CN108531410A - 一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，将富集的细胞置于磷酸盐缓冲液(PBS)配制的单宁酸溶液中，摇床中震荡反应30min~6h使单宁酸在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成一层紧密结合的聚合物，使整个细胞在复杂的发酵环境中能长久保持活性，提高对产物的耐受性。本发明所需要的反应条件温和、实验操作过程简单。整个反应在碱性发酵溶液中一步完成，避免了对环境的污染，并且单宁酸来源广泛，存在于植物的根、茎、皮和各种中草药中，价格低廉，适用于大规模产业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
随着近几年细胞传感器、生物电子设备、生物催化等基于细胞的基础运用快速发展，这对细胞能够在复杂环境中保持长期的生存能力和功能性提出了更高的要求。先进的分子生物学技术被应用于改造细胞代谢途径，同时一些物理，化学的方法也被用于提高细胞的稳定性从而提高产物的分离，例如细胞固定化、培养基优化、ARTP诱变、原为分离技术等。但是基因工程的手段受限制于细胞自身的代谢途径，物理化学方法实验周期过长、实验结果不可逆、实验安全系数低。所以考虑对细胞表面直接进行功能性的改造，选用适当的材料对细胞进行直接修饰，同时也为调节细胞功能提供了强大的工具。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和市场需求，本发明的目的是提供一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，将富集的细胞置于PBS溶液配制的的单宁酸溶液中，摇床中震荡反应30min~6h使单宁酸在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成一层紧密结合的聚合物复合层，实现细胞表面功能化的修饰。
所述的富集的细胞是将过夜培养至对数期的细胞用无菌离心管离心收集。
所述的PBS溶液的pH=5.0~9.0，是摩尔质量0.02~1.0mol/L的Na2HPO4·12H2O和1~0.02mol/L的KH2PO4配置。
所述的用PBS溶液配置的单宁酸溶液的浓度为0. 1~5. 0 g /L。
所述的震荡反应的时间是30min~12h。
所述的样品在摇床中震荡反应的速度是100~200rpm。
所述的抗氧化复合层是由于单宁酸分子内的苯酚结构氧化生成相应的醌类结构，会迅速消耗大量的氧，更加能够进行工业化的扩大生产。
单宁酸来源广泛，存在于植物的根、茎、皮和各种中草药中，价格低廉，适用于大规模产业化。
以酵母细胞为例：
将过夜培养的酵母细胞用无菌离心管富集，放入用磷酸盐缓冲溶液配置的单宁酸溶液中，在摇床中震荡反应，使单宁酸在细胞膜表面反应、形成具有一定致密性的单宁酸保护层。
本发明中，所述的单宁酸在细胞表面发生自聚反应是物理与化学的共同作用下形成的：在碱性条件下，单宁酸在20min~3h之间就能够在细胞表面形成紧密的保护复合层。提高细胞表面膜功能的化学多功能性和维持细胞在复杂环境中的细胞活性。且实验过程简单、实验周期短、实验中不需要有机溶剂、有效地避免了对环境的污染。
本发明中，所述的单宁酸是具有多个邻位酚羟基结构的多酚，相邻的两个酚羟基能与金属离子形成稳定的五元环螯合物，邻苯三酚结构中的第三个酚羟基促进另外两个酚羟基的离解, 从而形成稳定的络合物。
本发明中，所述的在细胞膜表面修饰一定厚度的聚多酚保护层，它可以保护细胞免受复杂环境、有毒产物的破坏，如紫外线光照射和活性氧损害，来维持细胞的活性。
本发明中，所述的聚多酚保护壳层的厚度随着反应时间的增加，聚单宁酸的厚度从几纳米到几百纳米。
本发明中，所述的用PBS溶液配置的单宁酸溶液的浓度为0.1~5. 0 g /L，是称取一定量的单宁酸溶解在碱性的50ml的PBS溶液中。
所述的培养的酵母细胞是在30°C、转速为220rpm的摇床中培养。在YPD（YeastExtract Peptone Dextrose）培养基中培养至OD=0.8~2.4时，用无菌离心管2000~4000rpm离心收集菌体。YPD培养基的质量分数组成为：酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖22 g/L。
有益效果：
与现有技术相比，单宁酸在聚合反应过程中实验条件温和、操作简单，并且整个过程都是在PBS水溶液中完成，避免了有机溶剂对环境产生污染的可能性，单宁酸对整个对细胞的封装，赋予了细胞具有多种性能的生物结构, 如附着力、自组装、自修复、机械调谐和韧性等。
附图说明
图1对照组与实验组在强碱环境下细胞活性的测定。
图2对照组与实验组在高浓度苯乙醇环境下解脂耶氏酵母和大肠杆菌致死率的测定。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细、完整地说明。
实施例1
本实施例以所制备的基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的法如下：
选用酵母作为说明例子，将培养至对数期的解脂耶氏酵母菌体用无菌离心酸离心收集，分装入用不同pH PBS溶液配置的不同浓度单宁酸溶液中，在摇床震荡反应，使单宁酸在细胞表面发生氧化自聚合反应形成一层紧密的保护壳层。
