CN108611372A - 一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎s基因复制缺陷型重组腺病毒的制备方法 - Google Patents

一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎s基因复制缺陷型重组腺病毒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎(TGE)S基因重组腺病毒的制备方法，本发明对传统的复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA进行改造，使其能够瞬时表达两个独立的基因，然后将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的纤突蛋白的优势抗原A、D位点的DNA序列与结核分枝杆菌Ag85A基因插入到改造后的穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA‑IRES，获得重组质粒pacAd5 CMV K‑N pA sAD‑IRES‑Ag85A，该重组质粒与复制缺陷型腺病毒骨架DNA pacAd 59.2‑100线性化后，共同转染AD‑293细胞，通过同源重组包装产生复制缺陷型重组腺病毒rAd‑sAD‑IRES‑Ag85A，进一步经纯化、扩增、分装等步骤得到免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。

Description

一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因复制缺陷型重组 腺病毒的制备方法
技术领域
本发明涉及生物疫苗技术领域，具体涉及一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因复制缺陷型重组腺病毒的制备方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)引起的一种急性、高度传染性疾病。不同品种和年龄的猪均易感染此病，能够引起各个年龄的猪呕吐、水样腹泻、脱水等，7日龄以内的猪病死率高达100％，成年猪病死率随着年龄的增长病死率逐渐下降。但是，育成猪、育肥猪、母猪等感染该病后会出现厌食、腹泻等症状，严重制约了养猪业的发展。
上世纪50年代末，在我国广州、汕头等地的猪场开始出现关于该病的相关报道，随后在华东、东北等地相继分离到猪传染性胃肠炎病毒。通过对我国猪传染性胃肠炎病的流行状况调查发现，该病在每年12月至次年4月感染发病率较高。近年来，猪传染性胃肠炎在我国的流行形式日趋严峻，经常与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻病、致病性大肠杆菌等病原混合感染，严重影响了我国养猪业的发展。目前，针对猪传染性胃肠炎病的防控主要以疫苗接种为主，使用较多的是组织灭活苗或者弱毒苗。尽管灭活苗能够刺激机体产生中和抗体，但是该病毒主要以肠道感染为主。因此，在抗TGEV感染免疫过程中，除体液免疫和细胞免疫外，局部黏膜免疫系统更发挥了重要作用。现在，国内外已经研发出多种针对TGEV的弱毒疫苗，免疫后刺激机体产生抗体所需时间短，但是抗体维持时间也短，需要通过多次加强免疫提高效果。此外，弱毒苗存在易返祖、潜在感染等缺陷。因此，迫切需要开发一种安全、价格便宜、还能有效诱导黏膜免疫的新型疫苗来控制该病的发生与流行。
TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，其基因组全长为28-30kb的单股正链 RNA，分为7个区，每个区含有一个或多个开放阅读框。TGEV的基因组编码4种结构蛋白(S蛋白、M蛋白、N蛋白和sM蛋白)和4种非结构蛋白，其结构为5’-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-SM-M-N-ORF7-3’。TGEV编码的四种结构蛋白：囊膜蛋白(约28-31KD)，又称M蛋白，是一种N端糖基化的转膜蛋白。M蛋白的羧基端含有一个干扰素基因决定簇，能够在体内介导补体依赖性中和抗体和诱导α-干扰素的合成。小囊膜蛋白(约27.7KD)，又称sM蛋白，在调控病毒粒子装配和释放过程中发挥重要作用。磷蛋白(约 47KD)，又称N蛋白，是存在于病毒粒子内部的高度磷酸化的酸性蛋白，在病毒RNA的合成、病毒复制、翻译过程中发挥了重要作用。此外，N蛋白能够激活T淋巴细胞协助S蛋白刺激B淋巴细胞产生针对TGEV的抗体。纤突蛋白(约200KD)，又称S蛋白，位于病毒粒子表面，是主要的免疫原。S蛋白存在3种层次的抗原结构，即抗原位点、抗原亚位点和抗原决定簇。S蛋白具有11个抗原决定簇，其中5个与中和抗体产生相关，包括一个B淋巴细胞抗原决定簇(负责诱导产生病毒中和抗体)。在S蛋白的氨基端有4个抗原位点A、B、C、D，其中A、D位点序列高度保守，是主要诱导机体产生中和抗体的抗原位点，若编码A、D位点的序列缺失，则其表达产物不能诱导机体产生中和抗体。因此，S蛋白一直被作为TGEV基因工程疫苗研发以及诊断技术研究的重要靶蛋白。
