CN108586562A - 一种皮质醇衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种皮质醇衍生物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108586562A CN108586562A CN201810429084.9A CN201810429084A CN108586562A CN 108586562 A CN108586562 A CN 108586562A CN 201810429084 A CN201810429084 A CN 201810429084A CN 108586562 A CN108586562 A CN 108586562A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cortisol
- solution
- preparation
- mentioned
- cortex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J43/00—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
- C07J43/003—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not condensed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种皮质醇衍生物及其制备方法、皮质醇均相酶免疫检测试剂及其制备方法与使用方法。皮质醇衍生物具有如式(I)所示的结构,由该皮质醇衍生物制备免疫原性强的皮质醇免疫原及其抗体,用该抗体制备的皮质醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对皮质醇高通量、快速化的检测。式(I)。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及一种皮质醇衍生物及其制备方法,以及其在皮质醇均相酶免疫检测试剂制备中的应用。
背景技术
皮质醇(cortisol)的结构如式(Ⅱ)所示:
式(Ⅱ)。
皮质醇又称氢化可的松,是肾上腺在应激反应中产生的一种甾体类激素。皮质醇是主要的糖皮质激素,参与人体内性激素代谢,并能影响机体糖、脂肪、蛋白质的代谢以及调节机体中水、电解质平衡等一系列生命活动。人体每日分泌皮质醇总量约为200mg,且分泌量根据每日时辰(24 h)呈现明显的周期性变化。皮质醇分泌进入血液后,绝大部分与类固醇激素结合球蛋白(CBG)结合。血液中游离的皮质醇只占皮质醇总量的1%-3%,但只有游离的皮质醇才具有生物活性。通常游离皮质醇与结合皮质醇保持相对平衡,但在机体创伤、感染、运动、情绪激动等情况下其含量均有显著升高,肾上腺分泌皮质醇机能亢进或者低下也会产生特征性的临床表现。因此,在当前临床医学和药物学研究及实践中,测定皮质醇的水平已成为一项重要的指标。
目前,皮质醇的检测方法主要包括:高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱联用法(LC/MS/MS),放射免疫分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和酶联免疫分析法(ELISA)等。这些检测方法各有其优劣之处,但是在临床大规模应用上都有一定的局限性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的皮质醇检测试剂,尤其是质量好的自动化检验试剂,因此,研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高,可应用于全自动生化分析仪的皮质醇测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供一种皮质醇衍生物,由该皮质醇衍生物制备免疫原性强的皮质醇免疫原及其抗体,用该抗体制备的皮质醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对皮质醇高通量、快速化的检测。
本发明的目的之二在于提供一种皮质醇衍生物的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种由上述皮质醇衍生物制成的皮质醇均相酶免疫检测试剂。
本发明的目的之四在于提供一种上述皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备方法。
本发明的目的之五在于提供一种皮质醇均相酶免疫检测试剂的非诊断目的使用方法。
本发明的目的之一采用以下技术方案实现:
一种皮质醇衍生物,所述皮质醇衍生物具有如式(I)所示的结构,
式(I)。
本发明的目的之二采用以下技术方案实现:
一种皮质醇衍生物的制备方法,所述皮质醇衍生物具有如上述式(I)所示的结构,所述制备方法包括以下步骤:
。
本发明的目的之三采用以下技术方案实现:
一种皮质醇均相酶免疫检测试剂,包括:抗皮质醇特异性抗体、用于检测抗皮质醇特异性抗体-皮质醇复合物的指示试剂;所述抗皮质醇特异性抗体由皮质醇免疫原免疫实验动物得到,所述皮质醇免疫原由式(I)所示的皮质醇衍生物与载体连接而成,所述载体为具有免疫原性的蛋白质;所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
可选地,所述指示试剂选自酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物;所述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与由式(I)所示的皮质醇衍生物连接形成。
本发明的目的之四采用以下技术方案实现:
一种如上述的皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)皮质醇免疫原的合成:使由式(I)所示的皮质醇衍生物与具有免疫原性的蛋白质载体连接,生成皮质醇免疫原;
(2)抗皮质醇特异性抗体的制备:使用所述皮质醇免疫原免疫实验动物,由实验动物得到抗皮质醇特异性抗体;
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物的制备:使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与由式(I)所示的皮质醇衍生物连接,得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;
(4)皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备:
试剂A的制备:由所述抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物混合而成;
