CN108524548A - 一种夏枯草蜂蜜提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种夏枯草蜂蜜提取物，由如下方法制备得到：1)将夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1～2混合后充分溶解，得夏枯草蜂蜜的水溶液；2)将所述夏枯草蜂蜜的水溶液过固相萃取小柱；3)用去离子水对固相萃取小柱进行淋洗，然后用甲醇对其进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，所得固形物即为所述夏枯草蜂蜜提取物。本发明的夏枯草提取物与夏枯草蜂蜜和其他方法提取得到的提取物相比，在抑制肠炎方面有显著的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及夏枯草蜂蜜的在制备预防和治疗炎症性肠病的制剂中的应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一类以肠道炎症为主要特征的疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD) 和溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)。炎症性肠病的发病原因目前尚未完全明确，临床上炎症性肠病常表现为反复发作而治愈难度很大。目前普遍认为其发病机制主要与宿主因素和外界因素之间复杂的相互作用密切相关。导致炎症性肠病发病的主要因素包括肠道微环境紊乱、免疫失调、外界环境改变、宿主的遗传因素等。据统计，全球炎症性肠病患者约500万人，其中美国约有140万人，欧洲约有300万人。
溃疡性结肠炎在临床较为常见，且近年来在我国的发病率呈上升趋势。该病病程长，病变范围位于结直肠的黏膜层，主要的病理表现为结直肠充血、水肿、溃疡、糜烂。当前，治疗溃疡性结肠炎的主要策略是抑制肠粘膜炎症，使用的药物主要是抗炎药，包括糖皮质激素、水杨酸类、抗生素类、免疫抑制剂如环磷酰胺等。尽管这些药物治疗方法在很多患者中取得了积极的治疗效果，但仍有相当数量的患者临床症状得不到完全改善，因此针对溃疡性结肠炎的治疗仍需研究开发新的药物治疗方法。
夏枯草(学名：Prunella vulgaris)，别称麦穗夏枯草、铁线夏枯草等，为唇形目唇形科植物。一般是在夏季采取半干燥果穗入药，但在中国台湾市场多见全草使用。在一般凉茶铺都有卖夏枯草饮料。主要生长于疏林、荒山、田埂及路旁，花期4－6月，果期7－10月。由于此草夏至后即枯，故有此名。夏枯草蜂蜜是以是蜜蜂从夏枯草植物(Prunella vulgarisL.)的花中采得的花蜜在蜂巢中酿制的蜜。
发明内容
本发明的目的是提供一种夏枯草蜂蜜提取物及其提取方法，这种蜂蜜提取物对于抑制肠炎具有一定的作用，可用于制备抑制肠炎的相关药物，这种蜂蜜提取物由如下方法制备得到：
1)将夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1～2混合后充分溶解，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)将所述夏枯草蜂蜜的水溶液过固相萃取小柱；
3)用去离子水对固相萃取小柱进行淋洗，然后用甲醇对其进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，所得固形物即为所述夏枯草蜂蜜提取物。
优选的，将所述夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1.3～1.7混合。在这种用量比的情况下，既能实现去离子水对夏枯草蜂蜜中的活性物质进行充分溶解，还不会因水过少粘稠度高而不利于后期的分离吸附，所得的活性成分的含量最佳。
优选的，通过涡旋震荡的方式将所述夏枯草蜂蜜充分溶解于去离子水中。
优选的，所述固相萃取小柱为OASIS SPE小柱。这种小柱对有效成分的提取效率高，且提取过程操作简单。
优选的，所述夏枯草蜂蜜为以5-6月的夏枯草为原料酿造得到的蜂蜜。研究发现，以5～6月的夏枯草为原料酿造得的蜂蜜，得到的提取物在治疗肠炎方面的效果更为突出，其他月份酿造得到的蜂蜜的效果较差。
优选的，所述夏枯草蜂蜜由意大利蜂酿造得到。意大利蜂的采集能力强，采集花源单一，可避免其他杂花的干扰。
