CN105709238A - 包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米颗粒，具体公开了包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒及其制备方法。所述纳米颗粒以白藜芦醇作为内核，以四级结构被打开的改性花生蛋白作为外壳。所述制备方法为：利用碱溶酸沉从花生粕中分离提取花生蛋白，花生蛋白经碱改性和热改性打开四级结构，暴露活性基团，再与白藜芦醇混合，经金属离子诱导花生蛋白分子间形成小的聚集体，从而促进各聚集体通过疏水相互作用形成包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒。本发明以花生粕为原料，分离提取其中的花生蛋白并用作制备包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的原料，有利于花生副产物的综合利用，同时提高花生粕的附加值。

Description

包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米颗粒，具体地说，涉及包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒。
背景技术
白藜芦醇是一种生物性很强的天然的多酚类蒽醌萜化合物，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂，具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏等作用。然而其性质不稳定、水溶性差、生物利用度低，在强酸强碱、光照及较高温度下容易发生氧化，且经人体摄入后在胃环境中容易分解破坏而失去活性，因此研究和发展一种白藜芦醇的载体，对其进行包封，以保持其活性及提高其生物利用率尤为必要。
为提高白藜芦醇的稳定性和生物利用度，采用纳米体系对其保护是目前最有效的手段之一。纳米颗粒是指粒径小于1μm的球状胶体颗粒，其根据材料可分为生物降解型和非生物降解型两类。目前，生物降解型纳米颗粒被广泛应用于生物医学领域及功能性食品领域，其主要作为药物/营养物质的递送载体。在生物医学领域，生物降解型纳米颗粒作为药物的递送载体，具有明显的药物缓释功能，可增加药物疗效，降低其毒副作用，减少对生物机体组织器官的损害；在功能性食品领域，生物降解型纳米颗粒作为营养物质的递送载体，可以为所包埋的营养物质提供更好的保护和缓释作用，从而提高营养物质的生物利用率。
花生蛋白资源丰富，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒无害，且与动物性蛋白相比，不存在受病毒污染等安全性问题。考虑其作为白藜芦醇的载体，具有优良的纳米成粒性和保护缓释效果，是很好的制备纳米颗粒的材料。
然而，花生蛋白的结构为紧密的四级结构，无活性基团暴露，无法与白藜芦醇作用生成载白藜芦醇纳米颗粒。因此，亟需开发一种能够利用花生蛋白包埋白藜芦醇制备纳米颗粒的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒，所述纳米颗粒以白藜芦醇作为内核，以四级结构被打开的改性花生蛋白作为外壳。
所述白藜芦醇为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯，是多酚类化合物，可提取自葡萄(红葡萄酒)、虎杖、花生、桑椹等植物，也属市售可得商品，例如，可购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
所述改性花生蛋白经碱处理及热处理，四级结构打开，活性基团暴露，更易于纳米颗粒的形成。
进一步地，所述改性花生蛋白是由花生蛋白先后经碱改性和热改性处理得到，具体为：将花生蛋白溶于水，调节pH为9-12后，加热至50-90℃，保持20-60min。所述花生蛋白经过所述改性处理后，能够达到上述性质，实现上述目的。
更进一步地，本发明所述的花生蛋白是由花生粕经碱溶酸沉法分离提取得到，具体为：将花生粕粉碎，得到花生蛋白粉，按照1:7-10的质量比加入去离子水进行调浆，调节pH9-10，搅拌后离心收集滤液，调节滤液pH4-5，离心收集沉淀，洗涤至中性后加水复溶，干燥后得到所述花生蛋白。该分离提取方法得到的花生蛋白的蛋白含量高，在90％以上。
优选地，具体的分离提取方法为：将花生粕进行粉碎，得到花生蛋白粉，按照1：10的质量比加入一定量的去离子水进行调浆，调节pH9.0，室温搅拌2h，进行离心后收集滤液，并调节滤液pH4.5。静置30min后再一次离心，收集沉淀，并加入一定量的去离子水进行沉淀的洗涤，洗涤至中性后加水复溶，喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到花生分离蛋白，所述喷雾干燥器的进口温度设置为130-150℃，出口温度为70℃，所得花生分离蛋白的蛋白含量为90.44％。
第二方面，本发明针对前述纳米颗粒提供具体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤A：将花生蛋白与水混合，得到花生蛋白含量为1-10mg/mL的混合液；
步骤B：调节花生蛋白溶液pH为9-12；
步骤C：将步骤B所得加热至50-90℃，保持20-60min；
步骤D：待步骤C所得冷却后，调节pH至中性；
步骤E：在避光条件下将白藜芦醇与乙醇混合，得到白藜芦醇质量浓度为0.01-0.1％白藜芦醇乙醇溶液；
