CN108587963A - 一株从木薯渣中筛选到的Lysinibacillus macroides及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株Lysinibacillus macroides,其分类命名为Lysinibacillus Xi9。本发明的菌株产生的挥发性物质对拟南芥具有促生效果,能够增加拟南芥的生物量,促进侧根的增加、伸长。步骤简单、操作方便、实用性强。

Description

一株从木薯渣中筛选到的Lysinibacillus macroides及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一株从木薯渣中筛选到的Lysinibacillusmacroides及其应用,具体涉及一株能够产生挥发性物质具有促生作用的Lysinibacillusmacroides。
背景技术
挥发性物质具有低分子量、弱极性、低沸点、亲脂性的特点,与微生物的其他代谢产物相比,挥发性物质(volatile organic compounds,VOCs)具有传播距离长、低浓度即被感知、生物体间非直接接触即可相互作用等优势。目前,关于植物根际促生细菌产生的挥发性物质的研究主要集中在引起植物系统抗性、抑制植物病原菌等方面,张鹏鹏等从植物根际分离得到了13株产生挥发性物质对拟南芥幼苗的生长有影响的细菌,它们分属于Enterobacter endosymbiont、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、短短芽胞杆菌(Brevibacillusbrevis)、生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)和巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)。但关于细菌产生的挥发性物质调节植物的生长研究还较少。
Lysinibacillus macroides是芽孢杆菌的一个种,曾用名Lineola longa、Bacillus macroides。目前为止,有关Lysinibacillus macroides既能够产生挥发性物质又能够产生吲哚乙酸的应用很少。
发明内容
为了克服上述问题,本申请公开了一株从木薯渣中分离得到的Lysinibacillusmacroides,其产生的挥发性物质对拟南芥幼苗具有较好的促生效果,挥发性物质能够使拟南芥幼苗与碳源和氮源吸收利用有关的基因表达上调。
由于菌株种属、来源和分离方式对菌株的挥发性物质的性能有较大影响,为了扩大Lysinibacillus macroides的应用领域、寻找“可产生挥发性物质、并对拟南芥幼苗具有较好促生效果”的新菌株,本申请对不同来源的Lysinibacillus macroides产生的挥发性物质的性能进行了系统研究,大规模实验摸索中偶然发现了一株Lysinibacillusmacroides,该菌株的挥发性物质能够改变拟南芥根构型及其吸收碳、氮等营养成分相关基因表达上调,促进拟南芥总生物量的增加。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
根据本发明的第一方面,提供一株产生的挥发性物质VOCs能够促进拟南芥幼苗生长的菌株,其分类命名为Lysinibacillus macroides Xi9,保藏编号为:CGMCC NO.15563,保藏日期为2018年04月08日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步地,所述菌株能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)。
该菌是从木薯渣中分离得到,该菌株的菌落及菌体特征为:在LB固体培养基上37℃培养48h,菌落潮湿,质地松散,圆形,奶油色,边缘光滑,表面光滑,直径1.0-5.0毫米。显微镜观察菌体形态特征为杆状,单细胞,革兰氏染色为阳性,有芽孢。
该菌株的生理生化特征为:接触酶实验阳性,柠檬酸盐利用实验阳性,丙二酸盐利用实验阳性,V-P实验阳性。
根据本发明的第二方面,提供能够促进拟南芥幼苗生长的挥发性物质VOCs,所述挥发性物质VOCs可获得自Lysinibacillus macroides Xi9。
根据本发明的第三方面,提供包含上述的VOCs的组合物。
具体地,所述组合物是气体肥料。
具体地,所述组合物是诱导剂。
具体地,所述组合物是生长促进剂。
根据本发明的第四方面,提供一种检测挥发性物质的方法,采用SPME-GC-MS法分析菌株产生的VOCs。
优选的,所述方法包括:选用65μm PDMS/DVB蓝色萃取头,Rtx-5石英毛细管柱;谱图检索采用Nist14和Nist14s谱库检索。
根据本发明的第五方面,提供菌株Lysinibacillus macroides Xi9及其产生的挥发性物质VOCs在改变拟南芥根构型及其基因表达,增加拟南芥的生物量的应用。
该应用中,采用二分隔板法,一边加1/2MS培养基用于培养拟南芥种子,另一边加入LB培养基用于培养细菌。
拟南芥种子预处理:
1.将种子放70%(v/v)的酒精中处理5min,将酒精用移液器尽可能地吸干净;
