CN108619514B - 一种复合Au纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

一种复合Au纳米粒子及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种复合Au纳米粒子的制备方法，涉及材料化学与生物纳米医药领域。本发明的制备方法包括以下步骤：(1)将AlCl3、UCNPs与乙醚混合，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液；(2)将氨水滴加到所述步骤(1)得到的UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液中，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构；(3)将所述步骤(2)得到的UCNP@Al(OH)3核壳结构与阿仑膦酸钠和HAuCl4混合进行沉淀反应，得到沉淀产物；(4)将所述步骤(3)得到的沉淀产物与还原剂混合发生氧化还原反应，得到UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子。本发明提供的复合Au纳米粒子具有优异的水溶性，同时具有高效光热性能。

Description

一种复合Au纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于材料化学与生物纳米医药领域，具体涉及一种复合Au纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的新型诊疗技术作为当前肿瘤治疗领域的研究热点，尤其是以光热疗法(Photothermal Therapy，PTT)等为代表的新型非侵入型治疗方法在肿瘤治疗领域具有非常大的潜力。但是传统的光热治疗材料的吸收光谱在紫外可见光区，对于深层组织的肿瘤就没有办法实现较好的治疗效率，为此人们引入了多种具有近红外光吸收能力的纳米材料来用于深层组织肿瘤的光热治疗研究中。比如上转换纳米粒子、半导体量子点和金纳米材料等。金纳米材料因其材料物化性能稳定、光热效率较高和制备方法简便，也受到了人们的广泛研究；但现有技术中的金纳米材料水溶性差、光热效率有待进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复合Au纳米粒子及其制备方法与应用，该复合Au纳米粒子具有很好的水溶性，同时具有高效光热性能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种复合Au纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将AlCl3、UCNPs与乙醚混合，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液；
(2)将氨水滴加到所述步骤(1)得到的UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液中发生复分解反应，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构；
(3)将所述步骤(2)得到的UCNP@Al(OH)3核壳结构与阿仑膦酸钠和HAuCl4混合进行沉淀反应，得到沉淀产物；
(4)将所述步骤(3)得到的沉淀产物与还原剂混合发生氧化还原反应，得到UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子。
优选地，所述步骤(1)中UCNPs与AlCl3的摩尔比为1～5：1～10；所述步骤(3)中UCNP@Al(OH)3核壳结构用量以制备UCNP@Al(OH)3核壳结构所用UCNPs的量计，所述UCNPs与阿仑膦酸钠和HAuCl4的摩尔比为1～5：0.05～0.8：0.0096～0.0525。
优选地，所述氨水与AlCl3的用量比为0.008～0.12g：1～10mmol。
优选地，所述HAuCl4与还原剂的用量比为0.0096～0.0525mmol：0.00025～0.1g。
优选地，所述步骤(4)中还原剂为聚乙烯亚胺、柠檬酸钠或硼氢化钠。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的复合Au纳米粒子，所述Au纳米粒子的粒径为9～17nm，所述复合Au纳米粒子具有核壳结构，核为UCNPs，壳为氢氧化铝，所述Au纳米粒子负载在氢氧化铝壳层表面。
本发明还提供了上述技术方案所述复合Au纳米粒子在制备应用于生物组织的荧光检测、成像、示踪或生物分子的定位、检测、成像试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述复合Au纳米粒子在制备光热治疗抗肿瘤药物中的应用。
