CN108498553A - 一种白刺种子提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种白刺种子提取物，它是由如下方法制备得到的：取白刺种子，以水或乙醇水溶液为溶剂提取后，提取液浓缩至无醇味后，再以石油醚‑水系统进行萃取，取水层，除去溶剂即得白刺种子提取物。本发明研究表明，本发明提供的白刺种子提取物能降低高血脂大鼠血清中的总胆固醇、总甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇，提高其高密度脂蛋白胆固醇，并能在一定程度上对抗高血脂大鼠体重的异常增长。同时对各组大鼠的肝组织进行病理学切片观察也发现，该提取物能不同程度的改善脂肪肝的脂肪组织和细胞形态的变化，为临床预防或治疗高脂血症或脂肪肝提供了新的选择。同时，本发明还找到了除白刺籽油外的新活性部位，为白刺种子的开发利用提供了新方向。

Description

一种白刺种子提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种白刺种子提取物及其用途。

背景技术

高血脂症是引起动脉粥样硬化以及与动脉粥样硬化相关疾病如冠状动脉心脏疾病、缺血性脑疾病以及周围血管疾病的主要原因。尽管由于药物治疗、预防作用，与动脉粥样硬化相关的疾病的发病情况已经得到了改善，然而以上情况仍在中老年人发病率与死亡率中占有较大比例。由于肥胖症和世界人口老龄化的日益突出，在未来的十年，每年的发病率和数量将会大幅度的增长。血脂异常是由血脂代谢异常引起的如血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)的增加和高密度脂蛋白(HDL-C)的降低。尤其是，研究表明LDL-C浓度的增加在动脉粥样硬化的发病机制中起着主要的作用，并且与心血管疾病更高的发病率有着强烈的关系。通过饮食或者药物的方法减少LDL-C水平在减少心脑血管疾病的发病率方面起着重要作用。事实表明血脂异常是动脉粥样硬化发生的一个危险因素，因此促进了降低胆固醇水平药物的研发。这些药物主要是通过降低总胆固醇和低密度脂蛋白水平来发挥作用的。因此开发与研发能够降低心血管疾病风险的新型药物是非常重要的，尤其是具有很强的降低血脂水平同时无毒副作用的新型药物将会是很受欢迎的。

前期研究表明白刺果实(蒺藜科Zygophyllaceae白刺属植物唐古特白刺NitrariaTangutorum Bobr)对高脂饲料诱导的高血脂小鼠和大鼠的血清TG、TC以及大鼠的LDL-C水平具有显著的抑制作用，同时可显著升高高血脂大鼠HDL/TC、HDL/LDL的比值，表明唐古特白刺果实具有明显的降低血脂、防治动脉粥样硬化和抗氧化的作用。同时，研究还表明白刺种子籽油中高剂量即5g/kg和10g/kg对高脂饲料诱导的大鼠血清TC、TG及LDL具有显著的抑制作用，可显著升高高血脂大鼠HDL/TC和HDL/LDL的比值，表明高剂量白刺种籽油具有显著的降血脂作用。

目前对白刺种子降血脂的研究仅仅局限于白刺种子籽油的降血脂作用，对白刺种子的其它部位的降血脂活性的研究未见报道。

发明内容

现有技术中报道了白刺种子籽油具有降血脂作用，籽油由非极性或低极性化合物组成，可以采用二氧化碳超临界萃取，也可以采用非极性或低极性有机溶剂溶剂进行提取，例如乙醇，乙醇溶解性能介于极性与非极性溶剂之间，它可以通过与水进行任意配比，从而选择性地溶解水溶性成分或非极性溶剂所溶解的一些成分，一般乙醇含量在90％以上时，可提取挥发油、有机酸、树脂、叶绿素等成分；乙醇含量在50～70％时，适于提取生物碱、苷类等；乙醇含量在50％以下时，适于提取蒽醌苷类化合物等(《中药药剂学》，张兆旺，中国中医药出版社，2003年第1版，第99页倒数第3段)。根据上述技术内容，若希望用乙醇提取白刺种子籽油成分，则需要使用90％v/v以上的乙醇作为溶剂。

