CN108535233B - 一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子及其制备方法与应用。该纳米粒子由铱配合物Ir(1‑9)、Ir(1‑6)*和磷脂聚乙二醇构成，Ir(1‑9)能够对次氯酸特异性响应；Ir(1‑6)*作为参比配合物对次氯酸没有响应；磷脂聚乙二醇的包覆赋予聚合物良好的水溶性和生物相容性。本发明公开的纳米粒子的发光强度及磷光寿命随着次氯酸含量的增加而增加，实现对次氯酸的特异性检测；通过共聚焦成像能够实现对细胞和活体内次氯酸的特异性检测，通过包覆磷脂聚乙二醇，解决了一般荧光/磷光探针水溶性和生物相容性差的问题，在生物成像与传感领域具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一种可用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子和它的制备方法以及该种纳米粒子在活体领域检测次氯酸上的应用。
背景技术
活性氧是生物体产生的一系列化学性质活泼、氧化能力强的含氧物质的总称。活性氧既包含自由基也包含一些非自由基，如过氧化氢(H2O2)，次氯酸(HClO)，羟自由基(HO·)和单线态氧(1O2)等，这些活性氧物质在生物系统中扮演重要的角色。
其中，HClO是一种较为常见的活性氧物种，生物体内源性HClO由髓过氧化物酶(MPO)介导产生，ClO-具有较高的反应性，较短的寿命，参与较多的生理过程，是一种重要的功能强大的氧化剂，在生理状态下发挥抗微生物效应，起到保护机体的作用。研究表明，HClO还是天然的适应性免疫佐剂。然而，在特定条件下，假如MPO催化反应所产生的HClO过量，超过局部抗氧化剂的防御反应时，将导致氧化应激和氧化性组织损伤。已证实，过量HClO引起的氧化应激与白血病、肾炎、小血管炎、肿瘤及动脉粥样硬化等多种疾病相关。因此，快速、灵敏、实时检测次氯酸具有重要的生理、病理作用，可为疾病的发病机制、诊断及干预的研究提供可靠的信息。
目前所报导的检测次氯酸的方法大多是利用小分子荧光探针，荧光探针在应用中大都基于单波长发射的荧光信号变化(通常是增强)，虽然探针能够实现对次氯酸的检测，但是大多数荧光探针存在各种各样的问题：量子效率低、水溶性差、易受背景荧光的干扰、准确性差等，无法实现对次氯酸的特异性、实时检测。而磷光过渡金属配合物，如Pt(II)-、Ir(III)-、Ru(II)-、Cu(I)-、Au(I)-等配合物，在活细胞成像领域的应用在近年来逐渐引起人们的关注。其中的铱配合物，在金属中心和配体之间的电荷转移和能量迁移展现出特殊的光电性能，具有高效的三线态磷光发射，较长的寿命，大的斯托克斯位移等优点，未发现对细胞有明显毒性，在细胞生物学成像方面有较大的应用潜力。
目前，关于以铱配合物为检测位点，水溶性聚合物为包覆材料的用于检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子的报道还较为少见；且常见的次氯酸探针多为小分子荧光探针，生物相容性差，寿命短，量子效率低，而大多数生物成像重金属配合物的水溶性差，不利于生物体内次氯酸的特异性检测。同时，在现有技术中，通常是利用一个信息通道内的发射强度的变化来指示次氯酸的含量，这种方法很难在微环境中实现准确的定量测量。因此，如果我们要得到细胞微环境中被分析物的定量信息，就需要建立一套比率法，也就是让每个磷光纳米粒子在分子水平上建立内部的标尺，使之都具有自动校准功能。这意味着需要在原有的发射波长信号通道以外，引入第二个发射波长信号通道,通过双波长信号的比值的测量，减少或消除若干因素，如背景荧光和探针浓度等的变化对测量的影响，实现自校准，从而获得准确定量的信息。
因此，设计合成一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子是非常有必要的。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种可用比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子并公开其制备方法和相关应用，比率法可减少干扰因素进而精确、特异性检测次氯酸，且该纳米粒子具有优良的水溶性和生物相容性，在胞内检测和活体检测等领域具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子，其特征在于，其结构如下：
该水溶性磷光纳米粒子的具体合成路线为：
其中，Ir(1-9)中的C^N配体为下列中的任一个：
Ir(1-6)*中的N^N配体为下列中的任一个：
所述水溶性磷光纳米粒子的制备方法的具体操作步骤如下：