优选的，所述夏枯草为生长于河南省驻马店市确山县的夏枯草。此处夏枯草大面积种植，花期一致。
优选的，本发明所述的固相萃取小柱在使用前需用水和甲醇先后进行活化。
优选的，在对提取得到的有效成分从固相萃取小柱上进行分离的过程中，淋洗所用的去离子水与所述夏枯草蜂蜜的质量相同，洗脱所用的甲醇的体积与所述去离子水的体积相同。在上述用量情况下，既可有效地去除提取物中的杂质，不会因为水的用量过多而损失部分有效成分，也不会因为水的用量过少而无法完全去除杂质，而且上述用量的甲醇可充分地将有效成分进行提取。
作为优选的方案，本发明的方法包括如下步骤：
1)将夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1.3～1.7混合后充分溶解，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)用水和甲醇先后对OASIS SPE固相萃取小柱进行活化，然后将所述夏枯草蜂蜜的水溶液通过所述OASIS SPE固相萃取，对所述蜂蜜水溶液中的有效成分进行吸附提取；
3)用与夏枯草蜂蜜相同质量的去离子水对所述OASIS SPE固相萃取小柱进行淋洗，然后用与淋洗所用水相同体积的甲醇对其进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，所得固形物即为所述夏枯草蜂蜜提取物。
本发明的另一目的是保护本发明所述方法制备得到的夏枯草蜂蜜提取物。
本发明的最后一个目的是保护本发明所述的提取物在制备抑制肠炎类的药品、食品和保健品中的应用；
本发明所述的肠炎类，主要指结肠炎，其中，涵盖多种结肠炎，包括缺血性结肠炎、乙状结肠炎、溃疡性结肠炎和伪膜性结肠炎等。对于溃疡性结肠炎有更为显著的应用效果。
本发明所述的结肠炎，特别是指由局部巨噬细胞释放溶酶体导致结肠粘膜屏障损伤，
或，肠道菌群改变和肠道粘膜屏障功能的丧失导致的溃疡性结肠炎。
本领域技术人员可以理解，可以根据实际需要将所述药物或保健品制备成本领域公知的各种剂型，如固体制剂中的片剂、胶囊剂、丸剂等，液体制剂中的注射剂、溶液剂等，半固体制剂中的凝胶剂，气体制剂中的气雾剂、喷雾剂等。或者可以根据实际需要将所述蜂蜜制备成本领域公知的种类，如饼干、面包等。
本领域技术人员同样可以理解，在以本发明的夏枯草蜂蜜、夏枯草蜂蜜提取物为主要活性成分制备用于预防或治疗炎症性肠炎的药物、食品、保健品时，可根据实际需要加入常规的助剂，如流平剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、助溶剂、润滑剂等。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明首次发现夏枯草蜂蜜提取物可用于制备炎症性肠病的药物或其他相关制品，尤其应用于溃疡性结肠炎时效果更为突出；
2)进一步的，本发明对夏枯草蜂蜜中的有效成分进行了提取，发现采用本发明的方法提取得到的夏枯草蜂蜜提取物在抑制肠炎方面的效果显著。
附图说明
图1为不同的蜂蜜提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎SD大鼠疾病活动指数的影响的周期图；
图2为不同的蜂蜜提取物在肠炎第6天时对DSS诱导的溃疡性结肠炎SD大鼠疾病活动指数的影响；
图3为不同的蜂蜜提取物对肠炎小鼠血清炎症因子释放的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作；实施例中采用的蜂蜜为2015年5月意大利蜂(Apis mellifera Ligustica)采集于河南新乡的夏枯草蜂蜜。
实施例1
本实施例涉及一种夏枯草蜂蜜提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)将10g夏枯草蜂蜜与15mL去离子在50mL离心管中混合后，涡旋转振动1min，使夏枯草蜂蜜与水充分混合，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)用5mL水和5mL甲醇先后活化OASIS SPE小柱，然后向SPE小柱中加入上述夏枯草蜂蜜的水溶液15ml；
3)待吸附完全后，先用10mL纯水淋洗所述OASIS SPE小柱，再加入10mL甲醇洗脱。收集洗脱液，氮气吹干，固形物定量即是蜂蜜提取物。
实施例2