与上述技术不同的是，本发明实际是希望提供一种有别于籽油的新提取物。为此，本发明提供了一种较低浓度乙醇提取的白刺种子提取物。

具体地，本发明提供了一种白刺种子提取物，它是由如下方法制备得到的：

取白刺种子，以50％～75％V/V乙醇水溶液为溶剂提取，所得乙醇提取物即为白刺种子提取物。

该提取物是浓度75％v/v以下乙醇提取得到，其提取物极性显然与籽油有所不同。

其中，所述乙醇水溶液的浓度为70％～75％V/V，优选为75％V/V。

其中，提取温度为50～80℃，进一步为60～70℃，优选为65℃。

进一步地，在乙醇水溶液提取前，将白刺种子进行粉碎。

其中，所述白刺为蒺藜科Zygophyllaceae白刺属植物唐古特白刺NitrariaTangutorum Bobr。

本发明还提供了上述白刺种子提取物的制备方法，它包括如下操作方式：

取白刺种子，以50％～75％V/V乙醇水溶液为溶剂提取，所得乙醇提取物即为白刺种子提取物。

中，所述乙醇水溶液的浓度为70％～75％V/V，优选为75％V/V。

其中，提取温度为50～80℃，进一步为60～70℃，优选为65℃。

进一步地，在乙醇水溶液提取前，将白刺种子进行粉碎。

本发明还提供了上述白刺种子提取物在制备改善血脂异常的药物或保健品中的用途。

进一步地，所述药物或保健品是降低血清TC、TC和LDL-C，提高HDL-C的药物或保健品。

本发明还提供了上述白刺种子提取物在制备预防或治疗脂肪肝的药物或保健品中的用途。

进一步地，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。

更进一步地，所述脂肪肝为单纯性脂肪肝。

本发明研究表明，本发明提供的白刺种子较低浓度乙醇提取物，能降低高血脂大鼠血清中的总胆固醇、总甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇，提高其高密度脂蛋白胆固醇，并能在一定程度上对抗高血脂大鼠体重的异常增长。同时对各组大鼠的肝组织进行病理学切片观察也发现，该提取物能不同程度的改善脂肪肝的脂肪组织和细胞形态的变化，为临床预防或治疗高脂血症或脂肪肝提供了新的选择。

同时，本发明还找到了除白刺籽油外的新活性部位，为白刺种子的开发利用提供了新的方向。

附图说明

图1高脂饲料建模法对大鼠体重的动态影响

图2不同实验组大鼠的肾脏系数

图3不同实验组大鼠的肝脏系数

图4不同实验组大鼠的脾脏系数

图5不同实验组大鼠的心脏系数

图6各实验组大鼠总胆固醇含量

图7各实验组大鼠总甘油三酯含量

图8各实验组大鼠高密度脂蛋白胆含量

图9各实验组大鼠低密度脂蛋白含量

图10各实验组大鼠的肝组织病理切片图(200×)

具体实施方式

实施例1本发明提取物的制备方法

取5kg白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1:10kg/L的料液比进行提取，提取时间2h，提取溶剂75％的乙醇，提取次数为3次，提取温度是65℃。3次提取后将提取溶液合并，浓缩，干燥，即得本发明提取物。

实施例2本发明提取物的制备方法

取5kg白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1:10kg/L的料液比进行提取，提取时间2h，提取溶剂50％的乙醇，提取次数为3次，提取温度是65℃。3次提取后将提取溶液合并，浓缩，干燥，即得本发明提取物。

实施例3本发明提取物的药效学研究

1.1仪器与试剂

DFY-1000C高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；HYY401型自动煎药包装机，天津华延园机械有限公司；R1050大型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；TF-FD-1真空冷冻干燥机，上海田枫实业有限公司；台式过滤离心机TF-3-C，上海圣科仪器设备有限公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；奥林巴斯显微镜，奥林巴斯公司；ALC-110.4型电子天平(德国Acculab公司)；乙醇、石油醚、吐温80、二甲苯、液体石蜡等均为分析纯。大小鼠专用普通饲料，北京合力科创科技发展有限公司；胆固醇、胆盐，郑州鸿鑫食化有限公司；丙基硫氧嘧啶，上海如吉生物科技发展有限公司；血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司；TC测定试剂盒、TG测定试剂盒、LDL-C测定试剂盒、HDL-C测定试剂盒均来自南京建成生物工程研究所。

1.2样品制备

5kg白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1:10kg/L的料液比进行提取，提取时间2h，提取溶剂75％的乙醇，提取次数为3次。3次提取后将提取溶液合并并于旋转蒸发仪上回收乙醇至无醇味后，取出一部分冷冻干燥得乙醇提取物部分。另一部分加入石油醚进行反复萃取5次，石油醚与乙醇提取物的体积比为2:1，将经过石油醚萃取后的水部分粗提物于旋转蒸发仪上浓缩，并于真空冷冻干燥设备上冷冻干燥得水部位。血脂康胶囊胶囊配置浓度为0.02g/mL，其它各组样品浓度剂量分别为低浓度0.02g/mL、终浓度0.06g/mL和高浓度为0.18g/mL。