步骤F：在避光条件下向步骤D得到的花生蛋白溶液中添加步骤E中得到的白藜芦醇乙醇溶液，搅拌1-3h得到白藜芦醇与花生蛋白的混合溶液；
步骤G：在避光条件下向步骤F得到的混合溶液中添加浓度为3-6mM的Ca2+，添加量为混合溶液体积的10-20％，得到包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液。
步骤H：将步骤G得到的纳米颗粒溶液进行脱盐处理；
步骤I：将步骤H所得进行干燥，即得包埋白藜芦醇的固体花生蛋白纳米颗粒。
进一步地，步骤F中白藜芦醇的质量为花生蛋白质量的0.1～1.2％。在该配比条件下，能够较好的实现花生蛋白纳米颗粒对白藜芦醇的包封，优选白藜芦醇的质量为花生蛋白质量的0.7％。
作为优选，步骤E中将白藜芦醇与95％的乙醇溶液混合。利用95％的乙醇溶液作为溶剂，能够对白藜芦醇起到更好的溶解作用。
在步骤B和步骤D中，利用浓度为0.1-5M的NaOH或浓度为0.1-5M的HCL调节pH值。
最为优选地，本发明提供最佳的制备方法用于制备包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒，具体如下：称取花生蛋白溶于蒸馏水中，得到花生蛋白含量为5.96mg/mL的混合液，用0.5MNaOH将pH调至11，将上述溶液在85℃条件下水浴加热30min，静置冷却至室温后用HCL将pH调至7.0，得到改性花生蛋白溶液；将白藜芦醇溶于95％的乙醇溶液得到白藜芦醇质量浓度为0.0348％白藜芦醇乙醇溶液，向改性花生蛋白溶液中添加30mL所述白藜芦醇乙醇溶液，避光条件下搅拌反应1.5h。向上述溶液中加入80mL浓度为5.05mM的CaCl2溶液，蒸馏水定容至500mL，室温下静置16h，即得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液，将获得的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行透析脱盐，喷雾干燥后得包埋白藜芦醇的固体花生蛋白纳米颗粒。
进一步地，前述步骤中所述的脱盐为透析脱盐，超滤脱盐或平衡渗析脱盐；所述的干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明的有益效果在于：
本发明对花生蛋白进行碱处理和热处理，破坏花生蛋白的四级结构，使其结构打开，暴露活性基团，为制备纳米颗粒提供基础。本发明还通过添加金属离子诱导花生蛋白分子间形成小的聚集体，从而促进各聚集体通过疏水相互作用形成纳米颗粒。本发明以花生粕为原料，分离提取其中的花生蛋白并用作制备包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的原料，有利于花生副产物的综合利用，同时提高花生粕的附加值。
本发明中包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的制备方法，工艺操作简单，无需特殊设备，且制备过程中未涉及有机试剂，适宜工业化生产。本发明的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒具有稳定性好、生物相容性好、缓释时间长、包载率高等优点，可应用于食品、保健品、药品及化妆品等多个领域。
附图说明
图1为本发明所述的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的制备方法示意图。
图2为本发明实验例1所制备的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的透射电镜图。
图3为本发明实验例1所制备的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的粒径分析结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1所示，所述的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：花生蛋白溶液的配制，将花生蛋白与一定量的蒸馏水混合。
步骤B：碱处理，将所述花生蛋白溶液用NaOH调节其pH为9-12。
步骤C：热处理，将步骤B中所得花生蛋白溶液加热至50-90℃，并保持20-60min。
步骤D：将步骤C中所得花生蛋白溶液在室温下静置冷却，并用HCL调节其pH为7。
步骤E：白藜芦醇溶液的配制：在避光条件下将白藜芦醇与95％的乙醇溶液混合。
步骤F：在避光条件下向步骤D中得到的花生蛋白溶液中添加步骤E中得到的白藜芦醇溶液，磁力搅拌1-3h得白藜芦醇与花生蛋白的混合溶液。
步骤G：避光条件下向步骤F中得到的白藜芦醇与花生蛋白的混合溶液中添加金属离子，定容，静置8-24h，得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液。
步骤H：将步骤G中得到的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行脱盐处理。
步骤I：将步骤H中所得脱盐后包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行干燥，即得包埋白藜芦醇的固体花生蛋白纳米颗粒。
所述的包埋花生蛋白纳米颗粒的制备方法中，步骤H中，所述的脱盐可用透析脱盐，超滤脱盐或平衡渗析脱盐。其中，所述透析脱盐所用透析袋的截留分子量为7kDa，透析时间1h。
