CN108516154B - 食物和饮料容器的过乙酸蒸气灭菌 - Google Patents

食物和饮料容器的过乙酸蒸气灭菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种灭菌表面的方法，该方法用含浓度至少约3500ppm的过乙酸蒸气在约57°‑75℃下处理该表面。该方法优选在不存在过氧化氢引发剂的情况下实施，且特别适于聚对苯二甲酸乙二酯瓶的灭菌。

Description

食物和饮料容器的过乙酸蒸气灭菌
技术领域
本发明涉及一种表面灭菌方法，该方法用至少约3500ppm浓度的蒸气在约57°-75℃下处理该表面。
技术背景
在过去的几十年里，已大量增加对可模塑塑料(例如聚对苯二甲酸乙二酯(PET))构成的塑料瓶的使用。因为该塑料瓶几乎不会破碎，重量只有大约玻璃的十分之一，透明度极好并且不会对其内含物口味产生任何影响，这类瓶子在现今社会已非常普遍。正如需要无菌填充的所有容器，塑料瓶必需在填充前功能性灭菌以去除例如微生物(如，肉毒杆菌(C.botulinum))或霉菌等痕量污染物,以达到无菌填充和储存寿命要求。通常容器大批量预生产和储存直至投入使用，因此很容易在正常储存条件下受到污染。一些塑料容器以塑料管或塞储存，在进入充填机前用热空气吹塑；因为塑料瓶熔化温度低，在该吹塑步骤中不必对内表面灭菌并需要额外处理。塑料瓶的独特挑战是，它们无法承受对于玻璃或金属容器而言可以承受的填充前用于灭菌的严酷处理(时间和温度)。因此，对这些瓶子填充消费品前，必需对其灭菌通过最小化致病性微生物来确保污染物风险。因为需要有大量的这类塑料瓶来满足消费者需求，需要快速实现该灭菌但又不降低效率。
过乙酸(也称为过氧乙酸)“PAA”是已知灭菌剂，现有技术表明PAA水性制剂不适于快速灭菌PET制备的容器。因此，美国专利6,790,380公开了为防止形成有害细菌，必需提高灭菌剂的温度和浓度，或延长处理时间。然而，该公开表明这些选择中没有一项是使用水性PAA灭菌PET所需要的－加热PAA溶液往往使PET瓶变形；而提高浓度导致不合乎需要的过氧化氢和/或乙酸的残留高。
不希望延长处理温度，因为这会显著减慢该方法。
美国专利6,536,188和6,945,013公开使用过氧化氢雾来消毒PET瓶内部。这些公开物还表明也可采用氧杂活性物(Oxonia,一种包含重量百分比15-40％的过氧化氢；重量百分比7-13％的乙酸；和重量百分比5-10％的PAA的混合物)。然而，这些公开物还表明必需首先活化该杀菌剂然后使用大量干燥工段除去它们。
美国专利申请2010/0196197公开使用稀释PAA溶液的真正蒸气(与含有悬浮液体颗粒的雾不同)来灭菌表面。然而，该公开物表明该蒸气应该在约80-120℃的温度下采用，并且接触时间在约15-40分钟之间。需要注意的是，PET玻璃化转变温度约为75℃，因此PET瓶可能在较高温度变形。另外，延长该接触温度不适用于大量瓶子的快速灭菌。
因此，如果可以开发一种采用PAA作为灭菌剂来快速灭菌PET瓶的方法，那是非常需要的。
发明内容
本发明涉及一种灭菌表面的方法，该方法用含浓度至少约为3500ppm的过乙酸的蒸气在约57°-75℃下处理该表面。该方法优选在不存在过氧化氢引发剂的情况下实施，且特别适于聚对苯二甲酸乙二酯瓶的灭菌。
发明详述
本发明涉及一种灭菌表面的方法，该方法用含有浓度至少约3500ppm过乙酸的蒸气在约57°-75℃下处理该表面。
本发明中采用的术语“蒸气”是指过乙酸基本完全处于气体形式的状态。这与薄雾或雾不同，薄雾和雾均包含显著比例的液滴悬浮在空气中。
过乙酸通常以乙酸、过氧化氢和过乙酸的水性平衡混合物的形式使用，其中这些组分的重量比为约35:10:15。该组合物通常还可包含稳定剂，例如膦酸或膦酸盐，即
Figure BDA0001695969180000021
