CN107904190A - 一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，将细胞放在Tris‑盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液中，震荡反应20min~8h使多巴胺在细胞膜表面发生氧化聚合，多巴胺醌化合物与多巴胺发生歧化交联反应，在细胞表面形成一层复合层，对细胞表面功能涂层进行修饰，使细胞在不友好环境中能保持细胞活性。本发明条件温和、操作简单，并且整个过程都是在水溶液中完成的，所以规避了机溶剂对环境产生污染的可能性，多巴胺对整个对细胞表面功能涂层修饰是一步到位。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
随着生物电子设备、生物传感器、基于细胞的传感器和理论等都是关于基础细胞的运用，需要细胞能够在这种环境中具有长期的生存能力和功能性。随着先进分子生物学技术的发展，通过基因工程改变酵母代谢的方法已被探索用于细胞表面来表达受体或糖蛋白，但它们有一定的限制性，只能在天然的生化途径获得，也可能会扰乱细胞膜的功能。同时一些物理，化学的方法也被用于提高细胞的稳定性，例如细胞固定化、培养基优化、紫外诱变、添加有机溶剂等，但是它们的实验周期过长、有利的结果少、实验安全系数低。所以选用适当的材料对细胞表面进行工程修饰可以很好地解决这些挑战，同时也为调节细胞功能提供了强大的工具。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和市场需求，本发明的目的是提供一种可以对细胞表面功能涂层进行修饰的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，将待修饰细胞放入用Tris-盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液中，在摇床中震荡反应，使多巴胺在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成具有亲水性、超强黏性的聚多巴胺保护层，实现细胞表面功能涂层修饰。
所述的Tris-盐酸缓冲溶液的pH=6~9，由质量分数为95%的0.02~1.0mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的1~0.02mol/L的KH2PO4组成。
所述的Tris-盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液的浓度为0.5~6.0 g /L。
所述的震荡反应的时间是20min~8h。
摇床震荡反应的转速是150~350rpm。
所述聚多巴胺保护层的厚度为20~200nm。
所述的待修饰细胞为经过细胞培养后离心收集的菌体。
所述的细胞包括酵母细胞、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等。
以酵母细胞为例：
将培养好的酵母细胞离心收集，放入用Tris-盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液中，在摇床中震荡反应，使多巴胺在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成具有亲水性、超强黏性的聚多巴胺保护层。
本发明中，所述的多巴胺自聚反应是物理与化学的共同作用形成的：在碱性条件下，多巴胺在30min~2h之间就能够在细胞表面氧化成具有邻苯二醌结构的多巴胺醌，多巴胺和多巴胺醌之间发生反歧化反应，形成交联键，同时形成紧密的复合保护层。提高细胞表面的亲水性、化学多功能性和维持细胞在不友好环境中的细胞活性。且形成过程简单、反应时间短、不需要有机溶剂、对环境的污染小等。
本发明中，所述的聚多巴胺保护层中含有大量的氨基和羟基等亲水性官能团，从而提高亲水性；含有儿茶酚官能团，可与细胞膜表面形成共价键或非共价键，从而提高了黏附性。
本发明中，所诉的通过自聚合的方法在细胞膜表面修饰一定厚度的聚多巴胺保护层，它可以保护细胞免受不友好环境的破坏，如紫外线光照射和活性氧损害，来维持细胞的活性。
本发明中，所述的聚多巴胺保护壳层是黑色的，壳层的厚度随着涂层的增加而增加，随着反应时间的增加而增加，涂层的厚度从几纳米到几百纳米。
本发明中，所述的用Tris-盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液的浓度为0.5~3. 0 g/L，是称取0.025~0.6g的盐酸多巴胺加入50~100mL的Tris-盐酸缓冲溶液中。
所述的培养的酵母细胞是在30°C的环境下，在YPD（Yeast Extract PeptoneDextrose）培养基中培养至OD=0.8~2.4时，2000~4000rpm离心收集菌体。YPD培养基的质量分数组成为：酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖22 g/L。
有益效果：
