CN108586588B - 一种生物活性多肽apmisaasvh及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽APMISAASVH及其制备方法和应用，生物活性多肽APMISAASVH其氨基酸序列为Ala‑Pro‑Met‑Ile‑Ser‑Ala‑Ala‑Ser‑Val‑His。经过体外抗氧化实验、体内抗衰老实验，验证了多肽APMISAASVH具有较好的抗氧化生物学活性和抗衰老活性，一方面，本发明的生物活性多肽APMISAASVH具有较好的抗氧化活性，能够清除机体内的自由基，提高生命的质量；另一方面，能够提高体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性刺激的功能，从而降低机体老化、衰老和生病的机率，对开发具有抗氧化功能、抗衰老功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽APMISAASVH及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性多肽APMISAASVH及其制备方法和应用。
背景技术
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。乳酸菌菌体也存在一些自身合成的蛋白质多肽片段，供细菌生长利用。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性肽”。
在天然食物来源中寻找安全的生物活性肽尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的生物活性，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有生物活性的多肽是由2～20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。
氧化反应和氧化代谢对于食物和人体来说都是至关重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反应。当过量的自由基形成，它们会超过保护性酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的保护作用，从而导致脂质氧化、细胞凋亡等一系列的副作用产生。这一类的氧化反应，不仅影响含脂食物的保质期，也对人体的健康造成了一定的危害，如风湿性关节炎、糖尿病、动脉硬化等。此外，Collins等人2005年研究发现癌症的发生也与DNA的氧化损伤有关。
早期一些人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)被运用到食品中，作为脂质的抗氧化剂，但这些人工合成的添加剂对于人体都有潜在的风险。在天然抗氧化剂的研究过程中，来源于食物蛋白的抗氧化肽成为了热门研究之一。其不仅安全性高，比蛋白质等大分子营养物质更容易被吸收利用，能促进如钙、铁等微量营养素的吸收，还具有较好的抗氧化活性，应用前景广阔。
衰老是一个自然现象，且过程常伴有抗氧化水平、器官组织、免疫因子的变化，其中细胞因子发生着复杂的变化，如促炎细胞因子IL-6、IL-4、TNF-α等呈现增长的趋势，IL-6与TNF-a均被认为在老年性疾病的发生过程中扮演重要角色。随着遗传学和分子生物学的发展，生物衰老机理的研究取得了可喜的进展。研究人员通过利用一些模式生物，如小鼠、果蝇和秀丽线虫等的单一基因突变实验，发现有些基因能够显著增加这些生物体的寿命达6倍之多。
抗衰老肽作为一种新兴的抗衰老剂，在生理功能方面具有氨基酸所不能比拟的优势，其能对生物体内的酶产生促进或抑制作用，改善对矿物质及其他营养元素的吸收和利用，清除体内自由基，增强机体自身的抗氧化力，以延缓衰老。因此，生物活性肽的营养保健作用已成为国内外学者课题研究的重点。邱隽等人经实验研究发现，乳源性生物活性小肽能有效延长果蝇寿命，延缓其衰老，并且还具有较好的抗氧化作用，推测可能是其中富含琉基肽类。周之辉等发现牛初乳提取物能显著性提高老年人体内血清中SOD活力，减少其脂质过氧化物和增强机体抗氧化力，具有一定的抗衰老功能。
目前关于生物活性多肽的研究有很多，比如中国专利CN105254738A公布了一种来源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽DELQDKIH，中国专利CN105254739A公布了一种来源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽GTQYTD，中国专利CN105254740A公布了一种来源于αs2-酪蛋白的乳源性生物活性多肽NQFYQKF。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽APMISAASVH及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种生物活性多肽APMISAASVH，其氨基酸序列为Ala-Pro-Met-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser-Val-His，如SEQ ID NO：1所示。