优选地，包括以下步骤：将复合Au纳米粒子与NHS-PEG-NHS和cRGD混合，所述UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD的用量比为0.001～0.004mmol：0.005～0.02g：0.015～0.05g，得到UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子。
本发明还提供了一种UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子，由包括以下组分的原料制备得到：UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS和cRGD，所述UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD的用量比为0.001～0.004mmol：0.005～0.02g：0.015～0.05g。
本发明提供了一种复合Au纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：(1)将AlCl3、UCNPs与乙醚混合，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液；(2)将氨水滴加到所述步骤(1)得到的UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液中发生复分解反应，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构；(3)将所述步骤(2)得到的UCNP@Al(OH)3核壳结构与阿仑膦酸钠和HAuCl4混合进行沉淀反应，得到沉淀产物；(4)将所述步骤(3)得到的沉淀产物与还原剂混合发生氧化还原反应，得到UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子。本发明采用氨水水解氯化铝，在UCNPs粒子表面引入Al(OH)3亲水层，一方面赋予UCNPs纳米粒子较好的水溶性，同时Al(OH)3裸露的大量的羟基很容易与阿仑膦酸钠的双磷酸根结合，阿伦磷酸钠引入后，利用阿伦磷酸钠中氨基与氯金酸之间强的作用力便于原位还原氯金酸得到金纳米颗粒，从而构建UCNP@Al(OH)3/Au。另一方面无机Al(OH)3亲水层在一定程度上还可以有效保护UCNPs的上转换发光，降低水对上转换发光的淬灭效应，提高复合Au纳米粒子的光热性能。从实施例可以看出，本发明提供的复合Au纳米粒子在水中有较好的分散性、结构稳定性和较高的近红外光热转换效率，在细胞水平和活体水平上有显著的光热治疗效果。
附图说明
图1中：(a)、(b)和(c)分别为UCNPs、UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au的TEM图；(d)、(e)和(f)分别为UCNPs、UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au的粒径统计数据及三种纳米粒子在水中分散的光学照片；
图2为UCNPs、UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au的XRD测试结果；
图3中：(a)为Au、UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au的紫外可见吸收图谱以及UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au的荧光光谱；(b)为UCNPs，UCNP@Al(OH)3，UCNP@Al(OH)3/Au和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD的红外光谱；(c)为UCNP@Al(OH)3/Au的元素分布图；
图4中：(a)为UCNP@Al(OH)3、UCNP@Al(OH)3/Au和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子的的细胞毒性实验结果；(b)为纳米粒子UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD、UCNP@Al(OH)3/Au和UCNP@Al(OH)3及PBS和Water的溶血实验结果；(c)为PBS、UCNP@Al(OH)3-cRGD和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子的细胞980nm(0.5W/cm2)光热治疗测试结果；(d)为Water和纳米粒子UCNP@Al(OH)3/Au的980nm(1W/cm2)的光热升温实验结果；
图5中：(a)为U87-MG细胞用UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子孵育24小时后的激光共聚焦测试；(b)和(c)分别为980nm(0.5W/cm2)激光照射后小鼠肿瘤部位光热成像结果和活体荧光成像结果(Emission＝540nm绿色发射光)。
具体实施方式