所述的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的制备方法中，步骤I中，所述的干燥可用喷雾干燥器进行喷雾干燥，或采用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到固体花生蛋白纳米颗粒。其中，所述喷雾干燥器的进口温度设置为140-160℃，出口温度为70-80℃。
以下实施例均通过透射电子显微镜分析及纳米粒度分析进行检测，透射电镜分析仪器为日本日立公司H-7500透射电子显微镜，纳米粒度分析仪器为英国马尔文仪器有限公司Zeta电位分析仪。
所得到的纳米颗粒的粒径范围为10-700nm。
其中，步骤A所述的花生蛋白为通过碱溶酸沉法从花生粕中提取得到的花生蛋白。其具体的提取方法为：将花生粕进行粉碎，得到花生蛋白粉，按照1：10的质量比加入一定量的去离子水进行调浆，调节pH9.0，室温搅拌2h，进行离心后收集滤液，并调节滤液pH4.5。静置30min后再一次离心，收集沉淀，并加入一定量的去离子水进行沉淀的洗涤，洗涤至中性后加水复溶，喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到花生分离蛋白，所述喷雾干燥器的进口温度设置为130-150℃，出口温度为70℃，所得花生分离蛋白的蛋白含量为90.44％。
实施例1
称取1.49g经碱溶酸沉提取得到的花生蛋白溶于250mL蒸馏水中，配成初始浓度为5.96mg/mL的花生蛋白溶液，用0.5MNaOH将pH调至11。将上述溶液在85℃条件下水浴加热30min，静置冷却至室温后用HCL将pH调至7.0，得到改性花生蛋白溶液。
将白藜芦醇溶于95％的乙醇溶液得到白藜芦醇质量浓度为0.0348％白藜芦醇乙醇溶液，向改性花生蛋白溶液中添加30mL前述白藜芦醇乙醇溶液，避光条件下搅拌反应1.5h。向上述溶液中加入80mL浓度为5.05mM的CaCl2溶液，蒸馏水定容至500mL，使最终溶液中的蛋白浓度为初始蛋白浓度的1/2，室温下静置16h，即得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液，将获得的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行透析脱盐，喷雾干燥后得固体包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒。
实验例1
将实施例1制备的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒用透射电子显微镜观察粒径形貌。取一定质量所制备的包埋白藜芦醇的固体花生蛋白纳米颗粒复溶于蒸馏水中，配成浓度为1mg/mL的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液。取一滴上述溶液加到覆有聚乙烯醇缩甲醛脂膜的铜网上，铜网水平放置2～3min使分子聚集体沉积到网面上，用滤纸吸去表面多余溶液，之后滴加2％的醋酸双氧釉溶液对纳米颗粒进行负染2min，将铜网在滤纸上放置3min使充分染色并吸取多余的染液，干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。结果如图2所示。
将上述配制的浓度为1mg/mL的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液用Zeta电位分析仪检测粒径及分布。所得纳米颗粒的粒径分布如图3所示，在70-400nm之间。其中，纵坐标为包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的数量百分比，横坐标为包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的粒径(nm)。所得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的平均粒径为100.06nm。经检测，载药量为0.68％，包封率为82.2％。
实施例2
称取2.5g经碱溶酸沉提取得到的花生蛋白溶于250mL蒸馏水中，配成初始浓度为10mg/mL的花生蛋白溶液，用0.5MNaOH将pH调至11。将上述溶液在85℃条件下水浴加热30min，静置冷却至室温后用HCL将pH调至7.0，得到改性花生蛋白溶液。
将白藜芦醇溶于95％的乙醇溶液得到白藜芦醇质量浓度为0.075％白藜芦醇乙醇溶液，向溶液中添加30mL前述白藜芦醇乙醇溶液，避光条件下搅拌反应1.5h。向上述溶液中加入80mL浓度为5.50mM的CaCl2溶液，蒸馏水定容至500mL，使最终蛋白浓度为初始蛋白浓度的1/2，室温下静置16h，即得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液，将获得的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行透析脱盐，喷雾干燥后得固体包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒。
包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的粒径及分布检测同实验例1，粒径分布在90-500nm之间，平均粒径为101.37nm。经检测，载药量为0.71％，包封率为77.54％。
实施例3