目前，S蛋白已经被广泛应用于亚单位疫苗、活载体疫苗研究领域。Shoup 等利用杆状病毒系统在昆虫体内表达提取TGEV S蛋白作为亚单位疫苗，在给猪进行弱毒苗免疫之后，再用杆状系统表达的S蛋白进行加强免疫，能够显著提高母猪的母源抗体水平，提高对仔猪的保护率，但是单独使用该蛋白作为亚单位苗免疫效果不佳。Smerdo等利用原核表达系统将S蛋白克隆至鼠伤寒沙门氏菌致弱菌株中，该重组疫苗经口服免疫可以刺激机体产生针对 TGEV的特异性抗体。Tuboly等利用同源重组的方法将全长的S基因克隆至 5型腺病毒载体上，经口服免疫，能够在猪体内检测到针对TGEV和5型腺病毒的特异性抗体，解决机体针对该载体产生的免疫反应是将其进一步推广使用的关键因素。这些基因工程疫苗候选株在一定程度上克服了现有常规疫苗存在的缺陷，但是其免疫原性低，仍然不能达到预期的免疫效果。
通过查阅文献发现，Ag85A基因是结核杆菌主要的分泌蛋白，是诱导机体保护性免疫反应的重要靶抗原。Ag85A免疫动物和结核病人可诱导特异性抗体产生和细胞介导的细胞毒性细胞应答反应的出现，诱导白介素2(IL-2) 和γ–干扰素(IFN-γ)等细胞因子的分泌。将该基因插入至疫苗候选株中，可以有效提高疫苗的免疫效果。因此，本专利构建了TGEV优势抗原与结核分枝杆菌Ag85A基因共表达的重组腺病毒载体疫苗，弥补了单基因工程疫苗的不足，提高了重组疫苗的免疫原性与免疫反应性。
发明内容
本发明目的是根据现有技术中存在的上述不足，针对以往根据S蛋白基因功能，选取部分S基因或者完整的S基因，采用不同的表达系统进行研发的基因工程疫苗存在被表达基因转录水平低，或者蛋白结构性质与天然蛋白结构不同等缺陷，研制出一种既能克服上述缺陷，并能诱导机体产生针对 TGEV的特异性中和抗体，具有较强的免疫力，以达到有效控制猪传染性胃肠炎病毒的基因工程疫苗。
本发明的技术方案具体如下：
本发明的目的之一是提供一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：
将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列IRES连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES；
将含有TGEV S基因的抗原位点DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A 基因的抗原DNA序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A；
将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A和复制缺陷型腺病毒pacAd5 9.2-100骨架DNA经线性化后，在脂质体的作用下共同转染真核细胞AD-293，得到重组腺病毒 rAd-sAD-IRES-Ag85A；
将所得到的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A经鉴定、浓缩、纯化、扩增步骤，制备成所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。
优选地，提供一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，方法包括如下具体步骤：
(1)核糖体结合位点序列IRES的获得：根据GenBank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列ID:gb|EF591488.1，合成脑心肌炎病毒的核糖体结合位点IRES序列，并在IRES序列的两端加入酶切位点EcoRI与 BamHI，获得质粒pEx-IRES；
(2)穿梭质粒的改造：分别提取质粒pEx-IRES和pacAd5 CMV K-N pA，利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacAd5CMV K-N pA-IRES；
(3)TGEV优势抗原基因片段的获得：根据GenBank数据库发表的 TGEVPurdue 115株的S基因序列，设计两对特异性引物(P1、P2、P3、P4) 用于分别扩增S基因的A、D抗原表位的序列；收集TGEV细胞培养液，提取TGEV RNA，以OligodT为引物进行反转录获得TGEVcDNA，以TGEV cDNA为模板，以P1、P2、P3、P4为引物，利用PCR技术扩增S基因片段，经琼脂糖凝胶纯化回收后，连接pMD19-T载体，转化，测序，获得含有优势抗原位点的TGEV sAD基因序列pMD19-T-sAD；
