CN108619575A - 一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法 - Google Patents

一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法。首先将硅酸钠、丙烯酰胺、交联剂和海藻酸钠溶解于水中得到铸膜液A，在铸膜液A中溶解生长因子得到的铸膜液B。在A玻璃板上用缠绕铜丝的玻璃棒将铸膜液A刮均匀，然后立即在铸膜液A上倒入铸膜液B，并马上用用缠绕铜丝的玻璃棒将铸膜液B刮均匀。通氮气排氧后紫外灯照射引发丙烯酰胺聚合，然后经过钙离子水溶液交联和葡萄糖酸‑δ‑内酯水溶液浸泡，得到表层含生长因子的高强度水凝胶膜。洗脱掉生长因子后，得到可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。

Description

一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备 方法
技术领域
本发明涉及一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法，属于生物材料和组织工程领域。
背景技术
组织工程的核心是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程的三要素包括种子细胞、基质材料和调节因子。骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源广泛、取材简便、易于培养、具有较强增殖能力和多向分化潜能，被公认为最理想最有应用前景的种子细胞，已广泛应用于软骨、肌肉和骨组织工程。同时提高种子细胞的粘附、增殖和定向分化能力是目前组织工程研究的一个热点。纤连蛋白(FN)可促进BMSCs在材料上的粘附生长，使BMSCs形态结构良好，代谢增强，生长时间缩短，并提高细胞融合率。在材料表面涂覆FN，从而构建“仿生”细胞外基质环境，可提高材料的生物相容性和细胞的粘附。然而，表面涂层多为单纯物理吸附或包埋，存在吸附不牢的缺点，且FN容易变性失活。采用外源性生长因子效率低，持续时间短，需反复给药；而基因转染存在转化率不稳定、表达基因单一、安全性差等问题。如何有效保护并缓慢释放生长因子是组织工程研究急需解决的问题。目前主要利用可与生长因子产生相互作用的材料共混、包埋及化学键合等方法控制释放生长因子，但是仍面临释放机制不明确、突释效应、多种生长因子协同释放困难、制备过程引起生长因子失活等难题。
过去组织工程支架通常从材料学的角度设计，而不是从生物学角度考虑如何使植入材料整合重建组织，常因细胞利用率低、支架降解导致的纤维化、排异和炎性反应等因素达不到预期修复效果。为适应组织工程的要求，需要从仿生角度设计支架，使支架材料不仅为细胞提供结构支撑，还要具有一定的功能，为细胞提供特殊的信号，促使细胞生长和分化，从而形成具有特定功能的新生组织。天然生物材料来源广泛、无毒、生物相容性和生物可降解性良好，但是其加工提取困难、力学性能不佳，限制了其在组织工程中的应用。人工合成的无机材料化学性质稳定，生物相容性好，但降解速率慢，部分降解产物不易被机体吸收、力学性能差。人工合成的有机高分子材料降解可控，但是材料表面缺乏细胞识别信号，不利于细胞的特异性粘附和特异基因的激活。
水凝胶与许多组织和细胞外基质非常接近，表现出良好的生物相容性，放入体内不会引发排异反应，同时为营养物质运输和代谢废物的排出提供良好通道。水凝胶可作为永久的软组织损伤替代物，或者作为细胞培养基质材料。但是大部分水凝胶的弹性和韧性都不好，限制了其应用。2012年，Nature杂志报道了高弹性和高韧性的聚丙烯酰胺/海藻酸钙(PAM/CaAlg)水凝胶。虽然这种水凝胶中约90％是水，但其弹性超强，可拉伸到原有长度的20倍，之后还能够自行恢复原状。它的韧性也很好，把水凝胶掰断需要耗费的能量与掰断一块相同大小的天然橡胶差不多【Nature，2012，489(7414)：133-136】。Bakarich等采用3D打印技术，制备了纤维增强的PAM/CaAlg水凝胶人工关节软骨。但是水凝胶的亲水性表面不利于蛋白质的吸附以及细胞的粘附生长【ACS Applied Materials&Interfaces，2014，6(18)：15998-16006】。Guo等用纤连蛋白(FN)对PAM/CaAlg水凝胶进行预处理，促进了人骨髓间充质干细胞在水凝胶上的粘附和增殖【Materials Science and Engineering C，2014，42：622-628】。
分子印迹技术是从仿生角度出发，制备在空间结构和结合位点上与模板分子相匹配，从而对模板分子具有专一识别特性的聚合物(分子印迹聚合物molecular imprintedpolymer，MIP)的技术。MIP具有预定性、识别性和实用性的特点。相比天然抗体，MIP表现出稳定性高和使用寿命长的特点，可抗恶劣环境，且制备过程简单。利用分子印迹技术可以制备促进细胞粘附的仿生材料。Pan等采用分子印迹技术合成了对细胞粘附肽RGDS具有温度响应性识别能力的分子印迹水凝胶，通过特异性分子识别作用将RGDS结合在其表面，可促进细胞粘附和增殖【Angewandte chemie 2013，52(27)：6907-6911】。分子印迹技术构建了与模板相互补的孔穴和结合位点，两者的协同作用可以实现对目标分子的控制释放。
在生理环境下，上述PAM/CaAlg双网络水凝胶中的交联离子被释放出来，使凝胶的力学性能迅速下降。若在双网络水凝胶中引入具有自我修复功能的非共价相互作用，如氢键、静电力、疏水作用和纳米效应，将有助于制备稳定的高强度水凝胶。柳明珠等将二氧化硅引入PAM/CaAlg水凝胶中，提高了该双网络凝胶的断裂应力和杨氏模量【ChemicalEngineering Journal，2014，240(6)：331-337】。Kim等人利用介孔分子筛与聚合物之间存在的范德华力和氢键作用，得到了可在生理溶液中较长时间保持力学性能的PAM/CaAlg杂化水凝胶。Nature期刊报道Tiller等通过酶引发在双网络水凝胶中形成了均匀分散的纳米磷酸钙，使水凝胶的弹性模量达到了440MPa，远高于软骨【Nature，2017，543(7645)：407-410】。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是水凝胶不能识别和缓释生长因子，常规水凝胶机械性能差，不能在生理环境下保持高强度的问题。
本发明解决所述水凝胶不能识别和缓释生长因子，常规水凝胶机械性能差，不能在生理环境下保持高强度的问题的技术方案是提供一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法。
本发明提供了一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法。首先将硅酸钠、丙烯酰胺、交联剂和海藻酸钠溶解于水中得到铸膜液A，在铸膜液A中溶解生长因子得到的铸膜液B。在A玻璃板上用缠绕铜丝的玻璃棒将铸膜液A刮均匀，然后立即在铸膜液A上倒入铸膜液B，并马上用缠绕铜丝的玻璃棒将铸膜液B刮均匀。通氮气排氧后紫外灯照射引发丙烯酰胺聚合，然后经过钙离子水溶液交联和葡萄糖酸-δ-内酯水溶液浸泡，得到表层含生长因子的高强度水凝胶膜。洗脱掉生长因子后，得到可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。该制备方法简单，没有引入任何有毒试剂，材料具有良好的生物相容性。
本发明提供了一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)称取0.005-2g硅酸钠，5-15g丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将生长因子溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；
b)配制质量百分比为0.5％-50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为10-500μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1-24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成离子交联的海藻酸钙水凝胶交联网络，同时可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％-10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中0.1-12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；
f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用洗脱溶液洗脱掉生长因子后，得到可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。
本发明所述的可溶性钙盐水溶液为硝酸钙、氯化钙、磷酸二氢钙、硫酸钙水溶液中的任意一种或两种以上混合物；所述的生长因子为转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子的任意一种；所述的洗脱溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水、SDS-醋酸缓冲溶液、胃蛋白酶水溶液、硼酸缓冲溶液中的任意一种。
具体实施方式
下面介绍本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。
实施例1.
a)称取2g硅酸钠，15g丙烯酰胺，2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将转化生长因子溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；