较优的，所述生物活性多肽来源于瑞士乳杆菌菌体蛋白。具体来源于LBH_0495|m.461LBH_0495|g.461ORF LBH_0495|g.461LBH_0495|m.461type:complete len:309(+)LBH_0495:1-927(+)蛋白，并且为此蛋白第73～82位的氨基酸残基。LBH_0495|m.461LBH_0495|g.461ORF LBH_0495|g.461LBH_0495|m.461type:complete len:309(+)LBH_0495:1-927(+)蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
LBH_0495|m.461LBH_0495|g.461ORF LBH_0495|g.461LBH_0495|m.461type:complete len:309(+)LBH_0495:1-927(+)蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码此蛋白第73～82位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽APMISAASVH。
较优的，所述生物活性多肽具有抗氧化功能和抗衰老功能。
本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽APMISAASVH的核苷酸片段，其序列为：5’-cac caa tga tta gtg ccg cat cag tac acg-3’，如SEQ ID NO：2所示。
本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽APMISAASVH的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从瑞士乳杆菌菌体通过细胞破碎分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽APMISAASVH在制备具有抗氧化功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽APMISAASVH在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
本发明第六方面，提供了所述生物活性多肽APMISAASVH在制备同时具有抗氧化功能和抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
具体而言，本发明的生物活性多肽APMISAASVH可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗氧化和/或抗衰老的药物；并且由于本发明的生物活性多肽APMISAASVH通过胃肠道降解后的产物仍旧具有生物活性，因此还可以用于制备酸奶等食品、抗氧化的保健品，以及口服的用于制备具有抗氧化和/或抗衰老的药物。
本发明第七方面，提供了一种抗氧化产品，包括所述生物活性多肽APMISAASVH或所述生物活性多肽APMISAASVH的衍生物；所述的抗氧化产品包括抗氧化食品、抗氧化保健品、抗氧化药物或抗氧化化妆品；所述生物活性多肽APMISAASVH的衍生物，是指在生物活性多肽APMISAASVH的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第八方面，提供了一种抗衰老产品，包括所述生物活性多肽APMISAASVH或所述生物活性多肽APMISAASVH的衍生物；所述的抗衰老产品包括抗衰老食品、抗衰老保健品或抗衰老药物；所述生物活性多肽APMISAASVH的衍生物，是指在生物活性多肽APMISAASVH的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第九方面，提供了一种同时具有抗氧化功能和抗衰老功能的产品，包括所述生物活性多肽APMISAASVH或所述生物活性多肽APMISAASVH的衍生物；具有抗氧化功能和抗衰老功能的产品包括食品、保健品或药物；所述生物活性多肽APMISAASVH的衍生物，是指在生物活性多肽APMISAASVH的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明生物活性多肽APMISAASVH的有益效果为：本发明的生物活性多肽APMISAASVH具有较好的抗氧化活性和抗衰老活性；一方面，本发明的生物活性多肽APMISAASVH具有较好的抗氧化活性，能够清除机体内的自由基，提高生命的质量；另一方面，能够提高体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性刺激的功能，从而降低机体老化、衰老和生病的机率，对开发具有抗氧化功能、抗衰老功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质量色谱提取图(m/z＝1001.5128)；
图2：质荷比为1001.5128的片段的二级质谱图；
图3：质荷比为1001.5128的多肽az、by断裂情况；
图4：[DPPH·]甲醇标准曲线；
图5：生育酚Trolox标准曲线；
图6：生物活性多肽APMISAASVH对秀丽线虫在热应激下的影响；
图7：生物活性多肽APMISAASVH对秀丽线虫在氧化应激下的影响。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽APMISAASVH的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Ala适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Pro、Met、Ile、Ser、Ala、Ala、Ser、Val和His。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽APMISAASVH。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