2010或螯合剂，例如吡啶二羧酸,以及其它的组分，如:无机酸催化剂(硫酸、硝酸或磷酸)；表面活性剂例如阳离子型月桂酸、脱水山梨糖醇和其相应的酯，例如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯；以及短链(C3-C12)脂肪酸形成的混合过酸溶液。
优选地，本发明方法在不存在过氧化氢活化剂(例如紫外光)的情况下实施，因为已发现使用该活性剂时气相PAA活性降低。
引入加热的气流中前，优选通过加水将所述过乙酸浓度稀释至至少约3,500百万分之一份(ppm)。虽然可使用较高浓度，优选PAA浓度低于约10,000ppm，更优选低于约8,000ppm，以降低可能留在处理表面的过氧化物或乙酸残留量。最优选地，PAA稀释至3,750-4,250ppm的浓度。
该加热气流通常是无菌空气,但是也可以使用其它气体，例如氮气,CO2,或惰性稀有气体载体。该气流通常至少加热至约300℃,优选至约250℃的最低温度，可以超过350℃，只要其能充分冷却以供应用即可。通过加入并闪蒸环境温度灭菌溶液使加热空气冷却至所需温度。为确保采用蒸气形式的过乙酸，优选以确保气流低于100％饱和的速率将PAA溶液加入加热气流。加入PAA的速率优选使加热气流约75％-85％饱和的速率。约80％的饱和度可通过以大约5ml/分钟的速率(相当于大约每秒一滴)将PAA溶液加入空气流速约为30升/分钟的加热气流中。
气相PAA气流温度降低至约57°-75℃；然后将气流与待灭菌物质接触足以杀死所关心污染物的时间。该段时间可根据各变量变化，所述变量例如所采用过乙酸蒸气的浓度；待灭菌物质的表面性质；待灭菌的具体污染物；待灭菌的污染物的浓度；等等。然而，已发现低至5秒的接触时间足以有效灭菌测试表面。
本发明的方法特别适于灭菌PET制备的瓶子和其它容器。然而，可使用本发明方法对多种其它物质杀菌，包括金属、玻璃、塑料、聚合物和弹性体等。
该方法可用来对被那些细菌污染的物质进行灭菌，而人们通常用液体形式的过乙酸对这些细菌进行控制。这些包括杆菌类的细菌和孢子，用苏云金杆菌(B.thuringiensis)和萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)作为致病性更强的种类(形式)例如肉毒孢杆菌(C.botulinum)的替代物；以及经常用PAA控制的更常规种类的细菌、真菌和病毒以及原生动物，例如(但不限于):葡萄球菌(Staphlococcus),肠球菌(Enterococcus),沙门氏菌(Salmonella),弯曲杆菌(Capmylobacter),假单胞菌(Pseudomonas),假丝酵母菌(Candida),根霉菌(Rhizopus),毛霉菌(Mucor),流感病毒(Influenza)等。
以下实施例用来进一步说明本发明的方法，但不以任何方式构成本发明范围的限制。
实施例
实施例1
蒸发设备构建
为制备不同温度和浓度的气化灭菌剂，构建以下蒸发设备。将1/2英寸直径的不锈钢管与100巴压缩空气供应连接。该管连接于不锈钢针型阀(用于调节气流)，该针型阀连接于国王型7910系列玻璃管旋转流量计(King Model 7910Series Glass tube rotometer)(每分钟0-40升标准流量计)空气流量计。空气流量计连接于能将空气加热至300华氏度(远高于过乙酸溶液的沸点)的电子加热器，该加热器与蒸发器盒连接。这是个顶部具有用于观察过乙酸溶液进入和蒸发的玻璃窗口的不锈钢盒。蒸发盒5面绝缘以最小化热量流失。在蒸发盒底部放置来自生物奥秘加研究产品公司(Biomega Research Products)实验室加热板，该加热板能使盒底加热到远超PAA溶液沸点的温度。
另一支1/2英寸不锈钢空气管用来加压校准圆柱筒，该圆柱筒含有设备中待测试的多种水性PAA或其它灭菌剂溶液。校验圆柱筒连接于1/4英寸不锈钢管，该不锈钢管具有调控溶液经过该管流速的针型阀。该管连接于蒸发盒顶部，以至流出该管的灭菌溶液液滴能直接落在蒸发盒的加热底部上，得到足够的加热以至溶液闪蒸成热气流。其中插有铂电热偶线(用于测量和调控热气流温度)的绝缘1/2英寸不锈钢管作为蒸发灭菌剂流进入测试设备的出口。