试剂B的制备:由所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物与Tris缓冲液混合而成。
可选地,所述步骤(1)中,蛋白质载体为BSA,所述皮质醇免疫原的合成步骤如下:
a.称取2.72 g磷酸二氢钾、4.26 g磷酸氢二钠、8.5 g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至8.2,制成缓冲溶液A;
b.称取3 mg BSA,4℃下溶解于3 mL上述缓冲溶液A中,制成BSA溶液;
c.称取3 mg由式(I)所示的皮质醇衍生物,4℃下溶解于300μl上述缓冲溶液A中,制成皮质醇衍生物溶液;
d.当上述皮质醇衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述BSA溶液中,然后将此混合溶液在-2~-8℃下搅拌2小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为皮质醇免疫原溶液,在皮质醇免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3,于-20℃下储存。
可选地,所述的步骤(2)包括:
a.用PBS将步骤(1)中的皮质醇免疫原稀释至2.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后用2.0 ml所述抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 3周后,再用2.0 ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔3周注射一次,共计注射5次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化得到效价为1:50000~1:80000的抗皮质醇特异性抗体。
可选地,所述的步骤(3)包括:
a.称取1.09 g磷酸二氢钾、1.70 g磷酸氢二钠、8.5 g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至8.2,制成缓冲溶液B;
b.称取3 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,4℃下溶解于3 mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3 mg由式(I)所示的皮质醇衍生物,4℃下溶解于300μl上述缓冲溶液B中,制成皮质醇衍生物溶液;
d.当上述皮质醇衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-2~-8℃下搅拌3小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物溶液,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3,于2~8℃下储存。
可选地,所述的步骤(4)包括:
试剂A的制备:将5.0g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2.5g的葡萄糖-6-磷酸用1L、55 mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将步骤(2)制备的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
试剂B的制备:将步骤(3)制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
本发明的目的之五采用以下技术方案实现:
一种皮质醇均相酶免疫检测试剂的非诊断目的的使用方法,所述皮质醇均相酶免疫检测试剂为上述的皮质醇均相酶免疫检测试剂;所述使用方法包括以下步骤:
(1)将待测样本与抗皮质醇特异性抗体接触;
(2)根据待测样本中皮质醇与抗皮质醇特异性抗体的结合情况,利用指示试剂判断样本中皮质醇的含量;
所述待测样本为生物样本,所述生物样本为血清、血浆、尿液、唾液或乳汁。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:
本发明中,由式(1)所示皮质醇衍生物制备的皮质醇免疫原特异性强、免疫原性高,制备出的抗皮质醇特异性抗体特异性强、效价高,并且与常见的92种干扰物无任何交叉反应;含有上述抗皮质醇特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的皮质醇含量,并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品,实现皮质醇的高通量快速化测定,准确度高,特异性强,精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高,同时实现了检测过程的全自动化,对检测人员的要求不高,易于实现和推广使用,能有效满足国内日益增长的临床检测需求。
附图说明
图1是本发明的皮质醇的ELISA检测反应曲线。
图2是本发明的皮质醇的均相酶免疫检测反应曲线。
图3是本发明的皮质醇均相酶免疫法与高效液相色谱法相关性分析图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述,需要说明的是,在不相冲突的前提下,以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供了一种皮质醇衍生物,由该皮质醇衍生物制备免疫原性强的皮质醇免疫原及其抗体,用该抗体制备的皮质醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对皮质醇高通量、快速化的检测。上述皮质醇衍生物具有如式(I)所示的结构,
式(I)。
实施例一:式(I)所示皮质醇衍生物的制备
式(I)所示皮质醇衍生物的合成路线如下:
具体的合成步骤如下:
化合物2的合成
称取9.58 g(141 mmol)的甲胺盐酸盐,在-45℃条件下与40.9 mL(281 mmol)的DBU及100 mL的DMF充分混合成混合溶液,然后加入6 g(46.9 mmol)化合物1,制成反应混合液。将此反应混合液在-10℃下搅拌2.5小时。在搅拌后的溶液中加入500 mL纯化水,并用500 mL的EA对此溶液进行萃取,萃取步骤重复3次。将萃取得到的有机层使用无水硫酸钠进行干燥,并通过真空干燥进行浓缩处理,得到6 g化合物2,产率85.5%。
化合物4的合成