在本发明中，所述UCNPs为稀土上转换发光纳米材料；所述cRGD为环状缬氨酸-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸-谷氨酸多肽；所述NHS-PEG-NHS为分子量为5000的琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯。
本发明提供了一种复合Au纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将AlCl3、UCNPs与乙醚混合，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液；
(2)将氨水滴加到所述步骤(1)得到的UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液中发生复分解反应，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构；
(3)将所述步骤(2)得到的UCNP@Al(OH)3核壳结构与阿仑膦酸钠和HAuCl4混合进行沉淀反应，得到沉淀产物；
(4)将所述步骤(3)得到的沉淀产物与还原剂混合发生氧化还原反应，得到UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子。
本发明将AlCl3、UCNPs与乙醚混合，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液。在本发明中，所述UCNPs与AlCl3的摩尔比优选为1～5mmol：1～10mmol，更优选为1.5～2.5mmol：2.5～4mmol，最优选为1.8～2.3mmol：2.8～3.2mmol。在本发明中，所述UCNPs表面吸附AlCl3在乙醚中的浓度优选为0.01～0.1mol/L，更优选为0.05～0.08mol/L，最优选为0.06～0.07mol/L。
在本发明的实施例中，优选先分别配制UCNPs乙醚溶液和AlCl3乙醚溶液，将AlCl3乙醚溶液与UCNPs乙醚溶液混合，固液分离，沉淀重新分散在乙醚中，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液。在本发明中，所述UCNPs乙醚溶液的浓度优选为0.05～0.1mol/L，更优选为0.06～0.09mol/L，最优选为0.07～0.08mol/L。在本发明中，所述AlCl3乙醚溶液的浓度优选为0.2～0.5mol/L，更优选为0.25～0.45mol/L，最优选为0.30～0.40mol/L。在本发明中，所述UCNPs乙醚溶液与AlCl3乙醚溶液的体积比优选为20～50：5～20，更优选为25～40：8～15，最优选为28～32：10～13。
本发明对所述固液分离的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可。
在本发明中，所述UCNPs的制备方法采用本领域技术人员熟知的制备方法即可，具体的，在实施例中优选包括以下步骤：
(a)将0.64～1.28mmol YCl3·6H2O、0.14～0.28mmol GdCl3·6H2O、0.18～0.36mmol YbCl3·6H2O和0.04～0.08mmol ErCl3·6H2O与4mL溶剂混合，得到盐溶液，所述溶剂为水或甲醇；
将上述盐溶液与7.5～15mL油酸、19～30mL十八烯混合，得到混合反应液；对混合反应液进行30min氮气置换，将混合反应液缓慢升至120℃进行除水除氧，然后升温到150～160℃，搅拌溶解1h，此时混合反应液变为淡黄色澄清透明溶液，停止加热并自然冷却到室温；
(b)将4～8mmol NH4F、2.5～5mmol NaOH与5～10mL甲醇溶液混合，得碱混合液，快速超声溶解开后，加入到所述步骤(a)得到的混合液中，常温下通入氮气并搅拌30min，然后升温到50℃搅拌30min，通入氮气条件下，继续升温到70～100℃并保持15min，除去溶液中的甲醇溶剂，然后快速升温至290℃并搅拌1.5h，然后停止加热，在氮气保护下自然冷却到室温；
(c)按体积比1：1的比例将无水乙醇与所述步骤(b)得到的混合溶液混合，离心沉淀并用20mL乙醇离心洗2次(6000rpm，3min)，得到UCNPs。
将所述UCNPs超声分散在无水冰乙醚中，得到UCNPs乙醚溶液。
本发明对所述混合方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的，如搅拌。在本发明中，所述搅拌的时间优选为30～120min，更优选为40～100min，最优选为60～80min。本发明对所述分离的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的分离方式即可，具体的，如离心。
本发明对所述AlCl3乙醚溶液的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式制备即可。