具体步骤包括：
1.配置pH=6.0~8.0的PBS溶液。甲液：0.05mol/LNa2HPO4·12H2O溶液，称取十二水合磷酸氢二钠17.907g，用1000ml蒸馏水充分溶解。乙液：0.05mol/LKH2PO4溶液，称取磷酸二氢钾，6.8045g，用1000ml蒸馏水充分溶解。甲、乙两液各按不同比例混合，见表1，使用PH测定仪校准。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
表1：
| pH | 甲液（ml） | 乙液（ml） |
| 8.04 | 47.5 | 2.5 |
| 7.73 | 45 | 5 |
| 7.38 | 40 | 10 |
| 7.17 | 35 | 15 |
| 6.98 | 30 | 20 |
| 6.47 | 15 | 35 |
2．配置不同pH下不同浓度的单宁酸溶液，分别是1.0、2.0、3.0g /L，称取0.05g、0.1g、0.15g的单宁酸放置在超净台的紫外中照射杀菌15min，然后将其加入到配置好的50mL不同PH的PBS溶液中，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3．将解脂耶氏酵母ATCC201249从保种管内转接到YPD固体培养基中，划线活化，挑取单菌落接入YPD试管活化6~24小时，然后转接YPD摇瓶，在30°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，3000rpm离心收集菌体。将收集到的菌体均匀分装入pH为8.04、7.5、7.0、6.5的不同浓度的单宁酸溶液中，反应0.5~2h，单宁酸的浓度为1.0、2.0、3.0g /L。
此方法修饰的酵母细胞，相同浓度单宁酸在pH=8.04的碱性条件下发生氧化自聚合反应所需要的时间较中性环境更短。在30min内单宁酸就能在活细胞表面快速发生氧化自聚合反应形成一层致密的保护层,中性条件下单宁酸在细胞表面聚合的时间为1h~3h之间，所以最优的反应条件是碱性环境。
实施例 2
本实施例以所制备的基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法如下：
将培养至对数期的解脂耶氏酵母菌体用无菌离心管离心收集，分装入用PBS缓冲液配置的单宁酸溶液中，在摇床震荡反应，使单宁酸在细胞表面发生氧化自聚反应形成一层紧密的保护壳层。
具体包括如下步骤：
1. 将解脂耶氏酵母ATCC201249从保种管内转接到YPD固体培养基中，划线活化，挑取单菌落接入YPD试管活化6~24小时，然后转接YPD摇瓶，在30°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，3000rpm离心收集菌体。
2．配置pH=8.04的PBS溶液95%的0.05mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的0.05mol/L的KH2PO4混合。配置2.0g /L的单宁酸溶液，是称取0.1g的盐酸单宁酸放置在超净台的紫外中照射杀菌15min，然后将其加入到配置好的50mL的碱性PBS溶液中，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3．将收集到的菌体分别均匀分装入步骤2配置的单宁酸溶液（实验组）和步骤2配置的缓冲溶液中（对照组），放入摇床震荡反应30min，单宁酸在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成致密的聚单宁酸保护层。
4．离心收集细胞，将实验组和对照组的细胞用无菌水洗涤、重悬后，分别均匀分装入苯乙醇浓度为3.0g/L、0.0 g/L的YPD培养基中，30°C、225rpm培养。
5．培养1.5~3h后，取1ml细胞培养液，用梯度稀释法稀释至1010倍，选取适当的稀释倍数（106、107、108）将其均匀地涂布在YPD固体培养基上（每个稀释倍数做三个平行对照），培养12~72h后对平板上的单菌落进行计数。计算苯乙醇对细胞的致死率。
此方法修饰的酵母细胞，苯乙醇对其的致死率从65%下降到52%。
实施例 3
本实施例以所制备的基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法如下：
将培养至对数期的大肠杆菌用无菌离心管离心收集，分装入用PBS溶液配置的单宁酸溶液中，在摇床震荡反应，使单宁酸在细胞表面发生氧化自聚合反应形成一层紧密的保护壳层。
具体包括如下步骤：
1. 将大肠杆菌ATCC 8739从保种管内转接到LB固体培养基中，划线活化，挑取单菌落接入LB试管活化6~12小时，然后转接LB摇瓶，在37°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，2500rpm离心收集菌体。