称取1.49g经碱溶酸沉提取得到的花生蛋白溶于250mL蒸馏水中，配成初始浓度为5.96mg/mL的花生蛋白溶液，用0.5MNaOH将pH调至10。将上述溶液在85℃条件下水浴加热30min，静置冷却至室温后用HCL将pH调至7.0，得到改性花生蛋白溶液。
将白藜芦醇溶于95％的乙醇溶液得到白藜芦醇质量浓度为0.0447％白藜芦醇乙醇溶液，向溶液中添加30mL前述白藜芦醇乙醇溶液，避光条件下搅拌反应1.5h。向上述溶液中加入80mL浓度为6.00mM的CaCl2溶液，蒸馏水定容至500mL，使最终蛋白浓度为初始蛋白浓度的1/2，室温下静置16h，即得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液，将获得的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行透析脱盐，喷雾干燥后得固体包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒。
包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒的粒径及分布检测同实验例1，粒径分布在90-500nm之间，平均粒径为108.56nm。经检测，载药量为0.77％，包封率为79.78％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒以白藜芦醇作为内核，以四级结构被打开的改性花生蛋白作为外壳。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述改性花生蛋白是由花生蛋白先后经碱改性和热改性处理得到，具体为：将花生蛋白溶于水，调节pH为9-12后，加热至50-90℃，保持20-60min。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述花生蛋白是由花生粕经碱溶酸沉法分离提取得到，具体为：将花生粕粉碎，得到花生蛋白粉，按照1:7-10的质量比加入去离子水进行调浆，调节pH9-10，搅拌后离心收集滤液，调节滤液pH4-5，离心收集沉淀，洗涤至中性后加水复溶，干燥后得到所述花生蛋白。
4.权利要求1-3任意一项所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤A：将花生蛋白与水混合，得到花生蛋白含量为1-10mg/mL的混合液；
步骤B：调节花生蛋白溶液pH为9-12；
步骤C：将步骤B所得加热至50-90℃，保持20-60min；
步骤D：待步骤C所得冷却后，调节pH至中性；
步骤E：在避光条件下将白藜芦醇与乙醇混合，得到白藜芦醇质量浓度为0.01-0.1％白藜芦醇乙醇溶液；
步骤F：在避光条件下向步骤D得到的花生蛋白溶液中添加步骤E中得到的白藜芦醇乙醇溶液，搅拌1-3h得到白藜芦醇与花生蛋白的混合溶液；
步骤G：在避光条件下向步骤F得到的混合溶液中添加浓度为3-6mM的Ca2+，添加量为混合溶液体积的10-20％，得到包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液。
步骤H：将步骤G得到的纳米颗粒溶液进行脱盐处理；
步骤I：将步骤H所得进行干燥，即得包埋白藜芦醇的固体花生蛋白纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤F中白藜芦醇的质量为花生蛋白质量的0.1～1.2％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤E中将白藜芦醇与95％的乙醇溶液混合。
7.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤B中利用浓度为0.1-5M的NaOH调节pH值。
8.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤D中利用浓度为0.1-5M的HCL调节pH值。
9.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：称取花生蛋白溶于蒸馏水中，得到花生蛋白含量为5.96mg/mL的混合液，用0.5MNaOH将pH调至11，将上述溶液在85℃条件下水浴加热30min，静置冷却至室温后用HCL将pH调至7.0，得到改性花生蛋白溶液；将白藜芦醇溶于95％的乙醇溶液得到白藜芦醇质量浓度为0.0348％白藜芦醇乙醇溶液，向改性花生蛋白溶液中添加30mL所述白藜芦醇乙醇溶液，避光条件下搅拌反应1.5h。向上述溶液中加入80mL浓度为5.05mM的CaCl2溶液，蒸馏水定容至500mL，室温下静置16h，即得包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液，将获得的包埋白藜芦醇的花生蛋白纳米颗粒溶液进行透析脱盐，喷雾干燥后得包埋白藜芦醇的固体花生蛋白纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述花生蛋白是由花生粕经碱溶酸沉法分离提取得到，具体为：将花生粕粉碎，得到花生蛋白粉，按照1:7-10的质量比加入去离子水进行调浆，调节pH9-10，搅拌后离心收集滤液，调节滤液pH4-5，离心收集沉淀，洗涤至中性后加水复溶，干燥后得到所述花生蛋白。
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