得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液后，本发明将氨水滴加到所述UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液中发生复分解反应，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构。本发明优选在室温搅拌下，将氨水滴加到所述UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液。在本发明中，所述氨水与AlCl3的用量比为0.008～0.12g：1～10mmol，更优选为0.01～0.095g：2.5～4mmol，最优选为0.020～0.04g：2.8～3.2mmol。
在本发明中，所述氨水的滴加速度优选为2～20μL/s，更优选为4.5～12μL/s，最优选为7.5～9μL/s。在本发明中，所述氨水的质量浓度优选为4～6％，更优选为4.5～5.5％，最优选为4.8～5.2％。在本发明中，所述氨水与AlCl3乙醚溶液的体积比优选为0.2～2：5～20，更优选为0.3～1.0：8～15，最优选为0.4～0.6：10～13。在本发明中，所述氨水是为了防止氯化铝水解太快形成的氢氧化铝太厚，影响UCNPs粒子的吸光和发射光性能，而且防止氢氧化铝快速聚集沉淀而没有包裹在UCNPs的表面，从而使得反应具有可控性。
得到UCNP@Al(OH)3核壳结构后，本发明将得到的UCNP@Al(OH)3核壳结构与阿仑膦酸钠和HAuCl4混合进行沉淀反应，得到沉淀产物。在本发明中，所述UCNP@Al(OH)3核壳结构用量以制备UCNP@Al(OH)3核壳结构所用UCNPs的量计，所述UCNPs与阿仑膦酸钠和HAuCl4的摩尔比优选为1～5：0.05～0.8：0.0096～0.0525，更优选为1.5～2.5：0.3～0.5：0.03～0.05，最优选为1.8～2.3：0.40～0.45：0.035～0.040。
在本发明的实施例中，所述阿仑膦酸钠和HAuCl4优选分别以阿仑膦酸钠水溶液和HAuCl4水溶液的形式加入。本发明优选将阿仑膦酸钠水溶液滴加到UCNP@Al(OH)3核壳结构的水溶液混合，离心，沉淀分散在水中后，与HAuCl4水溶液混合得到沉淀产物。
在本发明中，所述阿仑膦酸钠水溶液的摩尔浓度优选为0.01～0.04mol/L，更优选为0.015～0.035mol/L，最优选为0.025～0.032mol/L(0.03mol/L,10mL)。在本发明中，所述HAuCl4水溶液的浓度优选为120～150mmol/L，更优选为130～148mmol/L，最优选为138～145mmol/L(142mmol/L，250μL)。在本发明中，所述阿仑膦酸钠水溶液、HAuCl4水溶液与UCNPs乙醚溶液的体积比优选为5～20：0.08～0.35：20～50，更优选为8～15：0.15～0.30：25～40，最优选为9～13：0.22～0.28：28～32。
本发明对所述混合没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的，如搅拌。在本发明中，所述搅拌的速率优选为100～1500r/min，更优选为300～800r/min，最优选为450～550r/min；所述搅拌的时间优选为24～72h，更优选为36～60h，最优选为48～50h。在本发明中，所述离心的转速优选为3500～10000rpm，更优选为4500～7500rpm，最优选为5500～6500rpm；所述离心的时间优选为2～15min，更优选为3～10min，最优选为5～8min。
在本发明中，所述阿伦磷酸钠一端含有双磷酸根极易与UCNP@Al(OH)3核壳结构的氢氧化铝结合，另一端的氨基可以与Au纳米粒子形成稳定的金胺键，从而捕获氯金酸，后续进行原位还原得到复合Au纳米粒子。
得到沉淀产物后，本发明将沉淀产物与还原剂混合发生氧化还原反应，得到UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子。在本发明中，所述还原剂优选为聚乙烯亚胺、柠檬酸钠或硼氢化钠。在本发明中，所述HAuCl4与还原剂的用量比为0.0096～0.0525mmol：0.00025～0.1g，更优选为0.035～0.05mmol：0.004～0.015g，最优选为0.040～0.045mmol：0.008～0.012g。在本发明中，所述氧化还原的温度优选为55～65℃，更优选为57～63℃，最优选为59～61℃。在本发明中，所述氧化还原的时间优选为10～60min，更优选为20～50min，最优选为30～40min。本发明对所述混合方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的，如搅拌；在本发明中，所述搅拌速率优选为8000～20000rpm，更优选为12000～18000rpm，最优选为14000～16000rpm。在本发明中，还原剂将氯酸金还原为金纳米颗粒。