Figure BDA0001655106760000071
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100-1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽APMISAASVH进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱提取图如图1所示，提取此峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2和3所示，可得此峰的多肽质荷比为1001.5128Da，保留时间是78.7min。
3)结果
由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比1001.5128Da的片段序列为Ala-Pro-Met-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser-Val-His(APMISAASVH)，记为SEQ ID NO：1。该片段与LBH_0495|m.461LBH_0495|g.461ORF LBH_0495|g.461LBH_0495|m.461type:complete len:309(+)LBH_0495:1-927(+)蛋白第73～82位的残基序列相对应，序列见SEQ ID NO：3。
实施例2生物活性肽的抗氧化活性实验
一、[DPPH·]法测定生物活性肽APMISAASVH的体外抗氧化活性
1.实验试剂及仪器：
试剂：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl[DPPH·])，日本Wako公司生产；甲醇，上海国药公司提供；实施例1获得的生物活性多肽APMISAASVH。
主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品。
2.实验方法：
(1)1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液
用分析天平称取0.349mg[DPPH·]溶于1mL甲醇溶液中，配制得到的1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液，锡纸避光保存，即配即用。
(2)[DPPH·]甲醇标准曲线的测定
在96孔板中按表1分别加入100μL[DPPH·]甲醇标准曲线样品，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。
表1[DPPH·]甲醇标准曲线溶液配制
Figure BDA0001655106760000081
Figure BDA0001655106760000091
根据实验结果，使用Excel拟合曲线并计算回归方程，结果见图4(回归方程：y＝-0.192x+0.2271，R2＝0.9991)。[DPPH·]甲醇标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.999，表明[DPPH·]甲醇标准曲线精密度和准确度均符合检测要求。从结果看，吸光度值与[DPPH·]含量呈反比关系，[DPPH·]含量越少，吸光值越高，即样品清除自由基的能力越强。
(3)[DPPH·]法测定生物活性肽APMISAASVH的抗氧化活性
1)样品组：在96孔板中加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液、按表2分别加入20μL不同浓度的待测样品(APMISAASVH)、阳性对照1(2.5mg/mL的Trolox)、阳性对照2(0.025mg/mL的Trolox)，和阴性对照(植酸)；
2)空白组：在同一96孔板上，以加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液和20μL去离子水的样品做空白对照。
待检测样品加样完毕后，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。按照下式计算自由基清除率，实验结果见表2。
公式：
Figure BDA0001655106760000092
表2[DPPH·]法测定生物活性多肽的抗氧化活性结果
Figure BDA0001655106760000093
从表2可以看出，作为阳性对照的2.5mg/mL的Trolox在相同条件下具有最强的清除自由基的能力，几乎能清除溶液中所有的自由基，其次为0.025mg/mL的Trolox、植酸、活性多肽。多肽APMISAASVH清除[DPPH·]自由基率随浓度变化呈现倒钟型，在浓度为2.5mg/mL处达到最高值，为27.66％。
二、ABTS法测定生物活性肽APMISAASVH体外抗氧化能力
1.实验试剂和仪器：
总抗氧化能力检测试剂盒(Total Antioxidant Capacity Assay Kit with ABTS法)，购自上海碧云天生物科技公司；ABTS溶液，氧化剂溶液，水溶性维生素E(Trolox溶液)(10mmol/L)，实施例1获得的生物活性多肽APMISAASVH。
主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品。
2.实验方法：