称取10 g(27.8 mmol)化合物3(皮质醇)、5.6 g(55.6mmol)的TEA、0.34 g(2.78mmol)的DMAP,共同溶解于200 mL的DCM中,在0°C条件下逐滴加入4.1 g(36.1 mmol)的MsCl,制成反应混合溶液1。将上述反应混合溶液1在室温下搅拌1小时,用薄层色谱法(TLC)检测显示反应充分完成。在反应混合溶液1中加入50 mL MeOH使反应终止,然后通过真空干燥进行浓缩处理。将反应后生成的黄色油状化合物溶解于150 mL的DMF中,制成反应混合溶液2,在上述反应混合溶液2中加入1.53 g(36.11 mmol)的LiCl。然后将此反应混合溶液2在60°C下搅拌2小时。将反应后的混合溶液倒入纯化水中,再将得到的沉淀物进行过滤最终得到8 g白色固体化合物4,产率76.1%。
化合物5的合成
称取8 g(21.1 mmol)的化合物4、5.44 g(42.2 mmol)的DIEA,共同溶解于100 mL的DMSO中,然后在室温下一次性加入6.71 g(42.2 mmol)上述得到的化合物2,制成反应混合溶液。将此反应混合溶液在40°C下搅拌3小时,用薄层色谱法(TLC)检测显示反应充分完成。在反应后的溶液中加入500 mL纯化水终止反应,并用500 mL的EA对此溶液进行萃取,萃取步骤重复3次。将萃取后得到的结合在一起的有机层用500 mL纯化水和500 mL卤水进行洗涤,然后在真空中进行干燥与浓缩处理。将处理后得到的产物粗品通过硅胶柱进行纯化,最终得到9 g黄色固体化合物5,产率75.6%。
化合物6的合成
称取9 g(17.9 mmol)的化合物5,溶解于50 mL 按TFA/ DCM=1/5的比例配制而成的混合溶剂中,制成反应混合溶液。将此反应混合溶液在室温下搅拌5小时。液质联用仪(LCMS)检测显示起始反应原料完全消失。将反应后的混合物用500 mL MTBE进行稀释,然后将得到的沉淀物进行过滤,最终得到2 g白色固体化合物6,产率25%。
化合物6的结构鉴定:利用Bruker Avance III plus 400 MHz 和VARIAN MERCURYplus 300M对上述白色固体化合物6进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下:1H-NMR (400 MHz, DMSO_d6): δ 0.75-0.91 (m, 4H), 0.91-1.04 (m, 1H), 1.04-1.09(m, 1H), 1.21-1.42 (m, 5H), 1.48-1.89 (m, 5H), 1.90-2.01 (m, 3H), 2.11-2.18(m, 3H), 2.35-2.48 (m, 2H), 3.07 (s, 5H), 3.33 (brs, 2H) , 4.08-4.13 (d, 1H),4.27 (s, 1H) , 4.61-4.66 (d, 1H), 5.57 (s, 2H) , 9.61 (brs, 1H)。表征为结构式所示的化合物6。
化合物7(皮质醇衍生物)的合成
称取1.5 g(3.35 mmol)的化合物6与1.53 g(4.02 mmol)的HATU,共同溶解于20 mL的DMF中,制成反应混合溶液。将反应混合溶液在室温下搅拌1小时。称取1.05 g(4.02 mmol)的1-(3-Amino-propyl)-pyrrole-2,5-dione与846 mg(8.38 mmol)的TEA,共同添加到上述反应混合溶液中。将此混合溶液在室温下搅拌1小时。将反应后的产物通过硅胶柱进行纯化,最终得到500 mg棕色固体化合物7(皮质醇-17-马来酰亚胺衍生物),即式(I)所示皮质醇衍生物,产率25%。
式(I)所示皮质醇衍生物的结构鉴定:利用Bruker Avance III plus 400 MHz 和VARIAN MERCURY plus 300M对上述棕色固体化合物7进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标。结果如下:1H-NMR (400 MHz, DMSO_d6): δ 0.85-0.96 (m, 3H), 0.96-1.12 (m,12H), 1.34-1.51 (m, 6H), 1.51-1.95 (m, 8H), 1.98-2.10 (m, 3H), 2.16-2.27 (m,2H), 2.33 (s, 3H), 2.37-2.40 (m, 2H), 2.43-2.51 (m, 2H), 2.65-2.72 (m, 3H) ,3.18-3.23 (m, 1H), 3.24-3.36 (m, 2H), 3.54-3.57 (m, 2H), 3.76-3.81 (d, 1H) ,4.48 (s, 1H), 5.68 (s, 1H) , 6.69 (s, 2H) , 8.15 (brs, 1H)。表征为结构式(I)所示的皮质醇衍生物。
实施例二:皮质醇免疫原的合成
皮质醇免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)与式(Ⅰ)所示的皮质醇衍生物连接而成,该免疫原的合成方法具体步骤如下:
a.称取2.72 g磷酸二氢钾、4.26 g磷酸氢二钠、8.5 g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至8.2,制成缓冲溶液A;
b.称取3 mg BSA,4℃下溶解于3 mL上述缓冲溶液A中,制成BSA溶液;
c.称取3 mg式(I)所示的皮质醇衍生物,4℃下溶解于300μl上述缓冲溶液A中,制成皮质醇衍生物溶液;
d.当上述皮质醇衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述BSA溶液中,然后将此混合溶液在-2~-8℃下搅拌2小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为皮质醇免疫原溶液,在皮质醇免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3,于-20℃下储存。0.1%的NaN3是指加入量占最终所得的免疫原溶液的质量百分比,具体的加入量根据透析后所得的免疫原溶液的具体质量而定。
实施例三:抗皮质醇特异性抗体的制备
将实施例二制备得到的皮质醇免疫原接种实验动物,本实施例的实验动物以实验动物兔为例,加强免疫后取抗血清,具体步骤如下:
1.用PBS将上述合成的皮质醇免疫原稀释至2.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后用2.0 ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物兔进行注射。
周后,再用2.0 ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物兔注射一次,之后每隔3周注射一次,共计注射5次。
对免疫后的实验动物兔取血,分离纯化得到效价为1:50000~1:80000的抗皮质醇特异性抗体。
实施例四:皮质醇ELISA检验
1.皮质醇ELISA检测标准曲线的建立
(1) 标准品的制备
