CN108607100A - 一种当归蛋白自组装颗粒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然中药蛋白领域，更具体地涉及一种当归蛋白（ASPR）及其蛋白自组装纳米颗粒，该蛋白N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA。ASPR蛋白在pH 8.0下，经过100℃加热15min，可自组装形成纳米颗粒。通过100 KDa超滤分离得到的蛋白自组装纳米颗粒ASPR‑NP平均粒径为154.9±27.2 nm。该纳米颗粒稳定性好，可跨膜进入细胞，到达线粒体。此外，ASPR可包埋小分子难溶药物阿魏酸（FA），得到ASPR‑FA‑NP，其平均粒径为216.3±18.3 nm。ASPR‑FA‑NP的稳定性好，能够选择性促进正常肝细胞增殖同时抑制肝癌细胞增殖，且生物相容性好。

Description

一种当归蛋白自组装颗粒及应用

技术背景

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种当归蛋白自组装颗粒及应用，当归蛋白自组装颗粒稳定性与生物安全性佳，并可应用于包埋水溶性差的小分子，以改善难溶小分子的生物利用度。

背景技术

病程相关蛋白-10家族（PR-10）蛋白广泛分布于各种属以及植物各器官中，属于植物抗逆蛋白，与植物抵抗生物胁迫（病原体）与非生物胁迫（干旱，热量，寒冷和盐分）的能力有关。

我国传统中药当归为多年生草本植物当归[Angelica sinensis (Oliv.) Diels]的干燥根，本发明从中药当归中制备得到当归PR-10家族蛋白——ASPR，发现其在一定的温度、pH及处理时间下，可自组装形成蛋白质纳米颗粒ASPR-NP，ASPR-NP纳米颗粒低温下稳定性好，可跨膜进入细胞且具有良好的生物安全性。

阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，FA）是一种有效的抗氧化剂，在疾病防治（如阿尔茨海默氏病，糖尿病，癌症，高血压和动脉粥样硬化等）、化妆品行业（FA能使皮肤有效地避免光照）和食品行业（可抑制脂质过氧化和随后的氧化腐败）等均有广泛应用。

FA有顺式、反式两种，顺式为黄色油状物，反式为正方形结晶或纤维结晶。应用上常用反式FA，常温下，反式FA难溶于水，只溶于热水和有机溶剂。水溶解性差导致FA的使用受到很多限制，影响其生化功能的发挥。

本发明制备得到ASPR蛋白，还可装载FA形成ASPR-FA-NP纳米颗粒，增加其水溶性，ASPR-FA-NP可选择性促进正常肝细胞增殖同时抑制肝癌细胞增殖功能。此外ASPR-FA-NP与ASPR-NP一样，具有良好的稳定性和生物安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种当归蛋白自组装形成蛋白质纳米颗粒ASPR –NP的技术，并将其应用于包埋难溶小分子（本文中以FA为例），形成ASPR-小分子-NP纳米颗粒，解决了难溶小分子水溶性差的问题，增加其生物利用度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述当归蛋白，分子量为18.33KDa，N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA 。

将0.5 mg/mL的 ASPR蛋白pH调至8.0，经过100 ℃加热15 min,室温冷却半小时，用100 KDa超滤管反复三次去除未反应的ASPR，即获得自组装的当归蛋白颗粒ASPR-NP。其平均粒径为154.9 ± 27.2 nm，PdI为0.26 ± 0.09，Zeta电势为-11.64 ± 2.66mv。ASPR-NP纳米颗粒低温下稳定性好，可跨膜进入细胞且具有良好的生物安全性。