(4)含有TGEV优势抗原基因穿梭质粒的构建：在步骤(3)中获得 pMD19-T-sAD的上下游引物的5’端分别引入限制性内切酶EcoRI、XbaI的酶切位点，通过双酶切，将S基因片段克隆到穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES，通过转化、PCR和酶切鉴定，获得含有S基因片段的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES；
(5)结核分枝杆菌Ag85A基因片段的获得：根据GenBank数据库发表的结核分枝杆菌Ag85A基因，合成Ag85A基因序列，并在序列的两端加入酶切位点BamHI与XhoI，获得质粒pEx-Ag85A；
(6)含有TGEV优势抗原基因与结核分枝杆菌Ag85A基因穿梭质粒的构建：将步骤(5)所得质粒pEx-Ag85A和步骤(4)所得pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES利用限制性内切酶BamHI与XhoI分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A；
(7)重组腺病毒的获得与鉴定：将步骤(6)中得到的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A和复制缺陷型重组腺病毒pacAd 5 9.2-100的骨架DNA，经PacI酶切线性化后回收，转染AD-293细胞，重组腺病毒DNA 在细胞内包装成完整的复制缺陷型重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A；经纯化、扩增后，采用PCR、RT-PCR、SDS-PAGE和Western Blot方法检测S基因、 Ag85A基因的转录与表达；
(8)猪传染性胃肠炎复制缺陷型重组腺病毒的扩繁：取步骤(7)的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A，接种于AD-293细胞，进行扩大培养；当细胞病变达80-90％时，收集病毒，经反复冻融3次后，即可获得所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒，经检测、分装、包装后完成。
(9)小鼠免疫试验与抗体效价测定：将步骤(8)中获得病毒免疫小鼠，接种方式为皮下注射免疫与滴鼻免疫，首免后两周，加强免疫一次,分别与免疫后0周，2周，4周，6周，8周采集小鼠血清，分别进行ELISA检测与中和试验，检测抗体效价。
本发明的目的之二是提供一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒，采用上述制备方法制成的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。
本发明的目的之三是将上述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒用于制备疫苗。
本发明的目的之四是提供一种猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒疫苗，其用上述的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒作为抗原制备的。
本发明的目的之五是提供一种用于递送重组腺病毒的制剂，其中制剂包含上述的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒、赋形剂以及药学或兽医学可接受的运载体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明选取含有S基因主要抗原表位的A、D表位的基因序列，这两个位点序列高度保守，是主要诱导机体产生中和抗体的抗原位点，因此诱导机体产生针对TGEV特异性抗体的能力强。
2、本发明采用复制缺陷型人腺病毒血清5型载体为表达载体，该载体不含有E1基因，只能在真核细胞AD-293细胞中复制增殖，不能在人、猪等动物体内复制增殖而且没有致病性，不会出现散毒等传统弱毒苗的缺陷。而且，通过腺病毒载体在真核细胞胞内表达的蛋白可以进行蛋白翻译后修饰，最大程度还原目的蛋白的真实结构，发挥其原有的生物学活性。此外，该重组腺病毒可以采用口服免疫，能够刺激机体产生有效的黏膜免疫力，更好地预防TGE的发生。
3、本发明利用基因工程技术将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列插入到穿梭质粒的基因组上，对复制缺陷型人腺病毒血清5型载体的穿梭质粒进行改造，使得该重组腺病毒具备顺时表达两个不同蛋白的能力，而且这两个蛋白的结构与表达水平不会受到相互干扰。利用本方法，构建的重组腺病毒能够同时表达猪传染性胃肠炎抗原基因与结核杆菌Ag85A基因，在 Ag85A蛋白的作用下，有效提高了重组腺病毒的免疫原性。