b)配制质量百分比为10％的硝酸钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为500μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的硝酸钙水溶液中，浸泡24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，硝酸钙与海藻酸钠反应生成离子交联的海藻酸钙水凝胶交联网络，同时硝酸钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；
f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用磷酸盐缓冲溶液洗脱掉转化生长因子后，得到可缓释转化生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。
实施例2.
a)称取0.005g硅酸钠，5g丙烯酰胺，0.5g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将表皮生长因子溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；
b)配制质量百分比为50％的氯化钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为10μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的氯化钙水溶液中，浸泡0.1h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，氯化钙与海藻酸钠反应生成离子交联的海藻酸钙水凝胶交联网络，同时氯化钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中2h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；
f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用Tris-HCl缓冲溶液洗脱掉表皮生长因子后，得到可缓释表皮生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。
实施例3.
a)称取1g硅酸钠，8g丙烯酰胺，1g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.10％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于80ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将胰岛素样生长因子溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；
b)配制质量百分比为10％的磷酸二氢钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比2％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比2％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.5％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为500μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为200μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射10min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的磷酸二氢钙水溶液中，浸泡12h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，磷酸二氢钙与海藻酸钠反应生成离子交联的海藻酸钙水凝胶交联网络，同时磷酸二氢钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为2％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中5h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；
f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用胃蛋白酶水溶液洗脱掉胰岛素样生长因子后，得到可缓释胰岛素样生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。
实施例4.
a)称取0.5g硅酸钠，6g丙烯酰胺，2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.10％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于60ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将神经生长因子溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；
b)配制质量百分比为1％的硫酸钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.02％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为200μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为50μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射10min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的硫酸钙水溶液中，浸泡8h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，硫酸钙与海藻酸钠反应生成离子交联的海藻酸钙水凝胶交联网络，同时硫酸钙与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为2％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中4h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；
f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用SDS-醋酸缓冲溶液洗脱掉神经生长因子后，得到可缓释神经生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。

Claims (4)

1.一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)称取0.005-2g硅酸钠，5-15g丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将生长因子溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；
b)配制质量百分比为0.5％-50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为10-500μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1-24h，在浸泡过程中将凝胶膜从玻璃板上揭下来，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成离子交联的海藻酸钙水凝胶交联网络，同时可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；
e)在无菌条件下，配制质量百分比浓度为0.1％-10％的葡萄糖酸-δ-内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸-δ-内酯水溶液中0.1-12h，葡萄糖酸-δ-内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；
f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用洗脱溶液洗脱掉生长因子后，得到可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜。
2.如权利要求1所述的一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法，其特征是所述的可溶性钙盐水溶液为硝酸钙、氯化钙、磷酸二氢钙、硫酸钙水溶液中的任意一种或两种以上混合物。
3.如权利要求1所述的一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法，其特征是所述的生长因子为转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子的任意一种。
4.如权利要求1所述的一种可缓释生长因子的表层分子印迹高强度水凝胶膜的制备方法，其特征是所述的洗脱溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水、SDS-醋酸缓冲溶液、胃蛋白酶水溶液、硼酸缓冲溶液中的任意一种。
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