将0.5 mg/mL的ASPR蛋白pH调至8.0，加入FA甲醇溶液，100 ℃水浴15 min，室温静置冷却，用100 KDa超滤管反复三次去除未反应的ASPR，即获得当归蛋白包埋FA纳米颗粒ASPR-FA-NP。其平均粒径为216.3 ± 18.3 nm，PdI为0.24 ± 0.08，Zeta电势为-14.65 ±5.01 mv。ASPR-FA-NP纳米颗粒也具有良好的生物安全性和稳定性，可选择性促进正常肝细胞增殖同时抑制肝癌细胞增殖。

本发明的优点在于：

（1）提供一种ASPR蛋白自组装形成ASPR-NP纳米颗粒的制备方法，该方法耗能少，简单方便，不需要任何化学交联剂。

（2）ASPR-NP稳定性好，在4℃和-20℃条件下可稳定储存。

（3）ASPR-NP可跨膜进入细胞。

（4）ASPR-NP对健康红细胞无毒害作用。

（5）用ASPR蛋白包埋难溶小分子简单方便。以装载FA为例，在ASPR与FA混合 100℃ 热处理15 min即可完成ASPR-FA-NP，不需要任何化学交联剂。

（6）ASPR-FA-NP可提高FA溶解性，改善其生物利用度。

（7）ASPR-FA-NP稳定性好，在4 ℃和-20 ℃条件下可稳定储存。

（8）ASPR-FA-NP对健康红细胞无毒害作用。

（9）ASPR-FA-NP可促进正常肝细胞增殖，抑制肝癌细胞增殖功能，其生物活性具有选择性。

附图说明

图1当归ASPR蛋白的 SDS-PAGE电泳图（M：蛋白maker；1：非还原；2：还原）。

图2 ASPR自组装颗粒ASPR-NP的纯化电泳图 （其中M为蛋白Marker；1：ASPR 2：ASPR heated 3：ASPR-NP 4：ASPR heated 超滤下液)。

图3-A ASPR-NP 的粒径表征。

图3-B ASPR-NP 的电位表征。

图3-C ASPR-NP 的SEM表征。

图4 ASPR-NP颗粒的稳定性（A、ASPR-NP不同条件下纳米颗粒粒径随时间变化图；B、ASPR-NP不同条件下纳米颗粒Zeta电位随时间变化图）。

图5 ASPR-NP的细胞跨膜能力。

图6 ASPR自组装及装载FA前后SDS-PAGE分析。其中M为蛋白Marker；1：ASPR；2：ASPR heated；3：ASPR-NP ；4：ASPR heated 超滤下液；5：（ASPR+FA）heated ；6：ASPR-FA-NP；7：（ASPR+FA heated）超滤下液。

图7-A ASPR-FA-NP 的粒径表征。

图7-B ASPR-FA-NP 的电位表征。

图7-C ASPR-FA-NP 的SEM表征。

图8-A FA标准品色谱图。

图8-B FA标准曲线。

图8-C FA全波长扫描曲线。

图9 ASPR-FA-NP稳定性（A：ASPR-FA-NP不同条件下纳米颗粒粒径随时间变化图；B：ASPR-FA-NP不同条件下纳米颗粒Zeta电位随时间变化图）。

图10 ASPR、ASPR-NP与ASPR-FA-NP对不同类型细胞增殖的影响（A: L-02；B：HepG2）。

图11 ASPR、ASPR-NP和ASPR-FA-NP的血液相容性。

具体实施方式

实施例1：ASPR蛋白的制备

以10倍体积0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）混合浸泡切成小块的当归， 在4℃静置过夜，次日用4层纱布过滤残渣，滤液于12000 rpm、4 ℃离心10 min，所得的上清为当归蛋白粗提液；粗蛋白液进行硫酸铵一步沉淀（0-80%），沉淀过夜并收集其沉淀蛋白，溶于2倍体积的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，将硫酸铵沉淀的溶解液上样于经平衡液（0.05 mol/L ，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液）充分平衡后的Sephadex G-50层析柱，用平衡液洗脱并收集第二个洗脱峰为目的蛋白，经SDS-PAGE电泳检测纯度，结果如附图1。