2.加入2.6%(v/v)的次氯酸钠溶液处理10min,用移液器吸干净;
3.用无菌Tween20水冲洗5-6次,去除残留的次氯酸钠;
4.将处理好的种子放4℃冰箱中春化2d;
在二分隔板平板内分别加入1/2MS和LB培养基,在1/2MS上培养拟南芥幼苗,每皿5棵长势一致的拟南芥幼苗,在LB培养基上培养细菌,每皿加入10μL菌液(1×108CFU/mL),用封口膜封好,每个处理做5个重复,放光照培养箱中培养7d观察结果。培养温度22℃,设置16h光照,8h黑暗周期。处理5天后取幼苗,进行转录组测序;处理7天后,测定菌对拟南芥幼苗的促生效果,包括侧根数、根密度、鲜重等指标。
本发明的有益效果
(1)本发明从木薯渣中分离得到一株Lysinibacillus macroides Xi9,该菌株具有产IAA的功能,其产生的VOCs具有促进拟南芥幼苗生长的作用。
(2)该菌株产生的VOCs能够促进拟南芥幼苗的生长,处理组拟南芥幼苗的侧根数提高了108.60%,根密度提高了148.63%,鲜重提高了136.07%;其根毛增多,根尖伸长。植株侧根的增加能够促进植株更好地吸收养分,从而促进植株整体的快速生长。拟南芥中与碳、氮营养转运、吸收和利用有关的基因表达上调。
(3)本发明检测方法简单、检测效率高、实用性强,易于推广。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。
图1:菌株Xi9产IAA效果图,其中,左图为对照(透明无色),右图为去除菌体的发酵液(粉红色);
图2A、2B:菌株Xi9的挥发性物质对拟南芥的影响;
图3:菌株Xi9的挥发性物质对拟南芥根长、侧根数、根密度及鲜重的影响。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合具体的实施例,对本发明做进一步的说明。
实施例1:菌株的分离、筛选
1.菌株的分离与筛选
(1)菌株的分离
该菌种从木薯渣中筛得,样品采自山东烟台。将木薯渣粉碎,称取木薯渣样品10g,放入90mL无菌水中,振荡30min后制成悬浮液。分别吸取1mL悬浮液,进行10倍梯度稀释后,分别取10-4、10-5、10-6稀释度200μL涂布于LB平板上,倒置培养于37℃恒温培养箱中培养约48h。挑选代表性菌落于平板上再通过三区划线法纯化,纯化后的微生物分离物保存于斜面中备用。
2.菌株Xi9的形态及生理生化特征测定
(1)菌落特征及菌体形态
该菌株的菌落及菌体特征为:在LB培养基上37℃培养48h,菌落潮湿,质地松散,圆形,奶油色,边缘光滑,表面光滑,直径1.0-5.0毫米。显微镜观察菌体形态特征为杆状,单细胞,革兰氏染色为阳性,有芽孢。
(2)生理生化特征
该菌株的生理生化特征为:接触酶实验阳性,柠檬酸盐利用实验阳性,丙二酸盐利用实验阳性,V-P实验阳性。
3.菌株Xi9的16S rDNA序列测定与分析
对Xi9菌株16S rDNA序列进行PCR扩增,得到1456bp的PCR产物。将Xi9的16S rDNA序列提交GenBank,所得收录号为JQ579621.1。将其16S rDNA序列进行BLAST比对,结果显示Xi9与芽孢杆菌属的多个不同种的相似性均在99%以上,结合菌株的形态、培养特征及生理生化分析结果,初步鉴定菌株Xi9为Lysinibacillus macroides。
实施例2:菌株Xi9产IAA实验
向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液体培养基中10%接种量接菌,28℃,180rpm,摇床培养4d。取2mL菌悬液12000rpm离心10min,取上清液1.5mL加比色液1.5mL,暗处反应30min后观察,颜色变红者表示能够分泌IAA(如图1所示)。
实施例3:菌株Xi9挥发性物质对拟南芥的影响
(1)材料与方法:采用二分隔板法,一边加1/2MS培养基用于培养拟南芥幼苗,另一边加入LB培养基用于培养细菌。拟南芥种子表面消毒处理后放4℃冰箱中春化2d,将拟南芥种子点接到1/2MS培养基中置光照培养箱中培养,4d后挑选长势一致的拟南芥幼苗培养于二分隔板的1/2MS一边,每皿5株;另一半加入1×108CFU/mL菌液10μL。用封口膜封好置于光照培养箱中培养。光照培养箱的条件设置为白天16h,黑夜8h,温度22℃,光照为40%。处理5天后取幼苗,进行转录组测序;处理7天后测定菌对拟南芥幼苗的促生效果,包括侧根数、根密度、鲜重等指标。
(2)实验结果
拟南芥与碳氮代谢有关的基因表达情况如表1所示。
表1
高亲和NO3 -转运蛋白NRT2家族基因NRT2.1是根成熟区吸收NO3 -的主要载体,在根系形态构建中起着重要做用;低亲和NO3 -转运蛋白NRT1家族基因NRT1.8主要是在叶中表达,属于卸载转运蛋白。在转录组中,NRT2.1和NRT1.8的log2值分别为6.60和3.00,NRT2.3、NRT2.6也全部上调。ANR1为响应来自外部NO3 -信号的侧根生长的关键调节剂,转录组中ANR1的log2值为5.65。硝酸盐吸收转运蛋白上调,促进氮素的吸收,从而促进拟南芥生长,促进地上部分的增长;同时ANR1响应NO3 -信号,增加侧根长度和数目。
淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、柠檬酸循环(TCA循环)等与糖代谢相关途径的基因不同程度上调,可能是细菌挥发性物质能够促进拟南芥碳源、氮源的合成及利用,从而促进拟南芥生物量的增加。