附图说明
图1是本发明实施例中构建含有脑心肌炎病毒核糖体结合位点序列的腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES的酶切鉴定结果(601bp)。泳道1：穿梭质粒经双酶切后得到两个片段，分别为穿梭质粒骨架及IRES元件序列； M：10kb DNA Marker。
图2是本发明实施例中构建含有猪传染性胃肠炎病毒S基因含有A、D 抗原位点的腺病毒穿梭质粒的PCR鉴定结果(1109bp)。泳道1：sAD基因 PCR鉴定结果；M:2Kb DNAMarker。
图3是本发明实施例中构建的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N Pa-sAD-IRES-Ag85A的PCR鉴定结果。泳道1：sAD基因PCR鉴定结果；泳道2：sAD-IRES-Ag85A基因PCR扩增结果；泳道3：5Kb DNA Marker。
图4是本发明实施例中构建的共同含有猪传染性胃肠炎sAD基因片段与 Ag85A基因片段的复制缺陷型重组腺病毒的穿梭质粒的线性化酶切结果。泳道1，3，5依次为腺病毒骨架质粒pacAd 5 9.2-100，穿梭质粒pacAd5 CMV eGFP， pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A；泳道2，4，6依次为线性化之后的腺病毒骨架质粒pacAd 5 9.2-100，穿梭质粒pacAd5CMV eGFP，pacAd5 CMV K-N Pa-sAD-IRES-Ag85A。
图5是本发明实施例中复制缺陷型重组腺病毒感染AD-293细胞之后的细胞病变。图片A为正常的AD-293细胞对照，图片B为pacAd5 CMV eGFP转染AD-293细胞的细胞病变，图片C为pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A 转染AD-293细胞的细胞病变。
图6是本发明实施例中重组腺病毒RT-PCR鉴定结果图。泳道1：基因 Ag85A的扩增结果；泳道2，3：野生型腺病毒对照；泳道4：基因sAD的扩增结果；M：2KbDNA Marker。
图7是本发明实施例中免疫印迹检测结果图。图片A为感染腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A的AD-293细胞裂解液与猪传染性胃肠炎阳性血清的反应结果；泳道1为感染腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A的AD-293细胞裂解液，泳道2为正常AD-293细胞对照。图片B为感染腺病毒的AD-193细胞裂解液与Ag85A蛋白单抗的检测结果。泳道3为正常AD-293细胞对照，泳道4为感染腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A的AD-293细胞裂解液。
图8是本发明实施例中各代次的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A RT-PCR检测结果图。图片A为各代次重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A内 sAD基因的鉴定结果。泳道1-7分别为1、5、10、15、20、25、30代重组腺病毒内sAD基因的鉴定结果。图片B为各代次重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A内Ag85A基因的鉴定结果。泳道1-7分别为1、5、10、 15、20、25、30代重组腺病毒内Ag85A基因的鉴定结果。
图9是本发明实施例中重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A病毒滴度检测结果图。
图10是本发明实施例中检测小鼠体内TGEV抗体产生水平。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA的改造
根据GenBank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列 (GenebankSequence ID:gb|EF591488.1)，合成IRES序列，并在序列的两端加入酶切位点EcoRI与BamHI，获得质粒pEx-IRES。
分别提取质粒pEx-IRES、pacAd5 CMV K-N pA，利用限制性内切酶EcoRI 与BamHI分别酶切质粒，通过琼脂糖凝胶电泳纯化双酶切后的IRES片段与 pacAd5 CMV K-N pA质粒片段，经过T4连接酶连接后，转化DH10b感受态细胞，经鉴定筛选含有IRES元件的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES，如图1所示。