该蛋白分子量18.33 kDa， 经测序获得N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA ，为PR-10家族蛋白，命名为ASPR。

实施例2：当归蛋白纳米颗粒ASPR-NP的制备

用0.05 MTris-HCl（pH 8.0）将ASPR浓度定量为0.5 mg/mL，取5 mL ASPR经过100 ℃加热15 min。室温冷却半小时后，用100 KDa超滤管，5000 g，4℃，超滤5min, 超滤后补加5 mL0.05M Tris-HCl pH8.0，重复3次。最后用5 mL 0.05 M pH 8.0 Tris-HCl浸润30 min，获得自组装的当归蛋白纳米颗粒命名为ASPR-NP。

通过SDS-PAGE进行分离前后蛋白成分鉴定如附图2，自组装后的ASPR溶液（ASPRheated）中出现高分子量蛋白（ASPR-NP），且经过100 KDa超滤分离后，上液仅存ASPR-NP，下液中未组装蛋白完全被超滤下来，没有发生截留。用BCA蛋白含量测定试剂盒算得组装的蛋白总量约占总蛋白量的16%，即有16%的蛋白自组装为ASPR-NP。

使用用激光粒度仪对ASPR-NP进行表征测定得其平均粒径为154.9± 27.2 nm，PdI为0.26± 0.09，Zeta电势为-11.64 ± 2.66 mv，如附图3-A和图3-B所示。

滴加ASPR-NP于硅片上自然风干后，经SEM观察其形貌，如附图3-C所示。 视野中颗粒黏连成片，可能是风干过程中颗粒聚集形成的，有些颗粒表面凹凸不平，ASPR-NP形貌近似球形却并不规则，其中近似球形的颗粒粒径为80 nm左右，比Malvern激光粒度仪所测得粒径数值较小。

实施例3： ASPR-NP的稳定性

取ASPR-NP溶液分为3组，每组7管，分别于4 ℃和-20 ℃情况下探究其稳定性。每种情况各放置1-7 d，期间每天取出于30 ℃水浴锅孵育30 min，然后用激光粒度仪进行粒径、Zeta电势测定，结果如图5所示。

由图5可知，ASPR-NP置于4 ℃或-20 ℃保存时，颗粒的粒径和电位走向总体平稳，数值变化不大。这说明ASPR-NP可在4℃和-20℃条件下长时间稳定保存。

实施例4：ASPR-NP体外细胞跨膜能力

荧光结合颗粒的制备：将ASPR -NP按1:10加入2 mg/mL FITC ，经过反应及G25凝胶柱去除游离的FITC后得到FITC标记的ASPR -NP颗粒。

细胞的准备：Hep G2细胞（人肝癌细胞）加入胰酶消化适当时间后，吸出胰酶加入少量培养液，离心。去上清。加入PBS清洗两次后，加入PBS制成细胞悬液，计数。先往24孔板底部放入裁成1/4 面积的无菌盖玻片，然后每孔接种2×10⁵ 个细胞，37 ℃孵育24 h。

细胞贴壁培养 24 h后，用无菌PBS小心清洗2遍，然后加入FITC标记的ASPR-NP，作用3h。接着再用无菌PBS小心清洗2遍，然后加入细胞核及线粒体染料（MitoTracker RedCMXRos 和Hoechst），孵育30 min。最后再用无菌PBS小心清洗3遍,然后用镊子夹出种满细胞的盖玻片放在载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察，结果如图5所示。

活细胞中的细胞核呈蓝色荧光，线粒体呈红色荧光，FITC标记的ASPR-NP颗粒呈绿色荧光。由图5可以看出，部分细胞膜周围有绿色荧光，部分线粒体处可见红色与绿色叠加处呈现黄色荧光，可知ASPR可吸附于细胞表面，部分可跨膜进入线粒体内A（白色箭头）。