将皮质醇粉末(购于Sigma公司) 溶解于甲醇溶液,制备成1 mg/ml 的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为500.00 nmol/L、250.00 nmol/L、125.00 nmol/L、62.50 nmol/L、31.25 nmol/L和0.00 nmol/L的标准溶液。其中,ELISA缓冲液含有50.0 mM Tris,145mMNaCl 和0.25%的BSA。
利用皮质醇的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例三中所制备的抗皮质醇抗体稀释成1:9000 的终浓度溶液,100μL /孔包被在96孔酶联板上,4℃放置12-24h ;用PBS将上述包被有抗皮质醇抗体的96孔酶联板洗涤3次后,加入200μL /孔的0.5%的BSA溶液,4℃封闭放置8-16 h。然后用PBS洗涤3次,加入20μL /孔的标准品。再加入100μL /孔工作浓度的HRP-皮质醇偶联物;室温下孵育30min 后PBS 洗板5次;然后每孔加入100μL TMB 底物,室温孵育30 min。再每孔加入100μL 终止液(2 M 硫酸)。测定450 nm 的吸光值。根据各标准品所对应的450 nm 的吸光值定标,制作标准曲线,结果如附图1所示。
待测样品中皮质醇含量的检测
(1) 制作待测样品
制备方法:将皮质醇粉末(购于Sigma公司) 溶解于甲醇溶液制成1μg/mL 的储存液,并将此储存液稀释于空白血浆中,至终浓度分别为0.00,35.00,200.00,400.00 nmol/L,形成空白、低、中、高浓度的血浆样本。该空白血浆为不含皮质醇的健康人血浆。
测试方法
利用上述皮质醇的ELISA检验方法,将上述空白、低、中、高浓度的血浆样本代替标准品,测试上述空白、低、中、高浓度的血浆样本在450nm 的吸光值。
测试结果
对照图1中所示的皮质醇ELISA检验的标准曲线,计算每个样本中皮质醇含量,并对每个样本进行3个复孔测定,根据上述样本中皮质醇的实际含量计算回收率,结果如表1所示。
表1皮质醇的ELISA检测回收实验
血清样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
样品浓度(nmol/L) | 0.00 | 35.00 | 200.00 | 400.00 |
测试1 | 0.01 | 36.27 | 211.05 | 395.41 |
测试2 | 0.00 | 34.83 | 205.21 | 412.75 |
测试3 | 0.00 | 36.70 | 198.94 | 400.30 |
平均值(nmol/L) | 0.00 | 35.93 | 205.07 | 402.82 |
回收率(%) | - | 102.66 | 102.53 | 100.71 |
由表1中结果可知:采用本发明皮质醇ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的皮质醇回收率都较高,均大于95%,说明本发明所述的抗皮质醇特异性抗体可以用于样本中皮质醇的检测,并且结果准确度高。
实施例五:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
a.称取1.09 g磷酸二氢钾、1.70 g磷酸氢二钠、8.5 g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至8.2,制成缓冲溶液B;
b.称取3 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,4℃下溶解于3 mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3 mg式(I)所示的皮质醇衍生物,4℃下溶解于300μl上述缓冲溶液B中,制成皮质醇衍生物溶液;
d.当上述皮质醇衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-2~-8℃下搅拌3小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3,于2~8℃下储存。0.5%的BSA和0.1%的NaN3是指加入量占最终所得的偶联物溶液的质量百分比,具体的加入量根据透析后所得的偶联物溶液的具体质量而定。
实施例六:皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备
皮质醇均相酶免疫检测试剂在使用之前,为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应,酶标偶联物和酶的底物是分开放置的,不混合,所以将酶的底物与上述抗皮质醇特异性抗体混合在一起。也就是说,皮质醇均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂,具体如下:
试剂A的制备:将5.0g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2.5g的葡萄糖-6-磷酸用1L、55 mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将实施例三制备的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
本实施例中抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物的体积比具体为1:1296。
试剂B的制备:将实施例五制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
本实施例中皮质醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比具体为1:1681。
实施例七:皮质醇均相酶免疫检验及结果
1. 获得标准曲线:
(1)设置迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数(见表2)。
(2)操作步骤为:先加试剂A,再加入标准品,最后加入试剂B。加入试剂B后,测定不同时间点的OD340吸光值,算出不同标准品浓度时的反应速率,实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例,同时调整测光点,最后得出较理想的反应标准曲线图,如图2所示。
表2 迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数
2. 样本检测:通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线,重复测定低、中、高浓度质控样本10次,上述质控样本为:将皮质醇标准品溶解于人血浆中,至浓度分别为35.00,200.00,400.00 nmol/L。检测数据及数据分析见表3。