与现有技术相比，多巴胺几乎能够附着在大多数细胞表面同时形成一层紧密的保护层，从而使细胞在不友好环境中能保持细胞活性。在聚合反应的过程中条件温和、操作简单，并且整个过程都是在水溶液中完成的，所以规避了机溶剂对环境产生污染的可能性，多巴胺对整个对细胞表面功能涂层修饰是一步到位。
附图说明
附图1是原始酵母细胞的镜检图。
附图2是酵母细胞在多巴胺缓冲溶液反应20min~8h的镜检图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细、完整地说明。
实施例1
本实施例以所制备的细胞表面功能涂层修饰的方法如下：
选用酵母作为说明例子，将培养的解脂耶氏酵母菌体离心收集，分装入用不同pH配置的不同浓度的多巴胺溶液中，在摇床震荡反应，使多巴胺在细胞表面发生自聚反应形成一层紧密的保护壳层。
具体步骤包括：
1.配置pH=6.0~8.04的Tris-盐酸缓冲溶液。甲液：0.05mol/LNa2HPO4·12H2O溶液，称取磷酸氢二钠17.907g，加蒸馏水至1000ml。乙液：0.05mol/LKH2PO4溶液，称取磷酸二氢钾，6.8045g，加蒸馏水至1000ml。甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需PH的缓冲液，见表1。
表1：
| pH | 甲液（ml） | 乙液（ml） |
| 8.04 | 47.5 | 2.5 |
| 7.73 | 45 | 5 |
| 7.38 | 40 | 10 |
| 7.17 | 35 | 15 |
| 6.98 | 30 | 20 |
| 6.47 | 15 | 35 |
2.配置不同pH下的多巴胺溶液，浓度分别是1.0、2.0、3.0g /L，称取0.05g、0.1g、0.15g的盐酸多巴胺放置在超净台的紫外中照射杀菌，然后将其加入50mL配置好的的不同PH的Tris-盐酸缓冲溶液，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3.将解脂耶氏酵母ATCC201249从保种管内接入YPD试管活化6~24小时，然后转接到YPD摇瓶，在30°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，3000rpm离心收集菌体。将收集到的菌体均匀分装入pH为8.04、7.5、7.0、6.5的不同浓度的多巴胺溶液中，反应0.5~2h，多巴胺的浓度为1.0、2.0、3.0g /L。
此方法修饰的酵母细胞，发现在pH=7.0~8.0时，且多巴胺浓度为2.0g/L时，在30min内多巴胺就能在活细胞表面快速发生自聚合反应形成一层黑色的保护层，并且保护层的厚度随着时间的延长而增长。
实施例 2
本实施例以所制备的细胞表面功能涂层修饰的方法如下：
将培养的解脂耶氏酵母菌体离心收集，放入用Tris-盐酸缓冲液配置的多巴胺溶液中，在摇床震荡反应，使多巴胺在细胞表面发生自聚反应形成一层紧密的保护壳层。
具体包括如下步骤：
1.将解脂耶氏酵母ATCC201249从保种管内接入YPD试管活化6~24小时，然后转接到YPD摇瓶，在30°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，3000rpm离心收集菌体。
2.配置pH=8.04的Thris-盐酸缓冲溶液，95%的0.05mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的0.05mol/L的KH2PO4混合。配置3.0g /L的多巴胺溶液，是称取0.15g的盐酸多巴胺放置在超净台的紫外中照射杀菌，然后将其加入50mL配置好的的Thris-盐酸缓冲溶液，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3.将收集到的菌体分别均匀分装入步骤2配置的多巴胺溶液（实验组）和步骤2配置的缓冲溶液中（对照组），放入摇床震荡反应30min，多巴胺在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成具有亲水性、超强黏性的聚多巴胺保护层。
4.离心收集细胞，将实验组和对照组的细胞重悬后，分别均匀分装入苯乙醇浓度为3.0g/L、0.0 g/L的培养基中，30°C、225rpm培养1.5~2h取样，用无菌水稀释1010倍，选取适当的稀释倍数将其均匀地涂布在YPD固体培养基上，培养12~72h后选取合适的稀释倍数的平板进行菌落计数。计算苯乙醇对细胞的致死率。
此方方法修饰的酵母细胞，苯乙醇对其的致死率从40%下降到10%。
实施例3
本实施例以所制备的细胞表面功能涂层修饰的方法如下：
将培养的枯草芽孢杆，菌菌体离心收集，放入用Tris-盐酸缓冲液配置的多巴胺溶液中，在摇床震荡反应，使多巴胺在细胞表面发生自聚反应形成一层紧密的保护壳层。
具体包括如下步骤：
1.将枯草芽孢杆菌CGMCC NO：9269，从保种管内接入LB试管活化6~24小时，然后转接到LB摇瓶，在37°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，4000rpm离心收集菌体。