1)将化合物a、化合物b和碳酸钾，在氮气保护下在乙腈溶液中反应3-5h，过滤，柱层析分离得到橙黄色固体化合物c；
2)将所述化合物c、铱二氯桥和六氟磷酸钾，在氮气保护下溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶液中，于45℃条件下回流反应6h，抽滤，柱层析分离得到橙红色固体，即配合物Ir(1-9)；
3)将所述配合物Ir(1-9)和配合物Ir(1-6)*溶解于四氢呋喃中，加入磷脂聚乙二醇的PBS溶液，迅速混合并超声2.0min，氮气球鼓气至四氢呋喃挥发，用超滤离心管离心得到橙红色乳液产物，经冻干得到橙红色固体，即纳米粒子Ir NPs。
进一步地，所述水溶性磷光纳米粒子可用于比率法特异性检测次氯酸。
进一步地，所述水溶性磷光纳米粒子可用于细胞传感和活体成像传感领域。
进一步地，所述水溶性磷光纳米粒子可用于建立活体炎症模型。
本发明的有益效果是：本发明为了解决现有技术中的小分子次氯酸探针生物相容性差、水溶性差、寿命短、毒性大等多种问题制备了一种水溶性磷光纳米粒子，该纳米粒子结合比率法实现自校准，能够特异性检测次氯酸含量的变化；具有长的发射寿命，结合时间分辨技术排除背景荧光信号的干扰，提高检测信噪比；同时，该纳米粒子具有良好的水溶性和生物相容性，可实现对细胞内次氯酸的检测；毒性小，对生物样品的损伤小，可以实现对活体领域次氯酸的检测。
附图说明
图1是本发明实施例4中铱配合物Ir1对次氯酸根的响应性紫外吸收光谱图；
图2是本发明实施例4中铱配合物Ir1*对次氯酸根的响应性紫外吸收光谱图；
图3是本发明实施例5中Ir1*、次氯酸响应后的Ir1-ClO-的发射光谱图；
图4是本发明实施例6中Ir1、Ir1*的离子选择性实验结果统计图；
图5是本发明实施例7中磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的TEM测试图；
图6是本发明实施例8中磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的DLS测试图；
图7是本发明实施例9中配合物Ir1、Ir1*和纳米粒子Ir NPs的吸收光谱图；
图8是本发明实施例10中磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的滴定光谱测试图；
图9是本发明实施例10中磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的滴定发射光谱中两个发射峰比值(I600/I680)的大小随着NaClO浓度变化的测试图；
图10是本发明实施例11中磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的MTT细胞毒性实验统计图；
图11是本发明实施例12中磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的细胞共聚焦成像图谱。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明中使用的化学试剂皆为市购。
使用的仪器包括：
发射光谱仪：Edinburgh FL 920，Edinburgh
紫外光谱仪：UV-3600UV-VIS-NIR，Shimadzu
核磁共振：Ultra Shield Plus 400MHz NMR，Bruker
透射电镜：JEOL JEM-2100，JEOL
动态光散射仪：，ZetasizerNanoseries，Malvern
共聚焦扫描仪：Becker&Hickl GmbH DCS-120，Becker&Hickl GmbH
实施例1：对次氯酸敏感的配合物Ir1的制备：
(1)化合物c的制备：将化合物a(1.5mmol)、化合物b(1.0mmol)和碳酸钾1(2.0mmol)在乙腈溶液(12mL)中于氮气保护下反应4.5h。反应结束后，过滤除去碳酸钾并通过柱层析分离得到橙黄色固体化合物c，产率70％；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):8.68(dd,J＝5.2Hz,9.2Hz,2H),8.45(d,J＝8.0Hz,2H),7.51(s,2H),7.48(d,J＝5.2Hz,2H),7.31(dd,J＝4.4Hz,8.0Hz,3H),7.01(d,J＝9.2Hz,1H),5.24(s,1H),4.78(s,1H),13C NMR(100MHz,DMSO)δ(ppm):155.9,155.4,150.3,149.9,148.4,148.1,147.9,142.7,129.5,128.0,124.7,122.8,121.4,121.2,118.8,107.3,68.7,32.3.