实施例2重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES的构建
2.1特异性引物P1、P2、P3、P4设计。根据GenBank数据库发表的TGEV Purdue 115株的S基因序列，设计两对特异性引物，引物P1，P2用于扩增A 抗原表位的序列，长度为501bp；引物P3，P4用于扩增D抗原表位的序列。引物序列如下：
P1：GGGTACCATGTTAGTTACCAAACAGCCGT
P2：AACTTGGGATCCTATTGTCCAGAAAA
P3：TTTTCGGGATCCCAAGTTGAAAACACAG
P4：GGAATTCAAACTATTATCAGACGGT
2.2含有TGEV S基因的克隆质粒构建。采用病毒RNA柱式提取试剂盒提取TGEVRNA，以OligodT为引物进行反转录获得TGEV cDNA，以TGEV cDNA为模板，以P1、P2为引物扩增含有S基因编码A表位的序列sA，以 P3、P4为引物扩增S基因编码D表位的序列sD。以P1、P4为引物，以sA、 sD为模板扩增sAD，经琼脂糖凝胶纯化回收之后，连接pMD19-T载体，筛选含有sAD序列的PCR产物经琼脂糖凝胶纯化回收之后连接pMD19-T，筛选含有sAD基因片段的pMD19-T阳性重组质粒pMD19-T-sAD。
2.3含有sAD基因的腺病毒穿梭质粒的构建。利用限制性内切酶EcoRI、 KpnI双酶切质粒pMD19-T-sAD与腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES，经琼脂糖凝胶纯化回收之后，将sAD片段插入至酶切后的载体pacAd5 CMV K-N pA-IRES，连接产物转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定筛选阳性克隆，鉴定的阳性质粒命名为pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES，如图2所示。
实施例3重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A的构建
根据GenBank数据库发表的结核分枝杆菌Ag85A基因，合成Ag85A基因序列(1364bp)，在序列的两端加入酶切位点SpeI与NotI，获得质粒pEx-Ag85A。根据Ag85A基因DNA序列，设计引物P5、P6，用于Ag85A基因扩增。
P5：5’CTAGACTAGTATGCAGCTTGTTGACAGG3’
P6：5’ATAAGAATGCGGCCGCCTAGGCGCCCTGGGGCGCGG3’
利用限制性内切酶SpeI与NotI酶切质粒pEx-Ag85A与实施例2中获得的质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES，经琼脂糖凝胶纯化回收之后，将 Ag85A片段插入至酶切后的载体pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES，连接产物转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定筛选阳性克隆，鉴定的阳性质粒命名为pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A，如图3所示。
实施例4重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A的获得
4.1重组穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A线性化与纯化。使用无内毒素质粒大提试剂盒提取穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A，pacAd5 CMVeGFP与腺病毒骨架质粒pacAd 5 9.2-100， pacAd5 CMV eGFP商业化质粒作为转染过程中的对照使用。按照下列体系将重组腺病毒质粒与腺病毒骨架DNA分别进行PacI单酶切线性化，反应体系如下：重组腺病毒质粒30.0μL，10×NE buffer1 6.0μL，100×BSA 0.6μL，PacI1.0μL，加入灭菌双蒸水至总体积60.0μL，37℃酶切6h，进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，酶切反应结果如图4所示。利用乙醇沉淀法纯化酶切之后的 DNA，分装保存。