2.配置pH=7.5的Thris-盐酸缓冲溶液，95%的0.05mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的0.05mol/L的KH2PO4混合。配置2.0g /L的多巴胺溶液，是称取0.1g的盐酸多巴胺放置在超净台的紫外中照射杀菌，然后将其加入50mL配置好的的Thris-盐酸缓冲溶液，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3.将收集到的菌体分别均匀分装入步骤2配置的多巴胺溶液（实验组）和步骤2配置的缓冲溶液中（对照组），放入摇床震荡反应60min，多巴胺在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成具有亲水性、超强黏性的聚多巴胺保护层。
4.离心收集细胞，将实验组和对照组的细胞重悬后，分别均匀分装入糠醛浓度为3.0g/L、0.0 g/L的培养基中，37°C、225rpm培养1~1.5h取样，用无菌水稀释1010倍，选取适当的稀释倍数将其均匀地涂布在LB固体培养基上，培养6~24h后选取合适的稀释倍数的平板进行菌落计数。计算苯乙醇对细胞的致死率。
此方方法修饰的枯草芽孢杆菌，糠醛对其的致死率从30%下降到15%。
实施例 4
本实施例以所制备的细胞表面功能涂层修饰的方法如下：
将培养的大肠杆菌菌体离心收集，放入用Tris-盐酸缓冲液配置的多巴胺溶液中，在摇床震荡反应，使多巴胺在细胞表面发生自聚反应形成一层紧密的保护壳层。
具体包括如下步骤：
1.将大肠杆菌ATCC 8739，从保种管内接入LB试管活化6~24小时，然后转接到LB摇瓶，在37°C、225rpm培养至OD=0.8~1.0，4000rpm离心收集菌体。
2.配置pH=7.0的Thris-盐酸缓冲溶液，95%的0.05mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的0.05mol/L的KH2PO4混合。配置2.0g /L的多巴胺溶液，是称取0.05g的盐酸多巴胺放置在超净台的紫外中照射杀菌，然后将其加入50mL配置好的的Thris-盐酸缓冲溶液，震荡摇晃至粉末全部溶解。
3.将收集到的菌体分别均匀分装入步骤2配置的多巴胺溶液（实验组）和步骤2配置的缓冲溶液中（对照组），放入摇床震荡反应90min，多巴胺在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成具有亲水性、超强黏性的聚多巴胺保护层。
4.离心收集细胞，将实验组和对照组的细胞重悬后，分别均匀分装入丁醇浓度为3.0g/L、0.0 g/L的培养基中，37°C、225rpm培养0.5~1h取样，用无菌水稀释1010倍，选取适当的稀释倍数将其均匀地涂布在LB固体培养基上，培养6~12h后选取合适的稀释倍数的平板进行菌落计数。计算苯乙醇对细胞的致死率。
此方方法修饰的大肠杆菌，丁醇对其的致死率从25%下降到14%。
最后有必要在此说明的是：上述实施例和说明仅仅是对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能被视为限制本发明的范围，本研究领域的技术人员对上述实验内容作出的非本质的改善和调整均是属于对本发明的保护。
Claims (8)
1.一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：将待修饰细胞放入用Tris-盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液中，在摇床中震荡反应，使多巴胺在细胞膜表面发生氧化自聚合反应形成聚多巴胺保护层，实现细胞表面功能涂层修饰。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：所述的Tris-盐酸缓冲溶液的pH=6~9，由质量分数为95%的0.02~1.0mol/L的Na2HPO4·12H2O和5%的1~0.02mol/L的KH2PO4组成。
3.根据权利要求1所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：所述的用Tris-盐酸缓冲溶液配置的多巴胺溶液的浓度为0.5~6. 0 g /L。
4.根据权利要求1所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：所述的震荡反应的时间是20min~8h。
5.根据权利要求4所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：摇床震荡反应的转速是150~350rpm。
6.根据权利要求1所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：所述聚多巴胺保护层的厚度为20~200nm。
7.根据权利要求1所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：所述的待修饰细胞为经过细胞培养后离心收集的菌体。
8.根据权利要求1所述的一种用于细胞表面功能涂层修饰的方法，其特征在于：所述的细胞包括酵母细胞、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等。
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