

进一步地，步骤(2)中，槲皮素乙醇水溶液的浓度为0.1～0.5％。

进一步地，步骤(2)中槲皮素乙醇水溶液的溶剂配比为60:40～40～60。

进一步地，步骤(2)中离心频率为5000～10000rpm，离心时间为0.5～2小时。

本发明还提供了还原氧化石墨烯槲皮素复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明中氧化石墨烯(GO)的制备方法包括以下步骤：

天然石墨预氧化：取1g市售的天然石墨薄片、1.5ml浓硫酸、0.5g过硫酸钾及0.5g五氧化二磷混合加热至80℃，孵育6小时。将得到的氧化石墨烯用蒸馏水反复过滤，直至滤液为中性，在室温下晾干。

氧化石墨的制备：将1g预氧化的石墨与25ml浓硫酸或浓硝酸混合，在冰水混合物搅拌条件下缓慢加入3g高锰酸钾，之后将温度由20℃升高至35℃，保温搅拌2小时。加入约50ml 蒸馏水，继续搅拌半小时，之后加入约150ml蒸馏水。接着，往反应液中加入30％双氧水2ml，将混合物用10％盐酸250ml离心清洗以除去多余的金属离子。得到的沉淀用蒸馏水反复离心清洗至溶液呈中性。

氧化石墨的剥离及纯化：为了剥离得到片状氧化石墨烯，往装有氧化石墨的离心管中加入40ml蒸馏水，细胞粉碎仪400W超声30分钟。将其13000rpm离心15分钟，收集上清液，沉淀再次加入蒸馏水后，反复超声剥离，最后将获得的氧化石墨烯用超纯水透析48小时(透析袋为8000-14000Da)，以除去剩余的无机离子，最终获得氧化石墨烯分散液。

纳米级氧化石墨烯的制备：将已经制备的氧化石墨烯分散液超声一小时，使其进一步分散，然后将分散的氧化石墨烯用直径为0.45μm过滤膜过滤，取滤液，用8000到14000Da的透析袋透析24小时，进一步出去分散液中少量的无机离子得到纳米级氧化石墨烯。

综合以上，本发明具有如下技术效果：‘

1)本发明采用还原氧化石墨烯作为药物载体，使得还原氧化石墨烯槲皮素复合物的生物相容性大大提高。

2)本发明中，槲皮素通过与还原氧化石墨烯通过π-π共轭作用和氢键作用紧密结合，使得槲皮素的在水溶液中的溶解度显著提高，制成口服制剂口服吸收显著改善。

3)槲皮素与还原氧化石墨烯的结合作用良好，载药量高达53％～75％。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

步骤(1)，氧化石墨烯的还原：取0.1g氧化石墨烯，加入到1L去离子水中，搅拌溶解得到0.1mg/ml氧化石墨烯胶体溶液，加入1g维生素C，80℃下加热反应1小时，加入20％(w/v)氯化钠溶液，搅拌，0℃下静置1～2小时，过滤，将沉淀在水中洗涤两次后减压干燥，得还原氧化石墨烯；

步骤(2)，槲皮素负载：将根据步骤(1)方法制备得到的还原氧化石墨烯溶于含5％的 DMSO水溶液中制备得到含0.1g/ml的氧化氧化石墨烯溶液，取5ml，取浓度为0.5％的的槲皮素溶液(溶剂为乙醇:水:DMSO＝55:40:5)5ml，混合均匀，超声震荡，37℃条件下反应36小时，之后离心分离，沉淀物用少量去离子水洗后减压干燥即得。

经测试，槲皮素载药量75％，还原氧化石墨烯槲皮素复合物溶解度4.3mg/ml。

实施例2

步骤(1)，氧化石墨烯的还原：取0.6g氧化石墨烯，加入到1L去离子水中，搅拌溶解得到0.6mg/ml氧化石墨烯胶体溶液，加入12g维生素C，50℃下加热反应2小时，加入20％(w/v)氯化钠溶液，搅拌，0℃下静置1～2小时，过滤，将沉淀在水中洗涤两次后减压干燥，得还原氧化石墨烯；

步骤(2)，槲皮素负载：将根据步骤(1)方法制备得到的还原氧化石墨烯溶于含5％的 DMSO水溶液中制备得到含0.5g/ml的氧化氧化石墨烯溶液，取5ml，取浓度为0.1％的的槲皮素乙溶液5ml，混合均匀，超声震荡，30℃条件下反应48小时，之后离心分离，沉淀物用少量去离子水洗后减压干燥即得。