表3 样品测定及精密度和回收率评估
血液样品 | 低 | 中 | 高 |
样品浓度 (nmol/L) | 35.00 | 200.00 | 400.00 |
1 | 34.45 | 205.33 | 393.58 |
2 | 34.50 | 202.51 | 389.95 |
3 | 33.84 | 209.00 | 413.33 |
4 | 35.99 | 205.27 | 402.16 |
5 | 36.11 | 196.53 | 400.00 |
6 | 34.28 | 204.89 | 406.69 |
7 | 36.06 | 201.93 | 394.29 |
8 | 35.24 | 198.02 | 399.55 |
9 | 34.33 | 207.73 | 410.08 |
10 | 36.19 | 205.15 | 401.95 |
平均值(nmol/L) | 35.10 | 203.64 | 401.16 |
标准差(SD) | 0.918 | 3.960 | 7.410 |
精密度(CV%) | 2.62% | 1.94% | 1.85% |
回收率 % | 100.29 | 101.82 | 100.29 |
3.检测结果:本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高,回收率达到95%-105%,精密度高,CV均低于3%。
实施例八:药物与激素干扰试验
选取62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物进行干扰检测,调整浓度至1.00nmol/L,采用实施例七的均相酶免疫方法进行测定:
1. 将待测干扰物与实施例六制备的试剂A接触反应,再加入试剂B;
2. 检测上述混合溶液的OD340吸光值,根据实施例七的标准曲线得到相应物质的浓度。
种常见药物与30种常见激素及激素代谢物名称以及测定结果具体参见表4。
表4 常见干扰物测定结果
ID# | 化合物名称 | 等价于皮质醇的浓度 (nmol/L) | ID# | 化合物名称 | 等价于皮质醇的浓度 (nmol/L) |
1 | 阿司匹林 | 0.0 | 2 | 苯丙醇胺 | 0.0 |
3 | β-苯基乙胺 | 0.0 | 4 | 普鲁卡因酰胺 | 0.0 |
5 | 安非他命 | 0.0 | 6 | 普鲁卡因 | 0.0 |
7 | 氨苄青霉素 | 0.0 | 8 | 奎尼丁 | 0.0 |
9 | 甲氨二氮卓 | 0.0 | 10 | 佐美酸 | 0.0 |
11 | 氯丙嗪 | 0.0 | 12 | 苯肾上腺素 | 0.0 |
13 | 氯拉卓酸 | 0.0 | 14 | 桂皮酰艾克宁 | 0.0 |
15 | 二甲苯氧庚酸 | 0.0 | 16 | 芽子碱 | 0.0 |
17 | 非诺洛芬 | 0.0 | 18 | 地西洋 | 0.0 |
19 | 甲基苯丙胺 | 0.0 | 20 | 可替宁 | 0.0 |
21 | 龙胆酸 | 0.0 | 22 | 阿替洛尔 | 0.0 |
22 | 吉非贝齐 | 0.0 | 24 | 心得安 | 0.0 |
25 | 氢可酮 | 0.0 | 26 | 苯乙哌啶酮 | 0.0 |
27 | 布洛芬 | 0.0 | 28 | 苯基丁氮酮 | 0.0 |
29 | 丙咪嗪 | 0.0 | 30 | 麦角酸二乙基酰胺 | 0.0 |
31 | 二氨基二苯砜 | 0.0 | 32 | 大麻酚 | 0.0 |
33 | 萘普生 | 0.0 | 34 | 洛哌丁胺 | 0.0 |
35 | 氢氯噻嗪 | 0.0 | 36 | 异克舒令 | 0.0 |
37 | 哌替啶 | 0.0 | 38 | 苯基丙氨酸 | 0.0 |
39 | 烯丙羟吗啡酮 | 0.0 | 40 | 盐酸氟西汀 | 0.0 |
41 | 麻黄素 | 0.0 | 42 | 柳丁氨醇 | 0.0 |
43 | 烟酰胺 | 0.0 | 44 | 青霉素 | 0.0 |
45 | 甲胺呋硫 | 0.0 | 46 | 甲基二乙醇胺 | 0.0 |
47 | 异戊巴比妥 | 0.0 | 48 | 二亚甲基双氧苯丙胺 | 0.0 |
49 | 甲撑二氧苯丙胺 | 0.0 | 50 | 琥珀酸多西拉敏 | 0.0 |
51 | 四氢大麻酚 | 0.0 | 52 | 纳布啡 | 0.0 |
53 | 制霉菌素 | 0.0 | 54 | 去甲吗啡 | 0.0 |
55 | 乙酰吗啡 | 0.0 | 56 | 羟考酮 | 0.0 |
57 | 苄非他明 | 0.0 | 58 | 克他命 | 0.0 |
59 | 异丙嗪 | 0.0 | 60 | 苯海拉明 | 0.0 |
61 | 阿司帕坦 | 0.0 | 62 | 苯丁胺 | 0.0 |
63 | 皮质醇(氢化可的松) | 0.0 | 64 | 香草扁桃酸 | 0.0 |
65 | 雄烯二酮 | 0.0 | 66 | 雄甾酮 | 0.0 |
67 | 皮质脂酮 | 0.0 | 68 | 皮质酮(可的松) | 0.0 |
69 | 去氧皮质酮 | 0.0 | 70 | 脱氢表雄酮 | 0.0 |
71 | 硫酸脱氢表雄酮 | 0.0 | 72 | 二氢睾酮 | 0.0 |
73 | 雌二醇 | 0.0 | 74 | 雌三醇 | 0.0 |
75 | 雌酮 | 0.0 | 76 | 本胆烷醇酮 | 0.0 |
77 | 17-羟孕烯醇酮 | 0.0 | 78 | 17-羟孕酮 | 0.0 |
79 | 孕烯醇酮 | 0.0 | 80 | 孕酮 | 0.0 |
81 | 睾酮 | 0.0 | 82 | 孕三醇 | 0.0 |
83 | 孕二醇 | 0.0 | 84 | 17α-羟基黄体酮 | 0.0 |
85 | 雄烯二酮 | 0.0 | 86 | 17-酮类固醇 | 0.0 |
87 | 17-羟皮质类固醇 | 0.0 | 88 | 肾上腺素 | 0.0 |
89 | 去甲肾上腺素 | 0.0 | 90 | 多巴胺 | 0.0 |
91 | 高香草酸 | 0.0 | 92 | 二羟基杏仁酸 | 0.0 |
测定结果显示:上述62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物等价于皮质醇的浓度均小于0.10nmol/L。由此可见,本发明的抗体是抗皮质醇的特异性抗体,与常见干扰物无交叉反应。
实施例九:相关性分析
对100例临床标本分别使用高效液相色谱法和本发明的均相酶免疫试剂进行相关性分析,测定的数据参见表5。
表5 临床样本测定值
样本号 | 均相酶免疫法测定值(nmol/L) | 高效液相色谱法测定值(nmol/L) |
1 | 224.00 | 219.55 |
2 | 239.01 | 241.13 |
3 | 222.72 | 222.56 |
4 | 202.57 | 201.09 |
5 | 228.43 | 229.51 |