在如下所述的测试期间，通过调节国王旋转流量计(King rotometer)将加热气体气流速设置为30升/分钟；调节针型阀以提供流速为5mL/分钟的测试溶液(大约1滴/秒)；产生大约80％饱和的热蒸气流。设置电子加热器温度将空气加热至300°F；调节加热板温度直至排出的蒸气流达到所示的需要温度。
使用的稀释PAA/水混合物强度通过Metrohm 814USB样品处理器(Metrohm814USBSample Processor)测量，采用电位计评估pH拐点用来测定补充溶液的PAA含量。
灭菌容器中的气相PAA测试
评估饮料瓶中过乙酸蒸气在大约60℃下对萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeu)ATCC 9372大约5和10秒的有效性。
使用上述蒸发设备评价过乙酸(PAA)蒸气对萎缩芽孢杆菌ATCC 9372孢子的有效性，内生孢子形成细菌通常用于饮料加工检验测试的灭菌测试生物。在PET水瓶的底部表面接种萎缩芽孢杆菌孢子制备悬液，目标是每瓶105个孢子。将接种并干燥的瓶子暴露于在60℃下经
Figure BDA0001695969180000041
过乙酸(来自FMC公司)合适稀释而产生的多种浓度PAA溶液的蒸气，暴露5和10秒；在递送蒸气时经过或不经过5秒钟紫外光(过氧化氢活化剂)处理。对瓶子计数并在有氧平板计数(“APC”)上涂板，剩余肉汤孵育用于生长测定，如下所述。
接种物制备
萎缩芽孢杆菌9372孢子制备悬液购自普雷斯克培养物公司(Presque IsleCultures)。该溶液含有40％乙醇，储存在实验室冰箱中直至测试。该悬液含有1.3x 1010个克隆形成单位(CFU)/mL的孢子。每次测试用40％乙醇制备稀释；4,300ppm PAA的测试包含大约1x 106孢子/mL(目标是1x 104孢子/瓶)；2014ppm和7947ppm的测试包含大约1x 107孢子/mL(目标是1x 105孢子/瓶)；以作为测试的接种物。
瓶载体制备
清空并用无水乙醇冲洗市售获得的PET水瓶(0.5L)，在生物安全柜中过夜干燥，以消毒内部表面。然后用10μL合适的接种物对瓶子接种，用工作培养物接种在内部底部表面。之后在生物安全柜中干燥过夜直至干燥。接种的瓶子用于制备一周内的测试。
测试方法：
将接种的瓶子放置在相邻于蒸发设备的通风罩中的蒸气递送软管末端，经过5和10秒蒸气暴露，用实验室定时器定时。
从蒸气递送管取出之后立即通过无菌技术向瓶中加入50mL含0.5％硫代硫酸钠的中和肉汤Lethee。瓶子盖上盖子并振荡以确保表面上已冷凝的任何蒸气与中和剂混合。对瓶子超声处理5分钟，涡旋混合30秒，之后在Butterfield's缓冲液中稀释并在APC上涂板。所有含中和肉汤的测试瓶以及所有平板在35±2℃下孵育大约24小时，之后初步读数，然后再孵育数天至2周以用于最终读数。单样本进行该测试。如上所述通过计数接种的和未处理的瓶子，一式两份实施接种物对照。完成接种后，通过浊度方法评估瓶子中的生长情况。该测试结果汇总在以下表1和表2中：
表1
使用约4000ppm PAA溶液的蒸气测试结果
Figure BDA0001695969180000051
Figure BDA0001695969180000061
*用自动滴定仪测定
表2
使用目标为2000和8000ppm PAA溶液的蒸气测试结果
Figure BDA0001695969180000062
*用自动滴定仪测定
**50mL涂板1CFU的结果，因此残留大约50CFU
***该样品测试5秒钟，然后其后短时间内再处理5秒钟
以上结果证明观察到在紫外光不存在的情况下，通过使用至少4,300ppm浓度的PAA基本完全灭菌。这些结果令人意外，UV光是已知的过氧化氢活化剂。
实施例2
残留测试