(1)ABTS工作液的配制
根据总抗氧化能力检测试剂盒说明书，将ABTS溶液和ABTS氧化剂溶液1:1混合，避光存放12-16h后使用。配好的ABTS母液在室温下避光存放，2-3天内稳定。使用前，用PBS稀释ABTS工作母液38-42倍，使得ABTS工作液的吸光度减去相应PBS空白对照后，A734为0.7±0.05，ABTS工作液锡纸避光保存，现配现用。
(2)生育酚(Trolox)标准曲线曲线的制作测定
在96孔板的每个检测孔中加入200μL ABTS工作液，标准曲线检测孔中按表3要求加入10μL用PBS稀释的生育酚(Trolox)溶液，空白对照孔中加入10μL PBS，轻轻混匀。室温孵育4min后，在734nm处检测吸光值。
表3生育酚(Trolox)标准曲线测定的溶液配制
Figure BDA0001655106760000101
根据实验的结果，用Excel拟合回归曲线并得出回归方程，结果见图5所示。Trolox标准曲线线性关系良好，其相关系数达到0.998，表明该标准曲线的准确度和精密性都符合检测要求，可用于后续结果计算。从图5中可以看出，Trolox标准曲线与吸光值呈现良好的反比关系，Trolox溶液的浓度越高，其在734nm下吸光值越低，即所测样品的清除自由基能力越强。
(3)ABTS法测定生物活性多肽APMISAASVH的抗氧化能力
在96孔板的每个检测孔中加入200μL ABTS工作液，样品检测孔中加入10μL待测样品，空白对照孔中加入10μL PBS，轻轻混匀。室温孵育4min后，用酶标仪在734nm处检测吸光值。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。总抗氧化能力表示方式以Trolox标准溶液的浓度来表示，按照下式计算自由基清除率，实验结果见表4。
总抗氧化能力(mmol/g)＝CTrolox/CS
式中：CTrolox——与样品吸光值相同的Trolox标准溶液浓度(mmol/L)
CS——合成多肽样品的浓度(mg/mL)
表4 ABTS法测定生物活性多肽APMISAASVH的总抗氧化能力结果
Figure BDA0001655106760000111
通过总抗氧化能力法(Total Antioxidant Capacity Assay Kit with ABTS法)对多肽APMISAASVH的体外总抗氧化活性进行了测定，发现生物活性多肽APMISAASVH相比空白组其吸光值有一定程度的降低，具有较好的还原氧化物质的能力。由表4可知，发现多肽APMISAASVH的总抗氧化能力随着多肽浓度的升高而升高，在浓度为5mg/mL情况下，多肽APMISAASVH的总抗氧化水平达到0.1803mmol/g，即在5mg/m L的浓度下，其总抗氧化能力与1mmol/L Trolox的总抗氧化能力相持平。因此，可认定发明的生物活性多肽APMISAASVH具有显著的抗氧化能力。
实施例3生物活性肽的抗衰老活性实验
一、生物活性多肽APMISAASVH的急性热应激存活率实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)，复旦大学附属中西结合研究院；大肠菌株E.coli OP50，复旦大学附属中西结合研究院；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；酵母粉，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的生物活性多肽APMISAASVH。
仪器设备：力康RO15纯水系统，力康生物医疗科技有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；THZ-32型台式恒温振荡器，上海精密实验设备有限公司；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；卢湘仪GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪仪器有限公司；博迅BJ-CD SERIES生物安全柜，上海博讯实业有限公司；Nikko倒置电子显微镜，尼康株式会社。
2.实验方法：
(1)NGM平板制备
取大肠杆菌菌种于LB平板划线，挑取单菌落于10ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养24h，至OD600＝0.4用于接种NGM平板喂养线虫。取100μL菌液涂于60mmNGM平板，注意菌液边缘应距离平板边缘0.5cm左右。已涂布的NGM平板在室温(21-25℃)过夜后即可使用。
(2)线虫培养
本实验中所用的线虫均为雌雄同体，在标准培养条件(温度20℃，湿度40％～60％)下培养生长。
(3)线虫的同期化处理
1)高氯酸钠漂白法
准备孕虫生长板(即板中80％以上虫子处于生殖期)2-3板，取5ml M9缓冲液冲洗2次，将缓冲液吸入15ml离心管中，1000r/min离心3min，弃去上清。加入5ml新配同期化漂白液，室温下剧烈振荡2.5min，以将成虫虫体腐蚀。离心，弃去上清。保证总处理时间不能超过5min，防止损伤虫卵。再加入M9缓冲液将沉淀重悬，混匀后离心，弃去上清，重复此过程3次。
2)限时产卵法
挑取若干条处于产卵期的线虫于同一平板内，挑取的具体数量以所需同期化线虫数目为依据。一般条件下，一条产卵期线虫能在1h以内产卵6个左右。在平板中培养0.5h后，挑出平板中线虫，则平板中的卵处于同一生长时期。
(4)指标测定