经测试，槲皮素载药量53％，还原氧化石墨烯槲皮素复合物溶解度为3.7mg/ml

实施例3

步骤(1)，氧化石墨烯的还原：将1g氧化石墨烯加入1L去离子水，制成1mg/ml氧化石墨烯胶体溶液，加入15g维生素C，50～80℃下加热反应1～2小时，加入20％(w/v)氯化钠溶液，搅拌，0℃下静置1～2小时，过滤，将沉淀在水中洗涤两次后减压干燥，得还原氧化石墨烯；

步骤(2)，槲皮素负载：将根据步骤(1)方法制备得到的还原氧化石墨烯溶于含5％的 DMSO水溶液中制备得到含0.3g/ml的氧化氧化石墨烯溶液，取5ml，取浓度为0.3％的的槲皮素乙溶液5ml，混合均匀，超声震荡，35℃条件下反应40小时，之后离心分离，沉淀物用少量去离子水洗后减压干燥即得。

经测试，槲皮素载药量为67％，还原氧化石墨烯槲皮素复合物溶解度为5.1mg/ml。

槲皮素的载药量测定

分别取100μl还原氧化石墨烯，加入400μl水，随后加入20、30、40、60、80μl溶于DMSO 的槲皮素(1mg/ml)，用DMSO补足至1ml，搅拌过夜，用超滤管去除游离的槲皮素，使用紫外分光光度计法计算最终的槲皮素载药量。

在本发明中，通过使用紫外光谱法对还原氧化石墨烯-槲皮素进行了测定，通过测定还原氧化石墨烯的吸光度值，然后根据槲皮素的标准曲线，计算最终的槲皮素载药量。结果发现，载药量与两个因素呈正相关，一方面是还原氧化石墨烯的还原程度，另一方面是槲皮素的加入量。当还原氧化石墨烯的还原程度一定的情况下，在一定的槲皮素浓度范围内，还原氧化石墨烯对槲皮素的吸收率随着槲皮素的浓度上升而增加，呈线性相关，知道载体对槲皮素的吸附达到饱和。当加入过量的槲皮素的情况下，还原氧化石墨烯的还原程度越高，还原次数越多，载药量越高。因此通过控制加入槲皮素的浓度以及控制氧化石墨烯的还原程度和还原次数，可以控制载体还原氧化石墨烯对槲皮素的吸附量。

此外，药物的溶解性是影响药物生物利用度的重要因素之一，槲皮素因在水中的溶解度小，难以被机体吸收，口服生物利用度差，从而限制了其在临床上充分发挥疗效。本发明还测定了还原氧化石墨烯槲皮素复合物的溶解度，发现该复合物相较于槲皮素原型药物水溶性大大提高，对于开发口服给药的抗癌药物有极大帮助。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种还原氧化石墨烯槲皮素复合物，其特征在于，以还原氧化石墨烯作为载体材料，槲皮素通过π-π共轭和氢键结合作用负载于载体材料上，形成还原氧化石墨烯槲皮素复合物。

2.根据权利要求1所述的还原氧化石墨烯槲皮素复合物，其特征在于，所述还原氧化石墨烯槲皮素复合物的载药量为53%~75%。

3.根据权利要求1所述的还原氧化石墨烯槲皮素复合物，其特征在于，所述还原氧化石墨烯由维生素C对氧化石墨烯进行还原反应制备而得，其中所用氧化石墨烯的粒径范围为400~700nm。

4.一种还原氧化石墨烯槲皮素复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）氧化石墨烯的还原：将氧化石墨烯加适量水，制成0.1~1mg/ml水溶液，加入维生素C，50~80℃下加热反应1~2小时，加入20%（w/v）氯化钠溶液，搅拌，0℃下静置1~2小时，过滤，将沉淀在水中洗涤两次后减压干燥，得还原氧化石墨烯；

（2）槲皮素负载：将含有5%的DMSO的还原氧化石墨烯水溶液5ml与5%DMSO的槲皮素乙醇水溶液5ml混合均匀，超声震荡，30~37℃条件下反应36~48小时，之后离心分离，沉淀物用少量去离子水洗后减压干燥即得。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，氧化石墨烯所制成的水溶液浓度为0.1~0.5mg/ml。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，维生素C与氧化石墨烯的质量比为10:1~20:1。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，还原氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1~1.0mg/ml，槲皮素乙醇水溶液的浓度为0.1~0.5%，槲皮素乙醇水溶液的溶剂配比为60:40~40~60。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中离心频率为5000~10000rpm，离心时间为0.5~2小时。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中氧化石墨烯的还原步骤可重复1-3次。

10.权利要求1至3任一项所述原氧化石墨烯槲皮素复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。