在本发明中，所述还原剂优选以还原剂水溶液的形式加入。在本发明，所述还原剂水溶液的质量浓度优选为0.05～5％，优选为0.5～2％，最优选为0.9～1.2％。在本发明中，所述还原剂水溶液与HAuCl4水溶液的体积比优选为0.5～2：0.08～0.35，更优选为0.6～1.5：0.15～0.30，最优选为0.8～1.2：0.22～0.28。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的复合Au纳米粒子，本发明所述复合Au纳米粒子的制备中，在UCNPs纳米粒子表面包覆一层氢氧化铝，氢氧化铝的厚度为1～3nm；利用阿仑膦酸钠的双磷酸根与氢氧化铝之间的作用力，使阿仑膦酸钠钉扎在氢氧化铝表面并使其表面富含氨基，利用氨基与氯金酸的配位作用，将氯金酸连接在UCNPs粒子上；在加热条件下，还原剂将捕获的氯金酸原位还原并成核；在本发明中，所述复合Au纳米粒子的直径优选为9～17nm，更优选为10～13nm，从而形成特殊的异质结结构。
本发明还提供了上述技术方案所述复合Au纳米粒子在制备应用于生物组织的荧光检测、成像、示踪或生物分子的定位、检测、成像试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述复合Au纳米粒子在制备光热治疗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述应用的方法，包括以下步骤：
将复合Au纳米粒子与NHS-PEG-NHS和cRGD混合，得到UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子。
本发明将复合Au纳米粒子与NHS-PEG-NHS和cRGD混合，得到UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子。在本发明中，所述UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD的用量比优选为0.001～0.004mmol：0.005～0.02g：0.015～0.05g，更优选为0.0015～0.0025mmol：0.008～0.015g：0.02～0.04g，最优选为0.0018～0.0023mmol：0.009～0.012g：0.028～0.033g。在本发明中，所述NHS-PEG-NHS的重均分子量优选为5000。
本发明对所述混合方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的，如搅拌。在本发明中，所述搅拌的温度优选为10～40℃，更优选为15～30℃，最优选为20～25℃。在本发明中，所述搅拌的时间优选为16～30h，更优选为20～26h，最优选为22～24h。
在本发明中，所述复合Au纳米粒子与NHS-PEG-NHS和cRGD混合后，优选将得到的混合溶液进行离心分离。在本发明中，所述离心的转速优选为4000～16000rpm，更优选为6000～12000rpm，最优选为8000～10000rpm。在本发明中，所述离心的时间优选为1～6min，更优选为2～5min，最优选为3～4min。
在本发明的实施例中，UCNP@Al(OH)3/Au优选以UCNP@Al(OH)3/Au水溶液的形式加入；NHS-PEG-NHS和cRGD优选以NHS-PEG-NHS-cRGD水溶液的形式加入。在本发明中，所述UCNP@Al(OH)3/Au水溶液的浓度优选为0.05～0.2mmol/L，更优选为0.06～0.15mmol/L，最优选为0.09～0.12mmol/L。在本发明中，所述NHS-PEG-NHS-cRGD水溶液中NHS-PEG-NHS的浓度优选为0.5～2mg/mL，更优选为0.6～1.5mg/mL，最优选为0.9～1.2mg/mL；所述cRGD的浓度优选为1.5～5mg/mL，更优选为2～4.5mg/mL，最优选为2.8～3.5mg/mL。在本发明中，所述UCNP@Al(OH)3/Au水溶液和NHS-PEG-NHS-cRGD水溶液的体积比优选为20：10。在本发明中，所述复合Au纳米粒子通过酰胺键与靶向剂cRGD连接。
得到UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子后，本发明优选将UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子于-80℃冷冻干燥24h，放于-25℃冰箱中储存备用。
本发明还提供了一种纳米粒子UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD，包括以下原料制备得到：UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD，所述UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD的用量比为0.001～0.004mmol：0.005～0.02g：0.015～0.05g。