实施例5：当归ASPR蛋白包埋FA 形成的ASPR-FA-NP纳米颗粒的制备

将FA用色谱级甲醇溶解，浓度为20 mg/mL。取125 ul FA甲醇溶液（20 mg/mL）加入5 mL经0.22 μm水系滤膜过滤且蛋白浓度为0.5 mg/mL的ASPR溶液中，100 ℃水浴15 min，室温静置冷却。取5 mL冷却液用100 KDa超滤管于5000 g，4 ℃离心5 min至样品溶液全部滤过。然后补加5 mL pH 8.0、0.05 M Tris-HCl缓冲液（0.22 μm膜过滤），重复此操作3次，最后再用5 mL pH 8.0、0.05 M Tris-HCl缓冲液浸润超滤管30 min，得到超滤后上液即为当归蛋白包埋阿魏酸纳米颗粒ASPR-FA-NP。制备全程注意避光。同理，用等体积甲醇代替FA，ASPR直接加热而后分离得到的当归蛋白颗粒ASPR-NP进行对比。

通过SDS-PAGE进行分离前后蛋白成分鉴定如附图6，包埋后的当归蛋白溶液[（ASPR+FA）heated]中出现高分子量蛋白（ASPR-FA-NP），且经过100KDa超滤分离后，上液仅存ASPR-FA-NP，下液中未组装蛋白完全被超滤下来，没有发生截留。

通过动态光散射粒径仪对ASPR-FA-NP进行表征，如附图7-A 所示，未装载阿魏酸的当归蛋白纳米颗粒ASPR-NP平均粒径为154.9 ± 27.2 nm，PdI为0.26± 0.09，Zeta电势为-11.64 ± 2.66mv，如附图7-B所示，装载阿魏酸的当归蛋白纳米颗粒ASPR-FA-NP粒径为216.3 ± 18.3 nm，PdI为0.24± 0.08，Zeta电势为-14.65 ± 5.01 mv。装载后ASPR-NP纳米颗粒粒径约增大了40%，说明ASPR-FA-NP已装载了FA。装载FA后Zeta电势绝对值增加，说明体系中稳定性增强。

滴加ASPR-FA-NP于硅片上自然风干后，经SEM观察其形貌，如图7-C所示。由图中可以看出，风干使得颗粒聚集黏连成片，但分散性相较于ASPR-NP好（图3-C），颗粒形貌凹凸不平，近似不规则球形。

实施例6： ASPR-FA-NP的包埋率与载药率计算

采用HPLC法测定FA含量，得到FA标准曲线色谱如附图8-A所示，图中可见FA呈单峰，分离效果较佳。根据内标法描绘标准品的浓度及峰面积之间的线性关系，相关系数R²=0.9998，线性相关性良好（图8-B）。由于包埋过程中对FA进行了热处理，因此确定测定方法前，对经过加热及未加热的FA标准品溶液进行全波长扫描（附图8-C）。由图8-C可知，两种样品全波长扫描曲线一致，加热并未导致FA紫外吸收峰发生变化，因此可用HPLC方法进行分离后FA含量测定。FA的包埋率与载药率的计算公式如下所示。

公式1

式中：B1：超滤前FA总量（mg）；B2：超滤滤出液FA总量（mg）

公式2

式中：B1：超滤前FA总量（mg）；B2：超滤滤出液FA总量；B3：颗粒总量（mg），（B1-B2）+超滤前蛋白总量×组装率

通过HPLC法测定超滤前后FA含量变化，数据结果表明，装载前FA含量为2.465 mg，装载后经过超滤分离，游离FA含量剩余1.721 mg。已知装载FA的蛋白组装率为16 %，即此时自组装的蛋白为0.4 mg，根据公式1及公式2，计算得FA包埋率约为30%，ASPR对FA的载药率约为65%。