6 | 174.09 | 180.26 |
7 | 220.87 | 217.55 |
8 | 150.28 | 152.59 |
9 | 204.83 | 203.74 |
10 | 240.02 | 243.12 |
11 | 174.23 | 176.92 |
12 | 198.33 | 197.66 |
13 | 186.13 | 186.52 |
14 | 199.75 | 201.11 |
15 | 219.25 | 221.73 |
16 | 249.43 | 253.21 |
17 | 183.69 | 180.57 |
18 | 247.85 | 249.16 |
19 | 206.98 | 205.74 |
20 | 177.92 | 179.34 |
21 | 231.9 | 228.84 |
22 | 177.71 | 178.35 |
23 | 204.33 | 204.21 |
24 | 195.53 | 196.43 |
25 | 282.01 | 280.99 |
26 | 218.12 | 216.35 |
27 | 233.71 | 236.28 |
28 | 171.42 | 171.69 |
29 | 275.28 | 279.51 |
30 | 187.62 | 185.31 |
31 | 179.18 | 185.46 |
32 | 190.98 | 191.03 |
33 | 181.35 | 180.07 |
34 | 184.33 | 187.76 |
35 | 162.03 | 165.66 |
36 | 226.9 | 221.38 |
37 | 220.49 | 215.11 |
38 | 183.05 | 179.56 |
39 | 215.97 | 216.34 |
40 | 175.04 | 178.55 |
41 | 223.56 | 223.21 |
42 | 192.18 | 193.99 |
43 | 238.68 | 237.9 |
44 | 187.26 | 186.78 |
45 | 153.72 | 150.72 |
46 | 169.51 | 167.76 |
47 | 219.77 | 213.66 |
48 | 193.78 | 195.6 |
49 | 213.1 | 213.32 |
50 | 247.27 | 250.13 |
51 | 231.61 | 225.84 |
52 | 175.58 | 174.43 |
53 | 176.99 | 180.61 |
54 | 163.74 | 160.39 |
55 | 204.19 | 211.45 |
56 | 228.28 | 224.25 |
57 | 176.17 | 180.59 |
58 | 208.46 | 209.5 |
59 | 200.88 | 203.45 |
60 | 194.4 | 199.61 |
61 | 202.38 | 196.41 |
62 | 247.81 | 255.04 |
63 | 165.04 | 159.81 |
64 | 169.65 | 166.28 |
65 | 165.83 | 170.74 |
66 | 195.43 | 200 |
67 | 198.41 | 198.63 |
68 | 178.8 | 174.65 |
69 | 189.04 | 194.6 |
70 | 225.99 | 220.47 |
71 | 195.01 | 200.03 |
72 | 247.37 | 245.08 |
73 | 199.75 | 200.19 |
74 | 234.4 | 230.15 |
75 | 200.03 | 206.78 |
76 | 217.37 | 218.1 |
77 | 186.53 | 191.65 |
78 | 195.01 | 200.73 |
79 | 211.5 | 214.26 |
80 | 225.22 | 220.99 |
81 | 171.07 | 177.07 |
82 | 243.87 | 240.57 |
83 | 174.3 | 173.94 |
84 | 249.52 | 245.99 |
85 | 169.31 | 173.44 |
86 | 170.53 | 166.09 |
87 | 192.52 | 184.02 |
88 | 210.81 | 206.31 |
89 | 219.89 | 216.09 |
90 | 235.56 | 233.38 |
91 | 202.4 | 199.24 |
92 | 195.36 | 200.91 |
93 | 155.1 | 153.64 |
94 | 207.75 | 211.39 |
95 | 191.37 | 197.85 |
96 | 170.62 | 166.66 |
97 | 181.36 | 173.3 |
98 | 185.71 | 187.49 |
99 | 224.6 | 231.14 |
100 | 183.74 | 189.97 |
对上述数据作图,参见图3,得到的线性方程为:y = 0.986x + 3.1001,相关系数R2 =0.9803,表明本发明的检测试剂测定皮质醇临床标本的准确度较高。
对本领域的技术人员来说,可根据以上描述的技术方案以及构思,做出其它各种相应的改变以及形变,而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种皮质醇衍生物,其特征在于,所述皮质醇衍生物具有如式(I)所示的结构,
式(I)。
2.一种皮质醇衍生物的制备方法,其特征在于,所述皮质醇衍生物具有如权利要求1中式(I)所示的结构,所述制备方法包括以下步骤:
。
3.一种皮质醇均相酶免疫检测试剂,其特征在于,包括:抗皮质醇特异性抗体、用于检测抗皮质醇特异性抗体-皮质醇复合物的指示试剂;所述抗皮质醇特异性抗体由皮质醇免疫原免疫实验动物得到,所述皮质醇免疫原由权利要求1所述的皮质醇衍生物与载体连接而成,所述载体为具有免疫原性的蛋白质;所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
4.根据权利要求3所述的皮质醇均相酶免疫检测试剂,其特征在于,所述指示试剂选自酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物;所述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与由权利要求1所述的皮质醇衍生物连接形成。
5.一种如权利要求3所述的皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)皮质醇免疫原的合成:使由权利要求1所述的皮质醇衍生物与具有免疫原性的蛋白质载体连接,生成皮质醇免疫原;
(2)抗皮质醇特异性抗体的制备:使用所述皮质醇免疫原免疫实验动物,由实验动物得到抗皮质醇特异性抗体;