(2)配合物Ir1的制备：将所述化合物c(0.5mmol)、铱二氯桥(0.25mmol)和足量六氟磷酸钾，在氮气保护下于二氯甲烷和甲醇的混合溶液中于45℃条件下回流反应6h，反应结束后，抽滤除去六氟磷酸钾，通过柱层析分离得到橙红色固体，产率80％；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):8.72(d,J＝12.4Hz,1H),8.65(d,J＝8.8Hz,1H),8.43(t,J＝8.0Hz,2H),8.06-7.99(m,4H),7.90(dd,J＝8.0Hz,4.0Hz,2H),7.83(dd,J＝5.2Hz,1.2Hz,2H),7.69(t,J＝4.0Hz,2H),7.44-7.34(m,5H),7.26(dd,J＝8.0Hz,4.0Hz,1H),7.09(t,J＝8.0Hz,1H),7.03-6.92(m,4H),6.17-6.14(m,2H),5.31(s,2H),4.90-4.74(m,2H),13C NMR(100MHz,DMSO)δ(ppm):166.1,166.0,156.1,156.0,155.5,155.4,155.3,155.2,151.6,151.3,151.0,149.1,149.0,148.7,148.0,147.9,147.5,142.9,141.4,140.6,133.7,133.0,131.8,131.7,129.4,128.0,126.5,126.4,126.2,124.3,122.7,121.3,118.2,107.8,68.1,43.6,31.4
实施例2：对次氯酸不敏感的参比配合物Ir1*的制备：
配合物Ir1*的制备：将1*(0.5mmol)、铱二氯桥(0.25mmol)和足量六氟磷酸钾，在氮气保护下，于二氯甲烷和甲醇的混合溶液中于45℃条件下回流反应6h，反应结束后，抽滤除去六氟磷酸钾，通过柱层析分离得到红色固体，产率85％；
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):9.00(d,J＝12.0Hz,2H),8.78(s,2H),8.15(d,J＝8.0Hz,2H),8.03-7.94(m,6H),7.66(d,J＝4.0Hz,2H),7.58(dd,J＝10.0Hz,7.2Hz,4H),7.48(d,J＝5.2Hz,2H),7.22(t,J＝7.6Hz,2H),6.74(t,J＝7.6Hz,2H),6.06(d,J＝8.0Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ(ppm):164.9,156.5,155.3,152.9,148.9,144.5,143.5,142.2,137.1,135.6,133.4,130.5,130.2,128.5,127.3,125.0,124.6,123.3,120.7,21.3.
实施例3：对次氯酸敏感的水溶性磷光纳米粒子的制备：
将探针配合物Ir1(1.0mg)和参比配合物Ir1*(0.9mg)溶解于一定量的四氢呋喃(2.0mL)中，加入含有10.0mg磷脂聚乙二醇的PBS(10.0mL)溶液，迅速混合并超声2.0min。然后用氮气球鼓气至四氢呋喃挥发，最后用超滤离心管离心得到橙红色乳液产物，经冻干可得到橙红色固体，即纳米粒子Ir NPs。
实施例4：配合物Ir1、Ir1*对次氯酸根的响应性紫外吸收光谱测试
本发明采用的铱配合物Ir1、Ir1*光谱测试浓度为10μM，测试溶剂为混有1％DMSO的PBS溶液。图1为探针配合物Ir1在加入不同浓度的次氯酸根后的紫外吸收光谱图，如图所示，随着次氯酸根浓度的增加，Ir1在300nm处的吸收峰略有下降；图2为参比配合物Ir1*在加入不同浓度的次氯酸根后的紫外吸收光谱，如图所示，随着次氯酸根浓度的增加，Ir1*的紫外吸收光谱几乎不变，该结果从一定程度上说明Ir1在与次氯酸根作用后结构发生了改变，而Ir1*几乎不与次氯酸发生反应。
实施例5：配合物Ir1、Ir1*对次氯酸根的响应性发射光谱测试
本发明采用的铱配合物Ir1、Ir1*光谱测试浓度为10μM，测试溶剂为混有1％DMSO的PBS溶液。如图3所示，参比配合物Ir1*的最高发射峰为680nm，探针配合物Ir1与次氯酸反应后的Ir1-ClO-的最高发射峰为600nm，两者相距较远，影响较小，可以用于构建比率法成像。
实施例6：配合物Ir1、Ir1*的离子选择性实验
次氯酸根为5倍当量浓度，响应时间为1分钟，其余离子为20倍当量浓度，响应时间5分钟。结果如图4所示，在ClO-、K+、H2O2等存在下，参比配合物Ir1*在680nm处的发射峰强度几乎不变，而探针配合物Ir1在680nm处的发射峰被次氯酸根特异性点亮。因此，Ir1*可以用作参比，与Ir1构建比率法成像，用于特异性检测次氯酸根的变化。
实施例7：磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的TEM测试