本实施例涉及一种夏枯草蜂蜜提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)将10g夏枯草蜂蜜与20mL去离子在50mL离心管中混合后，涡旋转振动1min，使夏枯草蜂蜜与水充分混合，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)用5mL水和5mL甲醇先后活化OASIS SPE小柱，然后向SPE小柱中加入上述夏枯草蜂蜜的水溶液20ml；
3)待吸附完全后，先用15mL纯水淋洗所述OASIS SPE小柱，再加入15mL甲醇洗脱。收集洗脱液，氮气吹干，固形物定量即是蜂蜜提取物。
实施例3
本实施例涉及一种夏枯草蜂蜜提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)将10g夏枯草蜂蜜与30mL去离子在50mL离心管中混合后，涡旋转振动1min，使夏枯草蜂蜜与水充分混合，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)用5mL水和5mL甲醇先后活化OASIS SPE小柱，然后向SPE小柱中加入上述夏枯草蜂蜜的水溶液30ml；
3)待吸附完全后，先用20mL纯水淋洗所述OASIS SPE小柱，再加入20mL甲醇洗脱。收集洗脱液，氮气吹干，固形物定量即是蜂蜜提取物。
对比例1
与实施例1相比，其区别在于，选择StrataTM-X-A固相萃取小柱。
对比例2
与实施例1相比，其区别在于，采用乙酸乙酯对固相萃取小柱进行洗脱。
实验例1
本实验例研究了夏枯草蜂蜜及实施例1和对比例中夏枯草蜂蜜提取物在治疗溃疡性肠炎中的效果。
实验对象：实验动物为雄性SPF级SD大鼠(8周龄，体重190±20g) 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，培养环境为12h光照+12h黑暗，温度23℃，相对湿度50％～70％，自由采食和饮水。
实验方法：
大鼠在经过一周的适应性饲养后，随机分组：空白对照组(n为老鼠的头数，n＝5)；模型组(n＝10)；夏枯草蜂蜜灌胃组(n＝10，每日灌胃5g/kg体重)；实施例1～3中的夏枯草蜂蜜提取物组(n＝10，日粮中添加0.3％夏枯草蜂蜜提取物)；对比例1中的夏枯草蜂蜜提取物组 (n＝10，日粮中添加0.3％夏枯草蜂蜜提取物)，对比例2中的夏枯草蜂蜜提取物组(n＝10，日粮中添加0.3％夏枯草蜂蜜提取物)。日粮配方参考美国AIN-93M标准配方。
实验大鼠经过1周日粮饲喂后，开始溃疡性结肠炎的诱导。除空白对照组饮用蒸馏水外，其余大鼠均饮用含3％DSS，持续7d。7d后替换为正常蒸馏水。DSS饮水开始后直到实验结束，进行大鼠疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评估。每日观察2次，按表2标准根据体重下降、大便性状、隐血情况和动物总体状况评分相加，得出每只大鼠的疾病活动指数。
表1：疾病活动指数
1整体状况包括：活力、行为、姿势等；
2评分解释:0＝正常；1＝轻微；2＝中度；3＝严重；
实验结果：
夏枯草蜂蜜、夏枯草蜂蜜提取物对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数的影响结果见附图1。由图1可见，与正常对照组比，模型组大鼠从第4天开始出现明显的溃疡性结肠炎症状，包括精神状态下降、腹泻、便血等症状，DSS开始后第6天DAI指数达到高峰。与 DSS模型组相比，夏枯草蜂蜜、实施例1～3和对比例1对比例2中的夏枯草蜂蜜提取物处理即对大鼠疾病活动指数有一定影响，但是对比例 1和对比例2所得蜂蜜提取物并不能改善大鼠疾病活动指数。造模第5 天起，夏枯草蜂蜜、夏枯草蜂蜜提取物处理组能显著降低大鼠疾病活动指数。图2为肠炎第六天时不同蜂蜜提取物对肠炎大鼠疾病活动指数的影响，图中“***”表示同空白对照组相比，差异极显著；“###”同模型组相比，差异极显著，这也进一步说明，实施例1中的蜂蜜提取物和夏枯草蜂蜜均可有效地改善大鼠的疾病活动指数。
实验例2
本实验例研究了实施例1、2、3和对比例中夏枯草蜂蜜提取物在治疗溃疡性肠炎中的效果。
实验对象：实验动物为雄性SPF级ICR小鼠(8周龄，体重20±2g) 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，培养环境为12h光照+12h黑暗，温度23℃，相对湿度50％～70％，自由采食和饮水。