实验分组：空白组和多肽组。将同期化处理后的L4期线虫置于相应NGM板中,每板不少于40条，实验置于35℃进行，每隔1h计数线虫死亡、存活数目，线虫死亡判断标准：无移动及吞咽动作，轻触后仍无任何反应。剔除标准：①逃离至平板壁或盖上而干死；②虫卵在体内孵化而成袋样虫：③钻入琼脂中。
3.实验结果及分析：
表5生物活性多肽APMISAASVH对线虫在热应激下的影响
Figure BDA0001655106760000121
Figure BDA0001655106760000131
由表5可以看出，在热应激条件下，实验组和空白组中半数死亡时间和平均寿命并无显著性差异，而实验组中最长寿命也均仅延长了1h。同时，从图6中也可看出，线虫在0h至10h之内，空白组与实验组并无明显区别；在10h之后，实验组存活率略高于空白组。这说明在热应激条件下，喂食多肽APMISAASVH对于延长线虫寿命有不显著的效果。
二、生物活性多肽APMISAASVH的急性氧化应激存活率实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)，复旦大学附属中西结合研究院；大肠菌株E.coli OP50，复旦大学附属中西结合研究院；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；酵母粉，国药集团化学试剂有限公司；30％过氧化氢溶液，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的生物活性多肽APMISAASVH。
仪器设备：力康RO15纯水系统，力康生物医疗科技有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；THZ-32型台式恒温振荡器，上海精密实验设备有限公司；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；卢湘仪GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪仪器有限公司；博迅BJ-CD SERIES生物安全柜，上海博讯实业有限公司；Nikko倒置电子显微镜，尼康株式会社。
2.实验方法：
(1)NGM平板制备
取大肠杆菌菌种于LB平板划线，挑取单菌落于10ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养24h，至OD600＝0.4用于接种NGM平板喂养线虫。取100μL菌液涂于60mmNGM平板，注意菌液边缘应距离平板边缘0.5cm左右。已涂布的NGM平板在室温(21-25℃)过夜后即可使用。
(2)线虫培养
本实验中所用的线虫均为雌雄同体，在标准培养条件(温度20℃，湿度40％～60％)下培养生长。
(3)线虫的同期化处理
1)高氯酸钠漂白法
准备孕虫生长板(即板中80％以上虫子处于生殖期)2-3板，取5ml M9缓冲液冲洗2次，将缓冲液吸入15ml离心管中，1000r/min离心3min，弃去上清。加入5ml新配同期化漂白液，室温下剧烈振荡2.5min，以将成虫虫体腐蚀。离心，弃去上清。保证总处理时间不能超过5min，防止损伤虫卵。再加入M9缓冲液将沉淀重悬，混匀后离心，弃去上清，重复此过程3次。
2)限时产卵法
挑取若干条处于产卵期的线虫于同一平板内，挑取的具体数量以所需同期化线虫数目为依据。一般条件下，一条产卵期线虫能在1h以内产卵6个左右。在平板中培养0.5h后，挑出平板中线虫，则平板中的卵处于同一生长时期。
(4)指标测定
实验分组：空白组和多肽组。将同期化处理后的L4期线虫置于相应NGM板中,实验在含20mM H2O2的NGM平板中进行，每板数量不少于10条，每半小时计数线虫死亡、存活数目，线虫死亡判断标准：无移动及吞咽动作，轻触后仍无任何反应。剔除标准：①逃离至平板壁或盖上而干死；②虫卵在体内孵化而成袋样虫：③钻入琼脂中。
3.实验结果及分析：
表6生物活性多肽APMISAASVH对线虫在氧化应激下的影响
Figure BDA0001655106760000141
由表6可以看出，实验组线虫在氧化应激下平均寿命具有显著性提高(P＜0.05)，多肽APMISAASVH组呈现极其显著性差异(P<0.05)。各组半数死亡时间也相应在一定程度上有所延长，与其他实验组相比混合肽组呈现显著性提高(P<0.05)。如图7所示，在氧化应激条件下，实验组存活率均明显高于空白组存活率。这说明在氧化应激条件下，线虫的存活率得到了显著提高，可能是由于多肽APMISAASVH能有效帮助线虫抵抗氧化损伤，清除体内产生的自由基以及降低过氧化物的积累，而非通过增强其耐热力实现的。机体寿命的延长在一定程度上是由于改善了细胞对胁迫条件的抵抗力，因而延缓衰老与压力应激条件下的存活率存在很大关系。本实验结果证明多肽APMISAASVH能显著地增加线虫的压力应激和氧化应激能力，提高线虫的存活率，说明一定浓度的多肽APMISAASVH对于线虫具有抗衰老的功效。
三、生物活性多肽APMISAASVH的压力急性应激体内实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)，复旦大学附属中西结合研究院；大肠菌株E.coli OP50，复旦大学附属中西结合研究院；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；酵母粉，国药集团化学试剂有限公司；30％过氧化氢溶液，国药集团化学试剂有限公司；丙二醛(MDA)测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司；活性氧(ROS)测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物科技有限公司；实施例1获得的生物活性多肽APMISAASVH。