将磷光水溶性纳米粒子Ir NPs溶于乙醇中，滴在铜网上，待其自然挥发后进行TEM测试。结果如图5所示，纳米粒子形状规则，分布均匀，均为圆形，粒子半径约为105nm。
实施例8：磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的DLS测试
将磷光水溶性纳米粒子Ir NPs溶于超纯水中，超声除去气泡，进行DLS测试。结果如图6所示，纳米粒子集中分布，其水合动力学半径约为125nm。
实施例9：配合物Ir1、Ir1*和纳米粒子Ir NPs的吸收光谱测试
本发明采用的铱配合物Ir1、Ir1*光谱测试浓度为10μM，测试溶剂为混有1％DMSO的PBS溶液；纳米粒子Ir NPs为1mg/mL，测试溶剂为PBS溶液。结果如图7所示，纳米粒子IrNPs的紫外吸收光谱包含了铱配合物Ir1、Ir1*的特征吸收峰。
实施例10：磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的滴定光谱测试
纳米粒子Ir NPs与0-20μMNaClO在PBS溶液(pH＝7.4)中的滴定光谱测试结果如图8所示，随着NaClO的增加，600nm处的发射强度不断增加，而680nm处的发射强度变化很小。I600nm/I 680nm与NaClO的关系如图9所示，从图中可以看出，随着NaClO的浓度不断增加，其比值不断增大，呈一定线性关系，可实现对次氯酸根的定量测试。
实施例11：磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的MTT细胞毒性实验
将消化后的细胞接种在96孔板中，每孔的接种密度为104个/孔，在37℃，5％CO2的条件下继续培养24小时。吸除旧的培养液后用不同浓度Ir NPs(10、50、100、200、300μg/mL)的细胞培养液继续培养细胞24小时。每孔加入10μL MTT(5mg/mL)继续培养4小时后终止培养。吸除培养液，每孔加入150μL DMSO，摇床震荡10分钟后使用酶标仪测试OD570。
MTT细胞毒性实验结果如图10所示，从图中可以看出在配合物的浓度为10～300μg/mL时，培养24小时后的细胞存活率均大于90％，证明该纳米粒子具有较低的细胞毒性，可用于细胞成像。
实施例12：磷光水溶性纳米粒子Ir NPs的细胞共聚焦成像实验
纳米粒子Ir NPs的细胞共聚焦成像实验，实验结果如图11所示，采用的浓度为10μg/mL。具体过程为，在37℃恒温箱中培养HeLa细胞24小时，然后将HeLa细胞与纳米粒子IrNPs在37℃下共孵育1小时，然后采用不同浓度的次氯酸培养液孵育。孵育结束进行共聚焦测试。测试结果如图11所示，绿光通道的发光随着次氯酸钠浓度的升高而增强，而红光通道的发光无明显变化，其比值I600nm/I680nm随着次氯酸钠的升高而增加。因此可以通过监测发光和两者的比值来监测细胞内次氯酸钠的变化。说明磷光水溶性纳米粒子Ir NPs可以通过比率法结合细胞寿命成像来特异性检测细胞内的次氯酸。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (5)
1.一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子，其特征在于，其结构如下：
其中，
表示磷脂聚乙二醇，
表示Ir1，
表示Ir1*；
该水溶性磷光纳米粒子的合成路线为：
2.如权利要求1所述的一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
1)将化合物a、化合物b和碳酸钾，在氮气保护下在乙腈溶液中混合反应3-5h，过滤，柱层析分离得到橙黄色固体化合物c；
2)将所述化合物c、铱二氯桥和六氟磷酸钾，在氮气保护下溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶液中，在45℃条件下回流反应6h，抽滤，柱层析分离得到橙红色固体，即配合物Ir1；
3)将所述配合物Ir1和配合物Ir1*溶解于四氢呋喃中，加入磷脂聚乙二醇的PBS溶液，迅速混合并超声2.0min，氮气球鼓气至四氢呋喃挥发，用超滤离心管离心得到橙红色乳液产物，经冻干得到橙红色固体，即纳米粒子Ir NPs。
3.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子在比率法特异性检测次氯酸中的应用。
4.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子在细胞传感领域和活体成像传感领域中的应用。
5.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于比率法检测次氯酸的水溶性磷光纳米粒子在活体炎症模型中的应用。
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