实施例7： ASPR-FA-NP的稳定性

取ASPR-FA-NP溶液分为2组，每组7管，分别于4 ℃和-20 ℃情况下探究其稳定性。每种情况各放置1-7 d，期间每天取出于30 ℃水浴锅孵育30 min，然后用激光粒度仪进行粒径、Zeta电势测定。

由图9可知，ASPR-FA-NP在4 ℃或-20 ℃下存储时，颗粒的粒径和电位走向总体平稳，数值变化不大这说明ASPR-NP可在4℃和-20℃条件下长时间稳定保存。

实施例8：ASPR、ASPR-NP和ASPR-FA-NP体外细胞毒性测定

取对数期细胞L-02（人正常肝细胞）、Hep G2（人肝癌细胞），接种于96孔板中，细胞浓度为1×10⁴/mL（0.1 mL/孔）。培养24 h后，经1200 rpm，离心5 min，吸掉培养液，实验组分别加入不同终浓度的当归ASPR蛋白、ASPR-NP和ASPR-FA-NP (0.625 mg/mL、0.5 mg/mL、0.375mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL)，空白对照组加入基础培养基，每组设三个复孔，置于37℃，5% CO₂下24h。然后1200 rpm ，离心5 min，甩去上清，向板内加入MTT（3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5- diphenyltetrazoliumbromide）溶液50 μL，37 ℃培养4 h，再加入DMSO溶解液，混匀10 min，570 nm测OD值，按公式3计算细胞存活率，结果如附图10所示。

公式3

式中：A1：样品组吸光值；A2: 对照组吸光值；A3：空白组吸光值

由附图10可知，ASPR蛋白可促进正常细胞增殖，对肝癌细胞基本没有影响；ASPR-NP对正常细胞和肝癌细胞都有促增殖作用； ASPR-FA-NP颗粒，则可选择性促进正常肝细胞增殖同时抑制肝癌细胞增殖。

实施例9：ASPR、ASPR-NP和ASPR-FA-NP的血液相容性

将小鼠血液收集在含有2 mg 抗凝剂 的离心管中，重新悬浮，并以1000 g离心10min。取出上清液，将离心管底部收集的红细胞用10倍体积的无热原生理盐水轻轻重悬洗三次，然后在室温下以1000 g离心10ming。

用生理盐水将红细胞沉淀轻轻重悬，稀释至0.8％（v / v）。将悬浮的红细胞溶液置于无菌EP中，并加入各种测试样品放置1小时以评估其溶血潜能。测试样品为不同浓度的ASPR-NP及ASPR-FA-NP，其浓度定量以蛋白浓度为标准。Triton X（1％）用作监测最大溶血的阳性对照，用生理盐水处理的红细胞悬浮液用作阴性对照。测量405 nm处的吸光度作为释放到上清液中的血红蛋白的指标，结果如附图11所示。由图11可知，1%Triton使红细胞完全破裂释放出血红蛋白，而不同浓度的ASPR、ASPR-NP及ASPR-FA-NP溶血率皆低于5%，即三者基本不会使健康红细胞溶血，符合医用生物材料的国家标准，具有生物安全性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种当归蛋白自组装颗粒及应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 当归蛋白

<400> 1

Gly Ile Gln Lys Thr Glu Val Glu Ala Pro Ser Thr Val Ser Ala

1 5 10 15

Claims (5)

1.一种当归蛋白自组装颗粒，其特征在于：所述当归蛋白的N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA。

2.根据权利要求1所述的一种当归蛋白自组装颗粒，其特征在于：其制备方法为将0.5mg/mL的当归蛋白pH调至8.0，经过100℃加热15 min，室温冷却半小时，用100 KDa超滤管反复三次去除未反应的当归蛋白，即获得自组装的当归蛋白颗粒。

3.如权利要求1所述的当归蛋白自组装颗粒用于包埋难溶性小分子的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的难溶性小分子为阿魏酸。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述颗粒用于制备选择性抑制肝癌细胞增殖的药物。