实验方法：
小鼠在经过一周的适应性饲养后，随机分组：空白对照组(n为老鼠的头数，n＝5)；模型组(n＝10)；夏枯草蜂蜜灌胃组(n＝10，每日灌胃5g/kg体重)；实施例1～3中的夏枯草蜂蜜提取物组(n＝10，日粮中添加0.3％夏枯草蜂蜜提取物)；对比例1中的夏枯草蜂蜜提取物组 (n＝10，日粮中添加0.3％夏枯草蜂蜜提取物)，对比例2中的夏枯草蜂蜜提取物组(n＝10，日粮中添加0.3％夏枯草蜂蜜提取物)。日粮配方参考美国AIN-93M标准配方。
小鼠在预饲喂蜂蜜提取物7天后，准备手术，手术前12h禁食，自由饮水。小鼠经3％戊巴比妥钠麻醉后，取头低尾高体位，将聚乙烯导管经肛门缓慢插入结肠3cm并经其注入5％乙酸0.4mL，捏紧小鼠肛门倒置30s，注入生理盐水1mL冲洗。空白对照小鼠灌肠生理盐水。造模结束后小鼠自然平躺，常规饲养3天后处死小鼠，收集血清进行炎症细胞因子的检测。
其结果如图3，图3为蜂蜜提取物对肠炎小鼠血清炎症因子释放的影响。“***”表示同空白对照组相比，差异极显著；“###”表示同模型组相比，差异极显著。由图3可知，模型组中肿瘤坏死因子浓度为 157ng/mL，实施例1中的夏枯草蜂蜜提取物在抑制肿瘤坏死因子释放量方面的效果最好，实施例2和实施例3的效果稍udah，血清中肿瘤坏死因子浓度为32ng/mL，显著低于模型组。对比例1和对比例2处理小鼠血清中肿瘤坏死因子浓度为160ng/mL，为165ng/mL，同模型组相比差异不显著。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种夏枯草蜂蜜提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1～3混合后充分溶解，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)将所述夏枯草蜂蜜的水溶液过固相萃取小柱；
3)用去离子水对固相萃取小柱进行淋洗，然后用甲醇对其进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，所得固形物即为所述夏枯草蜂蜜提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1.3～1.7混合。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，通过涡旋震荡的方式将所述夏枯草蜂蜜充分溶解于去离子水中。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述固相萃取小柱为OASIS SPE小柱。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中淋洗所用的去离子水与所述夏枯草蜂蜜的质量相同，洗脱所用的甲醇的体积与淋洗所用的去离子水的体积相同。
6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述夏枯草蜂蜜为以5-6月的夏枯草为原料酿造得到的蜂蜜。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述蜂蜜由意大利蜂酿造得到。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将夏枯草蜂蜜与去离子水按质量比1:1.3～1.7混合后充分溶解，得夏枯草蜂蜜的水溶液；
2)用水和甲醇先后对OASIS SPE固相萃取小柱进行活化，然后将所述夏枯草蜂蜜的水溶液通过所述OASIS SPE固相萃取，对所述蜂蜜水溶液中的有效成分进行吸附提取；
3)用与夏枯草蜂蜜相同质量的去离子水对所述OASIS SPE固相萃取小柱进行淋洗，然后用与淋洗所用水相同体积的甲醇对其进行洗脱，收集洗脱液后氮气吹干，所得固形物即为所述夏枯草蜂蜜提取物。
9.根据要求1～8任一项所述方法制备得到的夏枯草蜂蜜提取物。
10.权利要求9所述的提取物在制备抑制肠炎类的药品、食品和保健品中的应用；优选的，所述肠炎为缺血性结肠炎、乙状结肠炎、克罗恩病、伪膜性结肠炎等或溃疡性结肠炎，更优选溃疡性肠炎。
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