2．配置pH=8.04的PBS溶液95%的0.05mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的0.05mol/L的KH2PO4混合。配置2.0g /L的单宁酸溶液，是称取0.1g的盐酸单宁酸放置在超净台的紫外中照射杀菌15min，然后将其加入到配置好的50mL的碱性PBS溶液中，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3．将收集到的菌体分别均匀分装入步骤2配置的单宁酸溶液（实验组）和步骤2配置的缓冲溶液中（对照组），放入摇床震荡反应30min，单宁酸在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成致密的单宁酸保护层。
4．离心收集细胞，将实验组和对照组的细胞用无菌水洗涤、重悬后，分别均匀分装入苯乙醇浓度为3.0g/L、0.0 g/L的LB培养基中，30°C、225rpm培养。
5．培养1.5~3h后，取1ml细胞培养液，用梯度稀释法稀释至1010倍，选取适当的稀释倍数（106、107、108）将其均匀地涂布在YPD固体培养基上（每个稀释倍数做三个平行对照），培养6~24h后对平板上的单菌落进行计数。计算苯乙醇对细胞的致死率。
此方法修饰的大肠杆菌细胞，苯乙醇对其的致死率从72%下降到58%。
实施例4
本实施例以所制备的基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法如下：
将培养至对数期的解脂耶氏酵母菌体用无菌离心管离心收集，分装入用PBS溶液配置的单宁酸溶液中，在摇床震荡反应，使单宁酸在细胞表面发生氧化自聚合反应形成一层紧密的保护壳层。
具体包括如下步骤：
1.配置pH=7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液：8g NaCl、1.15g磷酸氢二钾、0.2g磷酸二氢钾，纯水定容至1L。配置pH=8.0、pH=7.0、浓度为0.05mol/L的PBS溶液：95%的0.05mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的0.05mol/L的KH2PO4混合。配置5mg/ml的MTT试剂：20ml配置好的pH=7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液溶解100mg MTT试剂，用无菌滤头过滤除菌，2ml灭菌离心管分装。配置2.0g /L的单宁酸溶液，是称取0.1g的盐酸单宁酸放置在超净台的紫外中照射杀菌15min，然后将其加入到配置好的pH=8.0、pH=7.0的碱性PBS溶液中，震荡摇晃至粉末全部溶解。
2. 将解脂耶氏酵母ATCC201249从保种管内转接到YPD固体培养基中，划线活化，挑取单菌落接入YPD试管活化6~24小时，然后转接YPD摇瓶，在30°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，3000rpm离心收集菌体。
3．将收集到的菌体分别均匀分装入步骤1配置的不同PH条件的单宁酸溶液，放入摇床震荡反应30min，单宁酸在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成聚单宁酸保护层。
4．分别取样100μL加入96孔板，每孔添加10μL配置好的MTT溶液（每组做三个平行实验），用锡箔纸包裹30°C培养箱避光培养4h。
5．每孔加入100μL DMSO，摇床震荡10min使结晶充分溶解，用酶标仪测定OD570 nm。
在高PH的条件下，此方法修饰的解脂耶氏酵母的细胞活性较原始细胞高了55%。
Claims (7)
1.一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：将富集的细胞置于用PBS溶液配置的单宁酸溶液中，匀速震荡反应，使单宁酸在细胞表面形成紧密的聚合物层，保护细胞。
2.根据权利要求1所述的一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：所述的富集的细胞是将过夜培养至对数期的细胞用无菌离心管离心收集。
3.根据权利要求1所述的一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：所述的PBS溶液的pH=5.0~9.0，由摩尔质量0.02~1.0mol/L的Na2HPO4·12H2O和1~0.02mol/L的KH2PO4配置。
4.根据权利要求1所述的一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：所述的用PBS溶液配置的单宁酸溶液的浓度为0.1~5. 0 g /L。
5.根据权利要求1所述的一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：所述的震荡反应的时间是30min~12h。
6.根据权利要求4所述的一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：震荡反应的速度是100~200rpm。
7.根据权利要求1所述的一种基于植物多酚单宁酸氧化自聚合对细胞表面修饰的方法，其特征在于：所述的抗氧化复合层是由于单宁酸分子内的苯酚结构氧化生成相应的醌类结构。
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