采用实施例1所述的蒸发设备，为测定残留在灭菌瓶表面的残余过氧化氢量进行测试。清空PET瓶子(0.5L)，用去离子水冲洗三次，然后用浓度约为4000和14,000ppm的PAA蒸气处理5秒钟。该处理后，用去离子水填充该瓶；使用LaMotte HP-40滴定试剂盒测试该水的低水平过氧化氢。还进行测试蒸气中递送的PAA量。为该目的，用去离子水预先湿润大范围的PAA测试条，置于代表性的未接种瓶中。该瓶子经蒸气处理，评估测试条颜色变化来表明蒸气中存在的PAA。该测试结果汇总在以下表3和表4中：
表3
采用0.5L瓶，5秒暴露的残留过氧化氢测试结果
Figure BDA0001695969180000071
*用自动滴定仪测定
表4
采用0.5L瓶，5秒暴露的PAA蒸气浓度
Figure BDA0001695969180000072
以上结果说明该发明方法可有效灭菌PET瓶，不残留过量的残余过氧化氢。
实施例3
评价浓度为2000、3000和4000ppm的气相PAA对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)的控制。
采用实施例1中所述设备和方法，如下所述，通过
Figure BDA0001695969180000086
过乙酸与去离子水稀释制备浓度为2000ppm、3000ppm和4000ppm PAA的气化PAA溶液。该测试涉及在约60℃下与气化PAA暴露5秒钟，经过或不经过UV光处理5秒钟，处理接种的瓶子。
接种物制备
枯草芽孢杆菌19659孢子制备悬液购自普雷斯克培养物公司(Presque IsleCultures)。该溶液含有40％乙醇，储存在冰箱中直至测试。该悬液含有1.6x 1010CFU/mL孢子。在40％乙醇中制备用于该测试的稀释物，目标约为1x 108孢子/mL(目标为1x 106孢子/瓶)，作为该测试的接种物。
瓶载体制备
清空市售可得的PET水瓶(0.5L)，用10μL合适的接种物对该瓶接种，用工作培养物接种在内部底部表面。然后将样品干燥过夜。
杀生物剂制备
滴定
Figure BDA0001695969180000081
过乙酸(获自FMC公司)，用自动滴度仪测定起始浓度，其用于测定和制备去离子水中PAA溶液所必需的稀释物。
使用11.85g
Figure BDA0001695969180000082
过乙酸在1L水中制备杀生物剂等份试样以获得2000ppm溶液；在1L去离子水中使用17.77g
Figure BDA0001695969180000083
过乙酸以获得3000ppm溶液，在1L去离子水中使用23.70g
Figure BDA0001695969180000084
过乙酸以获得4000ppm溶液。保留少量各溶液用于在自动滴定仪上滴定，剩余的加到蒸气设备上的圆柱筒中。该滴定结果示于表5：
表5
滴定结果
Figure BDA0001695969180000085
Figure BDA0001695969180000091
*PAA起始浓度为16.8808％
测试方法
采用实施例1所述的设备和方法，用气化PAA溶液处理接种瓶。从蒸气递送管移出后瓶子立即保持5秒钟，或立即用UV光处理5秒钟。该步骤后立即通过无菌技术向瓶中加入50mL补充有0.5％硫代硫酸钠的中和肉汤Letheen。瓶子盖上盖子并振荡以确保表面上已冷凝的蒸气与中和剂混合。对瓶子超声处理5分钟，涡旋混合30秒，之后在Butterfield's缓冲液中稀释并在APC上涂板。所有含中和肉汤的测试瓶以及所有平板先初步读数，然后在35±2℃下孵育大约24-72小时，再孵育数天至2周以用于最终读数。样品以一式两份实施。如上所述通过计算接种和未处理的瓶子，同样一式两份实施接种物控制。完成接种后，通过浊度方法评估瓶子中的生长情况。
计算
log10下降＝平均log10(群对照)－log10(测试样本)
该测试结果示于以下表6中。
表6
经过和不经过后续UV处理的2000、3000和4000ppm PAA蒸气溶液相比枯草芽孢杆菌孢子的测试结果
Figure BDA0001695969180000092
Figure BDA0001695969180000101
上述结果表明，在PAA蒸气浓度为4000ppm UV光不存在的情况下观察到完全控制。观察到用较低浓度PAA处理时控制基本较差。
实施例4
对比4000ppm PAA，在大约50、55和60℃下对饮料瓶中枯草芽孢杆菌ATCC 19659处 理5秒钟来评估35％过氧化氢蒸气有效性。
采用实施例1所述设备和方法(除非下有说明)，在PET饮料瓶中50、55和60℃下暴露5秒钟，用枯草芽孢杆菌19659孢子评估浓缩(约35％)气相过氧化氢相比气相4000ppm过乙酸(PAA)的有效性。
接种物制备
枯草芽孢杆菌19659孢子制备悬液购自普雷斯克培养物公司(Presque IsleCultures)。该溶液含有40％乙醇和1.6x 1010CFU/mL孢子。为达到约1x 108孢子/mL在40％乙醇中制备1:100稀释物以用作该实施例中的工作接种物。
瓶载体制备
该测试中使用市售可得的PET饮料瓶(0.5L)。为得到1.6x 106孢子/瓶，用10μL合适的孢子接种物对瓶子接种，用工作培养物接种在内部底部表面。之后在生物安全柜中干燥过夜。测试前观察这些瓶子是否干燥。
杀生物剂制备
滴定
Figure BDA0001695969180000102
SP-15过乙酸(获自FMC公司)，用自动滴定仪测定起始浓度为15.2929％，其用于测定和制备去离子水中4000ppm PAA溶液所必需的稀释物。作为对照，采用
Figure BDA0001695969180000103
过氧化氢的样品瓶(包含35.7％过氧化氢；获自FMC公司)。
测试方法
采用实施例1所述的气化设备，制备具有所示温度的制剂。接种瓶置于蒸气递送软管末端，经过约5秒钟蒸气暴露，用实验室计时器计时。从蒸气递送管取出之后立即通过无菌技术向瓶中加入50mL补充有0.5％硫代硫酸钠的中和肉汤Letheen。向各瓶加入100uL等分过氧化氢酶(沃辛顿生物制药公司(Worthington Biomedicals)，每8mgP 5,583单位，0.48mgP/mL)以中和任何残留的过氧化氢。瓶子盖上盖子并振荡以确保表面上已冷凝的任何蒸气与中和剂混合。对瓶子超声处理5分钟，之后涡旋混合30秒，然后在Butterfield's缓冲液中稀释并在Petrifilm APC上涂板。所有含中和肉汤的测试瓶以及所有平板，在35±2℃下孵育大约72小时，从孵育器移出至室温环境再放置24小时，其后计数。一式两份进行该测试。
如上所述通过计算接种和未处理的瓶子，同样一式两份实施接种物控制。
计算
log10下降＝平均log10(群对照)－log10(测试样本)
该测试结果汇总在以下表7中：
表7
对比含6.2log10枯草杆菌孢子的瓶子的气相过氧化氢和4000ppm PAA
Figure BDA0001695969180000111
Figure BDA0001695969180000121
以上结果说明本发明的方法基本上能对PET瓶完全灭菌；该温度使用过氧化氢相对无效。

Claims (3)

1.一种灭菌聚对苯二甲酸乙二酯瓶的方法，所述方法提供杀孢子活性，该方法包括：
(a)将过乙酸溶液引入加热的气体，形成过乙酸蒸气流；和
(b)用所述过乙酸蒸气流对瓶灭菌，其中过乙酸基本完全以气相形式存在，浓度为3500ppm到4250ppm，温度为57℃-75℃，其中灭菌5-10秒，其中过乙酸蒸气低于85％饱和，所述灭菌在不存在过氧化氢引发剂的情况下实施，和其中经灭菌聚对苯二甲酸乙二酯瓶上的过氧化氢减少。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过乙酸浓度至少为3750ppm。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蒸气为75％至低于85％饱和。
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