经过细菌处理后,拟南芥的侧根数平均为44.7个/株,根密度平均为10.6个/cm,鲜重平均为0.017g/株,如图2A、2B和图3。与对照组相比,拟南芥的侧根数、根密度、鲜重均达到极显著差异(p≤0.01),分别比对照组提高了108.6%、148.63%、137.5%。
实施例4:菌株Xi9挥发性物质的测定
(1)材料与方法:采用SPME-GC-MS法分析菌株产生的VOCs。选用65μm PDMS/DVB蓝色萃取头,Rtx-5石英毛细管柱;谱图检索采用Nist14和Nist14s谱库检索。
(2)试验结果:
最后应该说明的是,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一株从木薯渣中筛选到的Lysinibacillus macroides及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 菌株Xi9
<400> 1
tgaaataacg cgcgtgctat agtcagtcga gcgaacagaa aaggagcttg ctcctttgac 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctacc ctatagtttg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc gaataatctc ttttgcttca tggtgaaaga ctgaaagacg 180
gtttcggctg tcgctatagg atgggcccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaatggc 240
tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg gcgaaagcct 360
gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgtaaggg 420
aagaacaagt acagtagtaa ctggctgtac cttgacggta ccttattaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtcctttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccaagtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat ttggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
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caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccatcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
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agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttgga gccagccgcc 1440
gaaggtg 1447

Claims (10)

1.一株产生的挥发性物质VOCs能够促进拟南芥幼苗生长的菌株,其特征在于,其分类命名为Lysinibacillus macroides Xi9,保藏编号为:CGMCC NO.15563,保藏日期为2018年04月08日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的菌株,其特征在于,所述菌株能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)。
3.能够促进拟南芥幼苗生长的挥发性物质VOCs,其特征在于,所述挥发性物质VOCs可获得自Lysinibacillus macroides Xi9。
4.包含权利要求3所述的VOCs的组合物。
5.权利要求4所述的VOCs的组合物,其特征在于,所述组合物是气体肥料。
6.权利要求4所述的VOCs的组合物,其特征在于,所述组合物是诱导剂。
7.权利要求4所述的VOCs的组合物,其特征在于,所述组合物是生长促进剂。
8.一种检测挥发性物质的方法,其特征在于,采用SPME-GC-MS法分析菌株产生的VOCs。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述方法包括:选用65μm PDMS/DVB蓝色萃取头,Rtx-5石英毛细管柱;谱图检索采用Nist14和Nist14s谱库检索。
10.菌株Lysinibacillus macroides Xi9及其产生的挥发性物质VOCs在改变拟南芥根构型及其基因表达,增加拟南芥的生物量的应用。
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