4.2复制缺陷型重组腺病毒的包装(1)转染前一天，用12mL含有10％胎牛血清无抗生素DMEM生长液分散T25单层AD-293细胞，转至六孔板， 2mL/孔，使其细胞密度为90-95％。(2)准备DNA：转染试剂混合液，取一支灭菌的Eppendorf管，按照下列配方，依次加入以下试剂：DMEM 250μL，重组穿梭质粒15μL，腺病毒骨架DNA 5μL，反复吹吸混匀，最后加入恢复至室温的TransIT试剂6μL，吹吸混匀，室温作用25min。(3)转染前采用无血清DMEM培养基2mL/孔，轻轻洗涤细胞2次，加入2μL含有2％胎牛血清的DMEM培养基，然后分多点逐滴加入DNA：转染试剂混合液，轻晃细胞板，使之均匀，将细胞板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。(4)每天观察细胞状态，10-15d出现典型CPE后(见图5)，收毒。
实施例5复制缺陷型重组腺病毒的鉴定
5.1重组腺病毒的RT-PCR检测(1)用12mL含有10％胎牛血清无抗生素DMEM生长液分散T25单层AD-293细胞，分别取4mL细胞培养液分装置 T25细胞瓶中，加入6mL含有10％胎牛血清的DMEM生长液，吹吸混匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。(2)待T25细胞瓶中细胞密度生长至90-95％时，用10mL含有2％胎牛血清的无抗生素DMEM生长液洗涤细胞2次，然后各加入10ml含有2％胎牛血清的无抗生素DMEM生长液，向其中一瓶细胞中接种复制缺陷型重组腺病毒液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养3d，出现典型CPE之后，收毒。(3)用TRIZOL试剂按照产品说明书提取总RNA，按照实施例2中的方法进行RT-PCR检测TGEV S蛋白与Ag85A基因的mRNA，如图6所示。结果表明，该复制缺陷型重组腺病毒能够成功转录插入的TGEV S基因与结核杆菌Ag85A基因。
5.2蛋白印迹检测(1)按照5.1中的方法，收集含有重组腺病毒的细胞液以及正常的293细胞液，提取总蛋白。然后各加入5×LoadingBuffer，100℃煮沸5min。取20μL样品加至SDS-PAGE胶的加样孔中，进行电泳，分离蛋白。(2)电泳结束后，将胶条割至合适大小，裁取与胶条相同大小的NC膜，将胶条与NC膜一起浸入转膜缓冲液中浸泡10min。(3)按照以下顺序组装转膜装置，从下至上依次为阳极碳板、3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸、阴极碳板，其中NC膜与凝胶必须精确对齐。接通电源，以1mA/cm2电流，转印1h。(4)转印结束后，将NC膜取出，置于干净的平皿中，加入20mL PBST 洗涤NC膜，5min×3次。(5)向平皿中加入10mL 5％NFM，置于水平摇床上，平稳摇动，室温封闭2h。弃除封闭液，加入PBST洗膜，5min×5次。(6)以1：1000的比例用封闭液稀释TGEV阳性血清，使NC膜完全浸润在一抗中，置于水平摇床上，平稳摇动，室温作用1h。弃除一抗，加入PBST洗膜， 5min×5次。(7)以1：5000的比例用PBST稀释二抗，使NC膜完全浸润在二抗中，置于水平摇床上，平稳摇动，室温作用1h。弃除二抗，加入PBST 洗膜，5min×5次。(8)用滤纸轻轻吸干NC膜表面的水分，加入显色液，避光反应1min。然后将膜与胶片一起置于暗盒中作用3-5min，作用结束后，将胶片先后置于显色液，脱色液中至其出现条带。(9)结果表明，该复制缺陷型重组腺病毒能够正确表达目的蛋白，并能与TGEV阳性血清反应，如图7 所示。
实施例6复制缺陷型重组腺病毒的遗传稳定性试验
6.1猪传染性胃肠炎复制缺陷型重组腺病毒候选株种子批制备将实施例 5中得到的重组腺病毒定义为O代。吸取500μL接种AD 293细胞进行传代，连续传30代，定义为01-30代。分别取1、5、10、15、20、25、30代按照实施例5中进行RT-PCR检测，剩余毒株分装后，-80℃保存。结果证明，携带猪传染性胃肠炎S基因与结核杆菌Ag85A基因的重组腺病毒基因序列稳定，在该重组腺病毒中能够稳定表达，如图8所示。
6.2猪传染性胃肠炎复制缺陷型重组腺病毒病毒滴度测定分别取3，4， 6，8，10，15，20，30代重组腺病毒进行10倍梯度稀释，接种于含有AD-293 细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养7天，逐日观察细胞病变，按照 Reed-Muench方法计算TCID50。结果显示，随着病毒传代，重组腺病毒 rAd-sAD-IRES-Ag85A的病毒滴度逐代增加，至第6代趋于稳定，第10代的TCID50约为109.676PFU/mL，如图9所示。结果表明，该复制缺陷型重组腺病毒接种AD-293细胞以后毒价稳定并出现典型的CPE症状。
实施例7rAd-sAD-IRES-Ag85A感染小鼠的免疫原性测定