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物的制备:使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与由权利要求1所述的皮质醇衍生物连接,得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;
(4)皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备:
试剂A的制备:由所述抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物混合而成;
试剂B的制备:由所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物与Tris缓冲液混合而成。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,蛋白质载体为BSA,所述皮质醇免疫原的合成步骤如下:
a.称取2.72 g磷酸二氢钾、4.26 g磷酸氢二钠、8.5 g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至8.2,制成缓冲溶液A;
b.称取3 mg BSA,4℃下溶解于3 mL上述缓冲溶液A中,制成BSA溶液;
c.称取3 mg由权利要求1所述的皮质醇衍生物,4℃下溶解于300μl上述缓冲溶液A中,制成皮质醇衍生物溶液;
d.当上述皮质醇衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述BSA溶液中,然后将此混合溶液在-2~-8℃下搅拌2小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为皮质醇免疫原溶液,在皮质醇免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3,于-20℃下储存。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(2)包括:
a.用PBS将步骤(1)中的皮质醇免疫原稀释至2.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后用2.0 ml所述抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 3周后,再用2.0 ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔3周注射一次,共计注射5次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化得到效价为1:50000~1:80000的抗皮质醇特异性抗体。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(3)包括:
a.称取1.09 g磷酸二氢钾、1.70 g磷酸氢二钠、8.5 g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至8.2,制成缓冲溶液B;
b.称取3 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,4℃下溶解于3 mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3 mg由权利要求1所述的皮质醇衍生物,4℃下溶解于300μl上述缓冲溶液B中,制成皮质醇衍生物溶液;
d.当上述皮质醇衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-2~-8℃下搅拌3小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物溶液,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3,于2~8℃下储存。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(4)包括:
试剂A的制备:将5.0g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2.5g的葡萄糖-6-磷酸用1L、55 mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将步骤(2)制备的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
试剂B的制备:将步骤(3)制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
10.一种皮质醇均相酶免疫检测试剂的非诊断目的的使用方法,其特征在于,所述皮质醇均相酶免疫检测试剂为权利要求3或4所述的皮质醇均相酶免疫检测试剂;所述使用方法包括以下步骤:
(1)将待测样本与抗皮质醇特异性抗体接触;
(2)根据待测样本中皮质醇与抗皮质醇特异性抗体的结合情况,利用指示试剂判断样本中皮质醇的含量;
所述待测样本为生物样本,所述生物样本为血清、血浆、尿液、唾液或乳汁。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810429084.9A CN108586562B (zh) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | 一种皮质醇衍生物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810429084.9A CN108586562B (zh) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | 一种皮质醇衍生物及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108586562A true CN108586562A (zh) | 2018-09-28 |
CN108586562B CN108586562B (zh) | 2019-09-06 |
Family
ID=63635747