下面结合实施例对本发明提供的复合Au纳米粒子及其制备方法与应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)配制浓度为0.067mol/L的UCNPs乙醚溶液、0.3mol/L的AlCl3乙醚溶液，将10mLAlCl3乙醚溶液逐滴加入到30mL UCNPs乙醚溶液中，室温搅拌1h后离心分离，将沉淀重新分散到30mL乙醚溶液中，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液；
(2)室温搅拌下，将质量浓度为5％氨水500μL逐滴加入步骤1)所得溶液中，反应1h后，离心分离，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构；
(3)配制浓度为0.03mol/L的阿仑膦酸钠水溶液，取10mL阿仑膦酸钠水溶液滴加到20mL 0.1mol/L的UCNP@Al(OH)3水溶液中，常温下搅拌24h，6000rpm离心3min，将连上阿仑膦酸钠的UCNP@Al(OH)3纳米颗粒分散在30mL水中；向其中加入250μL浓度为142mmol/L的HAuCl4溶液中，得到沉淀反应物；
(4)加热至60℃，在所述沉淀反应物的水溶液中逐滴加入0.9mL的1wt％聚乙烯亚胺溶液，直到溶液变成澄清透明的酒红色后终止反应，6000rpm离心30min后，即得固体UCNP@Al(OH)3/A u纳米粒子。
(5)将上述离心之后的UCNP@Al(OH)3/Au沉淀分散在20mL去离子水中，再向其中加入10mL含10mg NHS-PEG-NHS和30mg cRGD的水溶液，常温下搅拌反应24h，6000rpm离心3min，即得UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子，将沉淀-80℃冷冻干燥24h放于-25℃冰箱中储存备用。
所述UCNP乙醚溶液的制备方法包括：
(a)准确称取YCl3·6H2O(388.30mg，1.28mmol)、GdCl3·6H2O(104.11mg，0.28mmol)、YbCl3·6H2O(139.51mg，0.36mmol)和ErCl3·6H2O(30.54mg，0.08mmol)，将其分散在4mL水中；将其与15mL油酸和30mL十八烯加入到100mL三颈瓶中，通氮气30min进行气体置换，将混合反应液缓慢升至120℃进行除水除氧，然后升温到156℃，搅拌溶解1h，此时溶液变为淡黄色澄清透明溶液，停止加热并自然冷却到室温；
(b)准确称取8mmol NH4F和5mmol NaOH溶于10mL的甲醇溶液中，快速超声溶解开后加入到上述步骤(a)得到的混合液中，常温下通入氮气并搅拌30min，然后升温到50℃搅拌30min，通入氮气条件下，继续升温到70℃并保持15min，除去溶液中的甲醇溶剂，然后快速升温至290℃并搅拌1.5h，然后停止加热，在氮气保护下自然冷却到室温；
(c)按体积比1：1的比例将无水乙醇与所述步骤(b)得到的混合溶液混合，离心沉淀并用20mL乙醇离心洗2次(6000rpm，3min)，得到UCNPs。将所述UCNPs超声分散在无水冰乙醚中，得到UCNPs乙醚溶液。
本实施例合成的UCNPs纳米粒子TEM图如图1a所示，粒径统计数据如图1d所示；从图1a看出本发明的UCNPs纳米粒子形貌规整、尺寸均一，从图1d可以看出UCNPs纳米粒子的尺寸为20nm±1nm。氨水水解氯化铝，在UCNPs纳米粒子表面包覆一层薄薄的氢氧化铝，形成UCNP@Al(OH)3壳核结构，所述UCNP@Al(OH)3壳核结构的TEM图如图1b所示，粒径统计数据如图1e所示；从图1e可以看出：所述UCNP@Al(OH)3壳核结构的粒径为22nm；所以，氢氧化铝的厚度为1nm±1nm。利用阿仑膦酸钠的双磷酸根与氢氧化铝之间的作用力，使阿仑膦酸钠钉扎在氢氧化铝表面并使其表面富含氨基，利用氨基与氯金酸的配位作用，将氯金酸连接在UCNPs纳米粒子上；在60℃下，聚乙烯亚胺溶液将捕获的氯金酸原位还原并成核，得到复合Au纳米粒子，所述复合Au纳米粒子的TEM图如图1c所示，粒径统计数据图图1f所示；从图1f可以看出复合Au纳米粒子的直径为36nm。
图1d、图1e、图1f中的光学照片分别为UCNPs，UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au三种粒子的分散在水中的光学照片。从图1d、图1e和图1f光学照片可以看出：包裹氢氧化铝之前，UCNPs粒子团聚沉在底部和粘在壁上，包裹氢氧化铝之后溶液颜色均匀，明显改善了UCNPs的水分散性。
将UCNPs、UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au三种粒子于-80℃冷冻干燥24h测得的粉末XRD图，如图2所示。从图2可以看出：UCNPs粒子为较好的六方晶型的堆积结构；UCNP@Al(OH)3在21°附近有两个弱峰，这与Al(OH)3的无定型相有关。另外，从UCNP@Al(OH)3/Au粒子的衍射图中可以观察到在2θ＝38.2°的Au的典型反射峰，表明Au纳米颗粒的存在。
图3a为Au、UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au三种纳米粒子的紫外可见吸收图谱以及UCNP@Al(OH)3和UCNP@Al(OH)3/Au两种粒子的荧光光谱图。从图3a的紫外可见吸收谱图中可以看出，氢氧化铝包裹UCNPs之后，Au的吸收峰几乎没有变化，说明氢氧化铝的薄层包裹并没有影响Au粒子的吸收光谱；Au纳米在521nm有吸收峰，而UCNP@Al(OH)3/Au的吸收峰红移到531nm处，说明UCNPs的加入对Au纳米粒子有明显的红移。众所周知UCNPs粒子在980nm处有吸收，由图3a的UCNP@Al(OH)3荧光光谱可以看出：UCNPs在980nm激发之后出现了540nm和650nm处荧光。将图3a的紫外可见吸收图谱和荧光谱图结合后，可以看出：UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子在980nm激发出现540nm和650nm处荧光，但是540nm处的荧光明显降低，而650nm处的荧光升高，说明UCNPs在980nm激发之后，540nm处的荧光被Au纳米粒子吸收发出，表现出明显的FRET效应。
纳米粒子UCNPs、UCNP@Al(OH)3、UCNP@Al(OH)3/Au和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD的红外光谱图如图3b所示。从3b可以看出，归属于肽键的1530cm-1，450cm-1和1350cm-1处的特征吸收峰，这证实了cRGD成功地结合到UCNP@Al(OH)3/Au纳米杂化体的表面上。
图3c为纳米粒子UCNP@Al(OH)3/Au的元素映射分析图谱，主要为UCNP@Al(OH)3/Au中UCNP核的F、Y、Yb、Er，Al(OH)3壳层中的Al，UCNP@Al(OH)3/Au复合粒子中的Au，Merge为UCNP@Al(OH)3/Au中所有元素的合并图。从图3c可以看出，氢氧化铝均匀地包裹在UCNP表面以及Au纳米粒子的存在，且Au纳米粒子负载在氢氧化铝壳层表面。
细胞毒性实验：将不同浓度(25～500μg/ml)的UCNP@Al(OH)3、UCNP@Al(OH)3/Au和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子与U87-MG细胞在CO2培养箱共培养24h后加入MTT，用DMSO溶解测其在570nm的吸收值与空白对照相比较得出细胞的存活率，结果如图4a所示。从图4a可以看出：本实施例制备的不同浓度的纳米粒子细胞存活率在85％以上，说明本发明制备的纳米粒子几乎没有细胞毒性。
溶血实验：将0.5mL不同浓度(25～500μg/mL)的UCNP@Al(OH)3、UCNP@Al(OH)3/Au和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子与等体积的红细胞混匀，在室温下静置3h，而后10050rpm离心15min取100μL 570nm检测吸光度，分别以PBS和水作阴性和阳性对照，由溶血率＝(样品吸收-阴性对照吸收)/(阳性对照吸收-阴性对照吸收)×100％，当溶血率＞5％时视为溶血，不同浓度的纳米粒子的溶血结果如图4b所示。从图4b可以看出，不同浓度的纳米粒子吸光度基本保持一致，说明本方法所制备的纳米粒子没有溶血现象，具有很好的生物相容性。
细胞光热实验：将UCNP@Al(OH)3-cRGD和UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD(500μg/ml)与U87MG细胞在CO2培养箱共培养四个小时后，用980nm(0.5W/cm2)激光照射1min，3min和5min，然后将其转移到CO2培养箱共培养24h后加入MTT，用DMSO溶解测其在570nm的吸收值，并与加入的PBS作空白对照相比较得出细胞的存活率。从图4c可以看出：5min可以杀死将近50％左右的细胞，说明UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子在细胞水平有很好的光热治疗效果。
光热实验：将2mL相同体积的纯水和UCNP@Al(OH)3/Au(500μg/ml)用980nm(1W/cm2)激光体外照射5min测得纳米粒子的升温情况，结果如图4d所示。从图4d可以看出：UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子在5min内升高了27℃，而纯水只升高了7℃，说明本发明的UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子具有很好光热效果。
激光共聚焦实验：将500μg/mL 10μL的UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子与90μLU87-MG细胞在CO2培养箱中共培养4h(用血细胞计数板计数约含5000个U87-MG细胞)，纳米粒子在受体介导的胞吞作用下被细胞内吞，通过共聚焦显微镜980nm照射细胞质，得到绿色荧光成像图，结果如图5a所示。从图5a可以看出：UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子很好的进入到细胞内。
光热性能实验：通过对皮下接种U87MG肿瘤6-8周的雌性BALB/c裸鼠尾静脉注射200μL 20mg/kg的UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD的PBS溶液，1～4h后，在980nm(0.5W/cm2)激光照射下，由红外测温仪检测得出5min内注射UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD的小鼠肿瘤部位升高到50℃；而相同条件下，注射PBS溶液的裸鼠升高到39℃，如图5b所示。从图5b可以看出：将UCNPs复合Au颗粒之后，二者相互协同，Au颗粒吸收UCNPs发出的540nm处的荧光，从而表现出明显的光热性能。
活体荧光成像研究：通过对皮下接种U87-MG肿瘤6-8周的雌性BALB/c裸鼠尾静脉注射200μL 20mg/kg的UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD的PBS溶液，1～4h后，在980nm(0.5W/cm2)激光下，由小动物活体成像系统检测肿瘤部位的荧光，结果如图5c所示。从图5c可以看出：肿瘤部位有明显荧光(Emission＝540nm)，说明UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD具有很好的活体内荧光成像效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种复合Au纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将AlCl3、UCNPs与乙醚混合，得到UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液；
(2)将氨水滴加到所述步骤(1)得到的UCNPs表面吸附AlCl3的乙醚溶液中发生复分解反应，得到UCNP@Al(OH)3核壳结构；
(3)将所述步骤(2)得到的UCNP@Al(OH)3核壳结构与阿仑膦酸钠和HAuCl4混合进行沉淀反应，得到UCNP@Al(OH)3-NH2-AuCl4的沉淀产物；
(4)将所述步骤(3)得到的沉淀产物与还原剂混合发生氧化还原反应，得到UCNP@Al(OH)3/Au纳米粒子；
所述步骤(4)中还原剂为聚乙烯亚胺。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中UCNPs与AlCl3的摩尔比为1～5：1～10；
所述步骤(3)中UCNP@Al(OH)3核壳结构用量以制备UCNP@Al(OH)3核壳结构所用UCNPs的量计，所述UCNPs与阿仑膦酸钠和HAuCl4的摩尔比为1～5：0.05～0.8：0.0096～0.0525。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述氨水与AlCl3的用量比为0.008～0.12g：1～10mmol。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述HAuCl4与还原剂的用量比为0.0096～0.0525mmol：0.00025～0.1g。
5.权利要求1～4任一所述制备方法制得的复合Au纳米粒子，其特征在于，所述Au纳米粒子的粒径为9～17nm，所述复合Au纳米粒子具有核壳结构，核为UCNPs，壳为氢氧化铝，所述Au纳米粒子负载在氢氧化铝壳层表面。
6.权利要求5所述复合Au纳米粒子在制备应用于生物组织的荧光检测、成像、示踪或生物分子的定位、检测、成像试剂中的应用。
7.权利要求5所述复合Au纳米粒子在制备光热治疗抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将复合Au纳米粒子与NHS-PEG-NHS和cRGD混合，所述UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD的用量比为0.001～0.004mmol：0.005～0.02g：0.015～0.05g，得到UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子。
9.一种UCNP@Al(OH)3/Au-cRGD纳米粒子，由包括以下组分的原料制备得到：UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS和cRGD，所述UCNP@Al(OH)3/Au、NHS-PEG-NHS与cRGD的用量比为0.001～0.004mmol：0.005～0.02g：0.015～0.05g。
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