仪器设备：力康RO15纯水系统，力康生物医疗科技有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；THZ-32型台式恒温振荡器，上海精密实验设备有限公司；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；卢湘仪GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪仪器有限公司；博迅BJ-CD SERIES生物安全柜，上海博讯实业有限公司；Nikko倒置电子显微镜，尼康株式会社；JY92-ⅡD超声波细胞粉碎机，上海比朗仪器有限公司。
2.实验方法：
(1)NGM平板制备
取大肠杆菌菌种于LB平板划线，挑取单菌落于10ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养24h，至OD600＝0.4用于接种NGM平板喂养线虫。取100μL菌液涂于60mmNGM平板，注意菌液边缘应距离平板边缘0.5cm左右。已涂布的NGM平板在室温(21-25℃)过夜后即可使用。
(2)线虫培养
本实验中所用的线虫均为雌雄同体，在标准培养条件(温度20℃，湿度40％～60％)下培养生长。
(3)线虫的同期化处理
1)高氯酸钠漂白法
准备孕虫生长板(即板中80％以上虫子处于生殖期)2-3板，取5ml M9缓冲液冲洗2次，将缓冲液吸入15ml离心管中，1000r/min离心3min，弃去上清。加入5ml新配同期化漂白液，室温下剧烈振荡2.5min，以将成虫虫体腐蚀。离心，弃去上清。保证总处理时间不能超过5min，防止损伤虫卵。再加入M9缓冲液将沉淀重悬，混匀后离心，弃去上清，重复此过程3次。
2)限时产卵法
挑取若干条处于产卵期的线虫于同一平板内，挑取的具体数量以所需同期化线虫数目为依据。一般条件下，一条产卵期线虫能在1h以内产卵6个左右。在平板中培养0.5h后，挑出平板中线虫，则平板中的卵处于同一生长时期。
(4)指标测定
实验分为无处理实验组、加热处理实验组及氧化处理实验组。
其中，无处理实验组又分为空白无处理组和多肽无处理组。选取L4期线虫若干条，同期化处理后，用M9缓冲液将其冲洗并离心，去除上清液，加入PBS缓冲液，超声破碎2min，离心得到其组织匀浆上清液，并立即按照试剂盒说明进行SOD、MDA以及ROS指标的测定。
加热处理实验组又分为空白热处理组和多肽热处理组。将同期化处理后的L4期线虫置于相应NGM板中,每板不少于40条，实验置于35℃进行。培养2h后，测定其各项指标，检测方法与无处理实验组相同。
氧化处理实验组又分为空白氧化处理组和多肽氧化处理组。将同期化处理后的L4期线虫置于相应NGM板中,实验在含20mM H2O2的NGM平板中进行，每板数量不少于10条。培养1h后，测定其各项指标，测定方法与无处理实验组相同。
3.实验结果及分析：
表7生物活性多肽APMISAASVH对线虫SOD、MDA及ROS的影响
Figure BDA0001655106760000161
由表7中可以看出，与空白无处理实验组比，空白热处理实验组和空白氧化处理实验组中MDA和ROS值均显著性增加，SOD显著减小(P＜0.05)，这说明无论是热应激，还是氧化应激均能对线虫机体造成损伤。从表中还可以发现，多肽无处理组中MDA和SOD均与空白组相比呈现显著性差异。
在35℃处理条件下，多肽组仅MDA减小(P<0.05)，而ROS与SOD却无变化。这进一步佐证了乳源性小肽并不能提高其在应激条件下的耐热能力。在20mMH2O2处理条件下，多肽组中SOD和ROS值均出现显著性变化(P＜0.05)，其中多肽组的MDA值更是呈现极显著降低(P<0.01)。分析认为生物活性肽APMISAASVH在线虫体内能有效提高SOD含量，减少脂质过氧化物以及活性氧的产生，表现出良好的抗氧化、清除自由基功能。
SOD等诱导酶能及时清除自身过多的自由基，保持体内自由基的代谢平衡，是衡量机体健康状况的指标；MDA可以反映机体内脂质过氧化物反应程度，间接反映机体受损伤程度；活性氧簇ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的，能通过氧化应激反应导致细胞凋亡。因此，三个指标结合使用能很好地反映出机体的抗氧化能力以及受损伤程度。根据本实验的结果，生物活性肽APMISAASVH能在一定程度上提高线虫体内的抗氧化酶系活性，并在氧化应激条件下，有效保护机体抵抗氧化损害，清除自由基，但并不能明显提高其耐热力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001655106760000181
Figure BDA0001655106760000191
Figure BDA0001655106760000201
序列表
<110> 浙江熊猫乳业集团股份有限公司；张少辉
<120> 一种生物活性多肽APMISAASVH及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Pro Met Ile Ser Ala Ala Ser Val His
1 5 10
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccaatgat tagtgccgca tcagtacacg 30
<210> 3
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Lys Lys Pro Leu Ile Ile Ser Thr Asp Pro Gly Ile Asp Asp