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810429084.9A Active CN108586562B (zh) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | 一种皮质醇衍生物及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108586562B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111504920A (zh) * | 2019-01-09 | 2020-08-07 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备皮质醇检测试剂中的用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014176284A1 (en) * | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Avelas Biosciences, Inc. | Selective drug delivery compositions and methods of use |
CN105131105A (zh) * | 2015-07-27 | 2015-12-09 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法 |
CN107973836A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-05-01 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂 |
-
2018
- 2018-05-08 CN CN201810429084.9A patent/CN108586562B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014176284A1 (en) * | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Avelas Biosciences, Inc. | Selective drug delivery compositions and methods of use |
CN105131105A (zh) * | 2015-07-27 | 2015-12-09 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法 |
CN107973836A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-05-01 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111504920A (zh) * | 2019-01-09 | 2020-08-07 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备皮质醇检测试剂中的用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108586562B (zh) | 2019-09-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103760348B (zh) | 一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法 | |
CN102768284B (zh) | 一种卡马西平均相酶免疫检测试剂的制备方法 | |
CN106645692B (zh) | 雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法 | |
CN109111494A (zh) | 雌二醇衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法 | |
CN103575890B (zh) | 一种莱克多巴胺的化学发光试剂盒及其应用 | |
CN107365342B (zh) | 醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒 | |
CN107353200A (zh) | 一种香草扁桃酸衍生物、其合成方法及一种香草扁桃酸免疫原、其制备方法及其应用 | |
CN104530222A (zh) | 紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检测试剂 | |
CN104447984A (zh) | 多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特异性抗体和多西紫杉醇检测试剂 | |
CN107973836B (zh) | 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂 | |
CN105175531A (zh) | 羟脯氨酸免疫原、特异性抗体、检测试剂及其制备方法 | |
CN108586562B (zh) | 一种皮质醇衍生物及其制备方法与应用 | |
CN109928958A (zh) | 一种伏立康唑衍生物、其合成方法及一种伏立康唑免疫原、其制备方法及其应用 | |
CN105131105A (zh) | 皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法 | |
CN109180768B (zh) | 雌酮衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法 | |
CN110456087B (zh) | 一种舍曲林检测试剂及其制备和使用方法 | |
CN104774256A (zh) | 儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN110003300B (zh) | 一种17-羟类固醇的衍生物、检测试剂及制备方法 | |
CN104987392A (zh) | 脱氢表雄酮免疫原、衍生物、抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN103105488B (zh) | 一种氨基脲(sem)衍生化试剂及其使用方法 | |
CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
CN104557722B (zh) | 肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒 | |
CN109884318B (zh) | 一种均相酶免疫偶联物及其制备方法和应用 | |
CN110967481A (zh) | 一种拉莫三嗪衍生物、其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用 | |
CN108120838B (zh) | 用于血管紧张素ⅱ检测的二肽衍生物及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |