CN108548929A - 检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医疗卫生领域,具体涉及一种检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用；所述生物标志物为LBP、编码LBP的基因、或者合成LBP的多肽或多肽片段；本发明首次提出非小细胞肺癌患者血清中外泌体蛋白LBP水平明显高于健康对照组；转移性非小细胞肺癌患者外泌体蛋白LBP明显高于非转移性非小细胞肺癌患者；因此血清中外泌体蛋白LBP的水平可以清楚的区别非小细胞肺癌患者与对照病例，可以区别转移性和非转移性非小细胞肺癌，以及肺腺癌及肺鳞癌。

Description

检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用

技术领域

本发明属于医疗卫生领域,具体涉及一种检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用。

背景技术

非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌的80%，约75%的患者在就诊时已出现远处转移，5年生存率仅2％。因此，现在迫切的需要一种较为灵敏的诊断标记物，为发生远处转移的NSCLC的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。

肿瘤细胞来源的外泌体（Tomor-derived exosomes, TDEs）已经被证明可以促进癌症进展，由外泌体介导的细胞间相互作用可能在肿瘤的发生和远处转移中具有重要的作用。外泌体的分离及其在临床中的使用可替代侵入性手术以诊断或主要在NSCLC中的癌症患者的后续，其中在大多数患者中原发性肿瘤组织的可用性是困难的。此外，外泌体内容物如miRNAs，蛋白质等在外泌体膜的保护下免受酶的降解，TDEs易于在血液样本中获得。因此可以在循环血液中被稳定检测到，使其成为转移性NSCLC诊断的理想生物标志物。

随着对外泌体研究的不断深入，它在肿瘤转移机制中的作用也逐渐凸显。最近，肿瘤来源的外泌体（Tumor-derived exosomes，TDEs）已经被证明可以促进肿瘤的侵袭和转移。研究人员提出TDEs在肿瘤微环境内释放自分泌和旁分泌信号，以激活肿瘤上皮细胞的上皮-间充质间的转化。另外，转移性肿瘤中外泌体的产生速度和总量也较未发生转移的肿瘤外泌体高。有证据表明，外泌体可能会影响不同靶器官的转移效率，源于外泌体对特定受体细胞具有较强的亲和力。TDEs含有很多肿瘤相关蛋白，如表皮生长因子受体（EGFR），KRAS和RAB家族蛋白等。

TDEs中含有蛋白质、脂类和核酸等成分。它可以参与细胞间的信息交换，从而调节肿瘤的生成、血管生成、侵袭和转移。

2007年Valadi等首次鉴定出外泌体中含有遗传物质mRNAs及微小RNAs（miRNAs），被靶细胞摄取后这些遗传物质可发挥正常的生物学活性。外泌体中双链DNA的发现，使学者对这一领域有了新的认识。研究发现，肿瘤细胞分泌的外泌体（tumor-derived exosomes,TDEs）内双链DNA的遗传信息在一定程度上与肿瘤DNA相似，因此，如果存在于外泌体内的基因是稳定的，那么外泌体基因检测也许能成为一种用来检测突变和监测肿瘤发生发展的新方法。除蛋白质和核酸外，外泌体中也包含其来源细胞或者组织的脂质成分，现已证实其主要成分为胆固醇、甘油二酯、磷脂和甘油酰磷脂等，对于提高胞膜稳定性具有重要作用。此外，脂质体还具有生物活性，但是研究人员对其生理作用的研究仍不充分。

外泌体内的蛋白质主要包含其来源细胞的特异性蛋白，如APCs分泌的外泌体可表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子、共刺激蛋白CD80等、四次跨膜蛋白（如CD9、CD63、CD81和CD82等）和内体运输分拣复合物（endosomal sorting complex required fortransport，ESCRT）；另外外泌体中还包含参与细胞间物质交换的蛋白，如Rab蛋白家族（如Rab27、Rab11和Rab35）和热休克蛋白（如Hsp60、Hsp70和Hsp90等），细胞特异性蛋白能够识别不同细胞来源的外泌体。

外泌体蛋白可能反映疾病相关的病理过程。理论上，外泌体中蛋白质的含量要显著高于血液中游离的，因为外泌体蛋白质能受膜保护而免受蛋白酶依赖性降解，因此可以在循环血清和血清中稳定检测，使其成为许多临床应用的理想生物标志物。另外，TDEs取材简单，微创，能够反映肿瘤异质性，可动态监测肿瘤相关蛋白质的变化情况，或许可作为了潜在的肿瘤生物标志物。迄今为止，在许多恶性肿瘤中已经描述了体液中外泌体的蛋白质组学变化。然而，转移性NSCLC的外泌体蛋白质组学以及区分转移性NSCLC和非转移性NSCLC的外泌体特异性标记物仍然不甚了解。目前尚未发现关于蛋白质在转移性NSCLC外泌体中的表达水平的报道。

恶性肿瘤的蛋白质组学研究尚处于起步阶段。根据生物信息学分析的结果，选择在某些特定途径，生物学功能发生显著变化的蛋白质，以生物化学方式验证所选靶标。深入研究外分泌蛋白质组学将有助于了解人类外泌体甚至整个细胞囊泡系统在肿瘤发生中的作用机制，从而使外泌体的临床应用具有更好的前景。

中国201610117505.5号发明专利申请，提供了一种人外泌体蛋白、试剂盒及其应用，该技术涉及一种人外泌体Dicer蛋白及其应用。所述外泌体Dicer蛋白，包含于血浆外泌体中。所述外泌体Dicer蛋白可以作为肿瘤标志物进行应用。其还提供可用于检测血浆外泌体Dicer蛋白的试剂盒。所述的检测血浆外泌体Dicer蛋白的试剂盒，可用于肿瘤患者(尤其是肺癌患者)的术前诊断、术后治疗效果评估及随访监测。该申请称其首次证实了外泌体中Dicer蛋白的存在，并发现该分泌型Dicer蛋白在正常人和肿瘤患者血浆中的表达有显著差异，尤其在肺癌晚期患者血浆中明显升高，并在肺癌患者肿瘤负荷呈显著正相关，因此能作为一种理想的血浆学标记物用于肺癌患者的术前诊断、术后治疗效果评估及随访检测，更进一步提供了一种以外泌体Dicer蛋白为新型肿瘤标志物的试剂盒，为便捷快速无创式的肺癌体外诊断提供了有效的工具。

LBP是一种分子量约为65 kDa的急性时相反应蛋白，血液中浓度较高，主要由肝脏产生。它具有多种生物活性，如抗炎作用等。此外，据报道LBP是脂质转移蛋白家族的一部分，包括胆固醇酯转移蛋白和磷脂转移蛋白。在这项研究中，这些效应被认为是由脂质的组成成分，如磷脂酰乙醇胺血清激素，鞘脂，神经酰胺，鞘磷脂，磷脂酰丝氨酸和甘油脂的变化所调节。

经研究证实，LBP血浆水平的升高是炎症细胞因子L-1，L-6，TNFa介导的LBP基因转录水平的激活而引起的。因而LBP的早期检测是预测全身炎症反应和脓毒症的标志指标之一。该检测可能在细菌性感染的严重程度或脓毒症的早期诊断，肝病晚期合并细菌感染，高危患者（如ICU，器官移植术后或免疫抑制治疗的患者）感染性疾病的检测，以及指导治疗方案的选择等方面有很高的价值。因此中国发明专利201410736344.9号，提供了一种定量检测脂多糖结合蛋白（LBP）的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。该发明检测试剂盒制备成本低廉，稳定性好，易于保存，数据重复性好，检测灵敏度高，可广泛应用于临床生化仪。

目前，现有技术中还没有关于恶性肿瘤中外泌体LBP蛋白的作用机制和变化的研究，也未见将LBP作为诊断及预测肺癌转移的标志物的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用，其采用的生物标志物为LBP、编码LBP的基因、或者合成LBP的多肽或多肽片段，可以有效指示非小细胞肺癌、预测非小细胞肺癌转移、鉴别肺腺癌与肺鳞癌病理类型。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用，所述生物标志物为LBP、编码LBP的基因、或者合成LBP的多肽或多肽片段。

优化的，所述指示癌变状态的方法：采用检测用品检测对象中LBP的表达水平；将对象中LBP的表达水平与LBP的参比水平相比较；基于所述比较来指示对象的癌变状态。

优化的，所述LBP的参比水平为健康者LBP水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的2倍以上时，对象的癌变状态为非小细胞肺癌。

优化的，所述LBP的参比水平为非转移性非小细胞肺癌病人水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的3倍以上时，对象的癌变状态为转移性非小细胞肺癌。

优化的，所述LBP的参比水平为非小细胞肺磷癌病人水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的2倍以上时，对象的癌变状态为非小细胞肺腺癌。

优化的，所述的标志物来自血清、血浆、或尿液。

优化的，所述生物标志物在血清中表达水平的检测可以采用免疫分析方法、比色法、气相色谱、液相色谱法。

优化的，所述检测生物标志物表达水平的用品采用检测LBP的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合LBP的抗体，或者监测LBP的试剂。

优化的，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、或标记抗体。

优化的，所述试剂盒为基于磷脂酰丝氨酸（PS）亲和法免疫分离富集血清外泌体的试剂盒。

本发明还提供用于血清外泌体分离的方法。血清外泌体的分离提取可以采用超高速离心（>100,000 G）的方法，同样可以采用外泌体标志物（如磷脂酰丝氨酸，PS）免疫反应富集外泌体。

血清外泌体中LBP蛋白在血清、血清中的测定可以采用常规免疫分析方法，如ELISA、western blot等。其他方法，如比色法或色谱（包括气相、液相）法，也可以用于上述分子的测定。

本发明的有益效果在于：

1、根据本发明人的研究结果，外泌体LBP是转移性NSCLC的驱动因素，该结果拓宽了研究NSCLC转移的思路。因此，LBP作为全新的诊断生物标志物和药物潜在靶标，可用于指示对象的NSCLC状况。

2、本发明首次提出非小细胞肺癌患者血清中外泌体蛋白LBP水平明显高于健康对照组；转移性非小细胞肺癌患者外泌体蛋白LBP明显高于非转移性非小细胞肺癌患者；因此血清中外泌体蛋白LBP的水平可以清楚的区别非小细胞肺癌患者与对照病例，可以区别转移性和非转移性非小细胞肺癌，以及肺腺癌及肺鳞癌。相关的灵敏性和特异性大于0.8。

3、本发明为检测LBP的试剂盒生成提供了依据。如果试剂盒中包含LBP的抗体或多肽，均可通过相关标记测定其含量。常规的ELISA试剂盒即通过抗体—底物间相互结合来检测相应的分子和化合物，并可以作为试剂盒。

4、本发明提供的PS亲和法：该方法将（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性。

附图说明

图1为本发明得到的外泌体形态透射电镜图；

图2为本发明得到的外泌体粒子分布qNano分析图；

图3为总蛋白定量结果对比图；

图4为外泌体LBP水平对比图；

图5为外泌体蛋白LBP在非小细胞肺癌患者和健康志愿者间指示对比图；

图6为外泌体蛋白LBP在转移性与非转移性非小细胞肺癌患者间指示对比图；

图7为肺腺癌患者外泌体LBP的表达水平与肺鳞癌患者对比图。

具体实施方式

以下实施用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施案例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知烦人常规手段，所用原料为市售商品。

本实施方式采用的技术方案为：检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用，所述生物标志物为LBP、编码LBP的基因、或者合成LBP的多肽或多肽片段。

其中，所述指示癌变状态的方法：采用检测用品检测对象中LBP的表达水平；将对象中LBP的表达水平与LBP的参比水平相比较；基于所述比较来指示对象的癌变状态。

其中，所述LBP的参比水平为健康者LBP水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的2倍以上时，对象的癌变状态为非小细胞肺癌。

其中，所述LBP的参比水平为非转移性非小细胞肺癌病人水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的3倍以上时，对象的癌变状态为转移性非小细胞肺癌。

其中，所述LBP的参比水平为非小细胞肺磷癌病人水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的2倍以上时，对象的癌变状态为非小细胞肺腺癌。

其中，所述的标志物来自血清、血浆、或尿液。

其中，优化的，所述生物标志物在血清中表达水平的检测可以采用免疫分析方法、比色法、气相色谱、液相色谱法。

其中，所述检测生物标志物表达水平的用品采用检测LBP的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合LBP的抗体，或者监测LBP的试剂。

其中，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、或标记抗体。

其中，所述试剂盒为基于磷脂酰丝氨酸（PS）亲和法免疫分离富集血清外泌体的试剂盒。

实施案例：LBP在诊断早期非小细胞肺癌以及预测转移中的应用

1、实验设计

该实验设计为采集山东省肿瘤医院诊断为非小细胞肺癌初治病人以及健康志愿者血清样本，分离富集外泌体并获得外泌体蛋白。通过ELISA以及western blot的方法检测LBP表达，统计分析其表达在健康志愿者以及早期非小细胞肺癌之间、转移性与非转移性非小细胞肺癌之间、肺腺癌与肺鳞癌之间差异，并分析其诊断效能。

2、实验所涉及的病人及样本

于山东省肿瘤医院检验科收集119例早期NSCLC初治患者血清样本2 ml，包括74例男性患者和45例女性患者，年龄在34到83岁之间，平均58.7岁。收集健康志愿者90例血清样本2ml。所收获的血清均在收血后12小时内保存在-80℃条件下。

3、血清中外泌体蛋白LBP水平的测定

使用LBP-ELISA方法分析NSCLC的患者和健康供体的外泌体中LBP蛋白的表达水平，具体步骤如下：使用PBS（1×）稀释Capture Antibody，加入100 μL/孔，覆膜，室温过夜。弃掉Capture Antibody，加入Wash Buffer，400 μL /孔。向孔中加入Reagent Diluent，300 μL/孔，在室温孵育1h以上。洗涤。向96孔板中加入标准品和蛋白样品，100 μL /孔，覆膜，室温孵育2h。洗涤。加入Detection Antibody，100 μL/孔，覆膜，室温孵育2h。洗涤。加入Streptavidin-HRP，100 μL /孔，室温孵育20min，注意避光。洗涤。加入SubstrateSolution，100 μL /孔，室温孵育20min，注意避光。加入终止液，50μL /孔，轻轻敲击以充分混匀。立即在450 nm波长下测定OD值。

4、数学统计分析

采用SPSS22.0统计软件进行统计分析。正态分布的计量资料以x±s表示，计数资料采用x2检验和Mann-Whitney 检验进行分析。通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）和曲线下面积（AUC）确定NLR和PCT诊断效能，以p＜0.05为差异有统计学意义。

5、非小细胞肺癌病例特征总结以及与LBP表达水平之间的关系间表1.

表1

6、外泌体总蛋白总量与非小细胞肺癌不同临床分期的关系

总蛋白定量结果显示，NSCLC病人血清外泌体中的蛋白含量显著高于健康对照者（p<0.0001），NSCLC病人外泌体总蛋白含量是0.416 mg/mL，健康人外泌体中总蛋白含量为0.234 mg/mL 。与此同时，转移性NSCLC病人外泌体中总蛋白的表达水平显著高于非转移性NSCLC病人（p<0.0001），两者的总蛋白表达水平分别为0.996 [0.324–1.111] mg/mL和0.204[0.056–0.400] mg/mL，见图1-3。图1和图2显示结果显示外泌体的直径为50-150 nm，其形态、大小分布符合外泌体基本的生物学特征。

7、血清外泌体蛋白LBP水平在健康志愿者与非小细胞肺癌患者水平差异

采用ELISA的方法对273名受试者的外泌体中的LBP水平进行定量，以确定LBP蛋白是否可作为转移性NSCLC的生物标记物。273例患者中，包括183例NSCLC患者，其中转移性NSCLC患者89例，非转移性NSCLC患者94例，以及90例健康供者。NSCLC和健康供者外泌体LBP的中位表达量分别为1.895[0.595-3.887] ng/mL和0.577[0.143–1.138] ng/mL，差异有统计学意义（p<0.0001），见图1-7。图4显示非小细胞肺癌患者外泌体LBP水平明显高于健康供者，差异有统计学意义（****p<0.0001）。

7、ROC曲线分析血清外泌体蛋白LBP对非小细胞肺癌的诊断效能

本发明进而利用ROC曲线分析，检测LBP对非小细胞肺癌诊断效能，其AUC为0.713，灵敏度为65%，特异性为75.6%。见图5。

8、血清外泌体蛋白LBP水平在转移与非转移非小细胞肺癌患者水平差异

进一步分析了转移性和非转移性NSCLC患者外泌体LBP的表达水平。结果显示，转移性NSCLC患者和非转移性NSCLC患者的外泌体LBP的表达水平分别为3.23[1.876–5.330] ng/mL和0.881[0.204–1.994] ng/mL，转移性NSCLC患者外泌体LBP的表达水平显着高于非转移性NSCLC患者（p<0.0001）。ROC曲线显示，外泌体LBP蛋白的AUC为0.803，灵敏度为83.1%，特异性为67%。然而，外泌体LBP蛋白表达水平在非转移性NSCLC患者与健康供者之间没有统计学差异（p=0.09）。转移性NSCLC患者外泌体LBP水平明显高于非转移性NSCLC患者的外泌体LBP的表达水平（****p<0.0001）。见图4。

9、ROC曲线分析血清外泌体蛋白LBP对非小细胞肺癌转移预警的效能

本发明进而利用ROC曲线分析，检测LBP在转移与非转移非小细胞肺癌患者中的预测能力。ROC曲线显示，外泌体LBP蛋白的AUC为0.803，灵敏度为83.1%，特异性为67%。见图6。

10 、血清外泌体蛋白LBP水平在肺腺癌、肺鳞癌患者中水平差异

本发明试剂盒检测并分析肺腺癌与肺鳞癌两组患者血清的外泌体LBP的表达水平。结果显示肺腺癌患者外泌体LBP的表达水平显著高于肺腺癌患者(2.609[1.188~5.260] ng/mL vs 0.918[0.361~2.924] ng/mL，p=0.016)。这表明本发明具有一定鉴别肺腺癌与肺腺癌的诊断效能。见图7。

附图1-7中，“*”代表 p<0.05 ；“**”代表 p<0.01；“***”代表 p<0.001；“****”代表p<0.0001；AC是非小细胞肺腺癌，SCC非小细胞肺鳞癌。

Claims (10)

1.检测生物标志物表达水平的用品在指示癌变状态中的应用，其特征在于：所述生物标志物为LBP、编码LBP的基因、或者合成LBP的多肽或多肽片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述指示癌变状态的方法：采用检测用品检测对象中LBP的表达水平；将对象中LBP的表达水平与LBP的参比水平相比较；基于所述比较来指示对象的癌变状态。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述LBP的参比水平为健康者LBP水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的2倍以上时，对象的癌变状态为非小细胞肺癌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述LBP的参比水平为非转移性非小细胞肺癌病人水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的3倍以上时，对象的癌变状态为转移性非小细胞肺癌。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述LBP的参比水平为非小细胞肺磷癌病人水平，其中对象中LBP的表达水平高于LBP的参比水平的2倍以上时，对象的癌变状态为非小细胞肺腺癌。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的应用，其特征在于：所述的标志物来自血清、血浆、或尿液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述生物标志物在血清中表达水平的检测可以采用免疫分析方法、比色法、气相色谱、液相色谱法。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测生物标志物表达水平的用品采用检测LBP的试剂盒；所述试剂盒包括特异性结合LBP的抗体，或者监测LBP的试剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、或标记抗体。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述试剂盒为基于磷脂酰丝氨酸（PS）亲和法免疫分离富集血清外泌体的试剂盒。