为了验证复制缺陷型重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A作为对抗猪传染性胃肠炎病毒感染的疫苗的可能性，本实施例取第10代重组腺病毒 rAd-sAD-IRES-Ag85A进行动物试验，以实验室保存的只含有猪传染性胃肠炎 S基因的重组腺病毒rAd-sAD与不含外源基因的野生型腺病毒rAd作为对照。将180只小鼠，随机分成3组，每组60只，分别为试验组1，试验组2，PBS 对照组。试验组1每只小鼠接种剂量为0.1mL的重组腺病毒 rAd-sAD-IRES-Ag85A，接种方式为皮下注射免疫和滴鼻免疫。试验组2每只小鼠接种剂量为0.1mL的重组腺病毒rAd-sAD，接种方式为皮下注射免疫和滴鼻免疫。对照组通过皮下注射和滴鼻免疫接种等量的野生型腺病毒。首免后每隔两周，加强免疫一次，共接种3次。
7.1猪传染性胃肠炎抗体检测。接种后，第0周，2周，4周，6周，8周随机取10只小鼠采血，分离血清。(1)利用纯化的猪传染性胃肠炎病毒包被 96孔板，建立猪TGE检测方法。(2)将待检血清进行1：40倍稀释后，取 100μL加入96孔板中，37℃孵育1h。(3)每孔加入300μLPBST洗液，静置 30s，弃去，重复3次，拍干。(4)每孔加入100μL稀释的酶标蛋白G，37℃孵育1h。(5)每孔加入300μLPBST洗液，静置30s，弃去，重复3次，拍干。 (6)每孔加入100μL底物，避光反应15min。(7)每孔加入100μL终止液，用酶标仪测定OD450读取光密度值。试验结果表明，免疫后2周，试验组1 与试验组2的小鼠体内开始产生针对TGEV的阳性抗体，免疫后6周抗体水平更高。其中，免疫rAd-sAD-IRES-Ag85A重组腺病毒的小鼠体内TGEV抗体水平高于免疫rAd-sAD腺病毒小鼠体内的抗体水平，如图10所示。
7.2中和试验。体外培养pk15细胞，接种实验室保存的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，测定TCID50。分别将7.1收集的试验组1与试验组2免疫后六周的小鼠血清进行56℃灭活，进行中和试验。依次向96孔板中加入50μL DMEM培养液(无血清)；然后向1A，2A孔中分别加入50μL免疫 rAd-sAD-IRES-Ag85A后6周的小鼠血清，吹吸混匀后，吸取50μL分别加入1B，2B孔中，进行倍比稀释，然后依次进行1：4，1：8，1：16，1：32，1： 64，1：128倍稀释，混匀；向每个孔中加入50μL 100TCID50的TGEV病毒， 37℃作用1h。向每个孔中加入50μL消化的pk15细胞，37℃培养3-5天，观察细胞病变，以中和50％TGEV病毒的血清最高稀释度为中和抗体效价。试验过程中，设立血清毒对，该孔只加入DMEM培养液，1：2稀释血清以及 pk15细胞，用于观察血清对细胞的影响；设立空白细胞对照；设立TCID50的回归试验对照。将100TCID50的病毒依次进行10-1，10-2，10-3，10-4稀释，向每孔中加入50μL病毒稀释液，然后各加入50μL稀释之后的病毒，37℃作用1h后，每孔加入50μLpk15细胞。各重组腺病毒免疫小鼠血清中均可检测到不同滴度的中和抗体，空载体组及PBS免疫组均未检测到中和抗体。免疫重组腺病毒rAd-sAD组中和抗体的几何平均滴度(GMT)为1：16。含有Ag85A 的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A免疫组的中和抗体滴度最高，为1：55。详见表1。
表1各组免疫小鼠血清的中和抗体几何平均滴度(GMT)。

Claims (6)

1.一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列IRES连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES；
将含有TGEV S基因的抗原位点DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A基因的抗原DNA序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A；
将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A和复制缺陷型腺病毒pacAd5 9.2-100骨架DNA经线性化后，在脂质体的作用下共同转染真核细胞AD-293，得到重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A；
将所得到的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A经鉴定、浓缩、纯化、扩增步骤，制备成所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。
2.根据权利要求1所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：
(1)核糖体结合位点序列IRES的获得：根据GenBank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列ID:gb|EF591488.1，合成脑心肌炎病毒的核糖体结合位点IRES序列，并在IRES序列的两端加入酶切位点EcoRI与BamHI，获得质粒pEx-IRES；
(2)穿梭质粒的改造：分别提取质粒pEx-IRES和pacAd5 CMV K-N pA，利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacAd5 CMVK-N pA-IRES；
(3)TGEV优势抗原基因片段的获得：根据GenBank数据库发表的TGEV Purdue 115株的S基因序列，设计两对特异性引物(P1、P2、P3、P4)用于分别扩增S基因的A、D抗原表位的序列；收集TGEV细胞培养液，提取TGEV RNA，以OligodT为引物进行反转录获得TGEV cDNA，以TGEVcDNA为模板，以P1、P2、P3、P4为引物，利用PCR技术扩增S基因片段，经琼脂糖凝胶纯化回收后，连接pMD19-T载体，转化，测序，获得含有优势抗原位点的TGEV sAD基因序列pMD19-T-sAD；
(4)含有TGEV优势抗原基因穿梭质粒的构建：在步骤(3)中获得pMD19-T-sAD的上下游引物的5’端分别引入限制性内切酶EcoRI、XbaI的酶切位点，通过双酶切，将S基因片段克隆到穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-IRES，通过转化、PCR和酶切鉴定，获得含有S基因片段的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES；
(5)结核分枝杆菌Ag85A基因片段的获得：根据GenBank数据库发表的结核分枝杆菌Ag85A基因，合成Ag85A基因序列，并在序列的两端加入酶切位点BamHI与XhoI，获得质粒pEx-Ag85A；
(6)含有TGEV优势抗原基因与结核分枝杆菌Ag85A基因穿梭质粒的构建：将步骤(5)所得质粒pEx-Ag85A和步骤(4)所得pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES利用限制性内切酶BamHI与XhoI分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A；
(7)重组腺病毒的获得与鉴定：将步骤(6)中得到的穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA-sAD-IRES-Ag85A和复制缺陷型重组腺病毒pacAd 59.2-100的骨架DNA，经PacI酶切线性化后回收，转染AD-293细胞，重组腺病毒DNA在细胞内包装成完整的复制缺陷型重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A；经纯化、扩增后，采用PCR、RT-PCR、SDS-PAGE和Western Blot方法检测S基因、Ag85A基因的转录与表达；
(8)猪传染性胃肠炎复制缺陷型重组腺病毒的扩繁：取步骤(7)的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A，接种于AD-293细胞，进行扩大培养；当细胞病变达80-90％时，收集病毒，经反复冻融3次后，即可获得所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒，经检测、分装、包装后完成。
(9)小鼠免疫试验与抗体效价测定：将步骤(8)中获得病毒免疫小鼠，接种方式为皮下注射免疫与滴鼻免疫，首免后两周，加强免疫一次,分别与免疫后0周，2周，4周，6周，8周采集小鼠血清，分别进行ELISA检测与中和试验，检测抗体效价。
3.一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒，其特征在于：采用1或2所述制备方法制成的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。
4.根据权利要求3所述的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒用于制备疫苗。
5.一种猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述的疫苗用权利要求3所述的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒作为抗原制备的。
6.一种用于递送重组腺病毒的制剂，其中所述制剂包含权利要求3所述的免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒、赋形剂以及药学或兽医学可接受的运载体。
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