1 5 10 15
Ile Ala Ala Met Thr Ile Ser Phe Phe Ala Lys Glu Leu Asp Val Arg
20 25 30
Met Ile Val Pro Thr Trp Gly Asn Val Gln Leu Glu Tyr Thr Leu Gln
35 40 45
Asn Thr Leu Asn Leu Glu Lys Phe Leu His Thr Lys Val Pro Val Val
50 55 60
Val Gly Ala Asn Gln Pro Leu Val Ala Pro Met Ile Ser Ala Ala Ser
65 70 75 80
Val His Gly Lys Ile Gly Ile Ala Gly Phe Asp Phe Glu Glu Ala Asp
85 90 95
Arg Ser Leu Val Lys Pro Gly Leu Ala Ala Thr Val Met Ala Glu Glu
100 105 110
Ile Lys Asn Ser Pro Glu Lys Val Thr Leu Leu Gly Ile Gly Pro Leu
115 120 125
Thr Asp Tyr Ala Leu Leu Phe Lys Gln Tyr Pro Glu Val Lys Glu Asn
130 135 140
Ile Asp Gln Ile Val Ile Met Gly Gly Asn Ile Gly Arg Gly Asn His
145 150 155 160
Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Asn Ile Ala Gly Asp Pro Glu Ala Ala Gln
165 170 175
Val Val Phe His Ser Gly Leu Pro Ile Lys Val Ala Pro Leu Glu Ile
180 185 190
Gly Asn Lys Ala His Leu Thr Gln Asp Gln Met Ser Lys Val Lys Glu
195 200 205
Cys Gly Glu Val Gly Asn Met Leu Tyr Ser Leu Phe Ser His Ile His
210 215 220
Glu Pro Asp Gly Asp Pro Arg Ile Lys Ile Tyr Asp Pro Thr Ala Val
225 230 235 240
Gly Ile Leu Leu His Pro Glu Met Phe Thr Leu Lys Lys Ala Asn Val
245 250 255
Glu Ile Glu Leu Arg Gly Gln Phe Thr Tyr Gly Ala Ser Val Ile Asn
260 265 270
Phe Met Asp Gln Glu His Ala Asn Ala Glu Ile Ala Thr Asp Val Asp
275 280 285
Leu Val Gln Phe Ser Lys Trp Phe Ile Asp Ser Ile Lys Asn Ser Asp
290 295 300
Gln Gly Arg Glu
305

Claims (9)

1.一种生物活性多肽APMISAASVH，其特征在于，其氨基酸序列为Ala-Pro-Met-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser-Val-His。
2.编码权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，或直接通过化学合成制备。
4.如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH的应用，其特征在于，所述生物活性多肽APMISAASVH在制备具有抗氧化功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
5.如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH的应用，其特征在于，所述生物活性多肽APMISAASVH在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
6.如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH的应用，其特征在于，所述生物活性多肽APMISAASVH在制备具有抗氧化功能和抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。
7.一种抗氧化产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH；所述的抗氧化产品包括抗氧化食品、抗氧化保健品、抗氧化药物或抗氧化化妆品。
8.一种抗衰老产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH；所述的抗衰老产品包括抗衰老食品、抗衰老保健品或抗衰老药物。
9.一种具有抗氧化功能和抗衰老功能的产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽APMISAASVH；具有抗氧化功能和抗衰老功能的产品包括食品、保健品或药物。
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