1.3动物分组及高血脂模型的建立

Wistar大鼠120只，雌雄各半，购买于兰州大学医学实验中心，体重170±10g，普通饲料喂养4天后，随机分组，每组10只，雌雄各5只。分别为空白对照组(N)，高脂饲料模型组(M)，阳性对照血脂康组(P)，乙醇提取物高剂量组(BZH)，乙醇提取物中剂量组(BZM)，乙醇提取物低剂量组(BZL)，水部位高剂量组(BZWH)，水部位中剂量组(BZWM)和水部位低剂量组(BZWL)。其中，空白对照组给予普通饲料喂养，其它组给予高脂饲料。高脂饲料配比：15％猪油、1％胆固醇、0.2％胆盐、12％蛋黄和71.8％的基础饲料。另外，在造模的过程中，为了保证造模的成功，在饲喂高脂饲料的同时，对各个用药组、模型组以及阳性对照组同时灌胃1mL/100g的脂肪乳。脂肪乳配比：15％猪油、2.5％胆固醇、0.5％胆盐、0.1％丙基硫氧嘧啶、1％吐温，其余为蒸馏水。空白组灌胃给于同体积的蒸馏水。脂肪乳中加入抗甲状腺代谢药即丙基硫氧嘧啶可抑制胆固醇等被分解，而加入胆酸盐则可促进胆固醇的吸收，从而使血液中的TC和TG升高，并促使高脂血模型成立。在饲喂高脂饲料并灌胃脂肪乳3周后，开始给予药物治疗4周。大鼠的灌胃体积为1mL/100g。其分组情况及各组给药量如表1所示。大鼠饲养期间，每天观察老鼠状态及健康情况，每隔三天换一次垫料，清洗饮水瓶以防止生菌，同时每两周测量一次体重并记录。

1.4血脂测定及各脏器重量的统计

给药最后一天，对大鼠禁食不禁水过夜。第二天采用25％乌拉坦对大鼠进行麻醉，麻醉剂量为1mL/100g，麻醉后采用采血管对大鼠腹主动脉取血。采血后的血样在室温下静止2h后，经高速离心机离心15min，转速设定为5000rpm，使用移液器取出离心上层血清，采用试剂盒对血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C进行测定。取血完毕后，将大鼠的心脏、肝脏、肾脏以及脾脏剥离出后，用生理盐水冲洗后，滤纸吸去多余液体并称重。称重完毕后，在每块肝脏的同一部位切去一小块肝组织，投入10％福尔马林溶液中固定，第二天换新的福尔马林溶液进行浸泡。

表1大鼠的分组情况及各组给药量

本发明给药剂量按提取物重量计。

1.5组织病理学切片

把事先固定在10％福尔马林中的肝脏组织取出，切取合适厚度的组织后，进行石蜡切片。具体过程如下：(1)脱水：70％、80％乙醇中脱水40min，95％Ⅰ、95％Ⅱ的乙醇中脱水30min，100％Ⅰ、100％Ⅱ的无水乙醇中分别脱水20min和15min。(2)透明：脱水后的组织放入三氯甲烷Ⅰ和Ⅱ中进行透明。(3)浸蜡：将组织放入已经融化的液体石蜡中，浸蜡时间依次为40、30和20min。(4)包埋：浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的金属包埋框盒中(摆好在蜡中的位置)，待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。(5)切片：包埋好的蜡块夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片厚度为4-7μm，用毛笔轻托轻放在水浴锅中(50℃左右)。(6)贴片与烤片：将一定长度蜡带(连续切片)或用镊子断开成单个蜡片于温水中展平后，捞至玻片上铺正，将载玻片放入60℃恒温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。(7)切片脱蜡及水化：干燥后的切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ和95％的乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min进行脱蜡后，置于流水中清洗数分钟，使切片上的蜡清洗干净。(8)染色：将切片放入苏木素中染色5min，拿出后置于流动的清水中进行清洗。之后放入1％的盐酸中几秒后拿出，与清水中冲洗。置于氨水中约1min后，取出放入清水中清洗，最后置于伊红溶液中2-3min进行染色后放入清水中冲洗约15min。(9)脱水、透明和封片：染色后的切片依次经过70％(几秒)、80％(1min)、95％Ⅰ、95％Ⅱ、100％Ⅰ和100％Ⅱ各5min溶液中进行脱水。再经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min进行透明后，滴一滴树脂封片，晾干后即可观察切片。

1.6统计学分析

实验结果均以X±S.D来表示，所有的实验数据均采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，p<0.05表示具有统计学差异，p<0.01表示差异性极显著。

2实验结果

2.1实验期间大鼠的基本健康情况

实验期间，每组大鼠的摄食和饮水均正常；大鼠的毛色光亮，其粪便的颜色和量也正常，精祌状态活泼健康。有时会出现无搏斗现象，从而导致实验期间有个别老鼠死亡。

2.2各组大鼠体重与脏器比值分析

在整个大鼠喂养的8周时间内，各组实验大鼠在实验期间的体重均有明显增长的趋势。

表2不同实验组大鼠喂养期间体重的影响(g)

与模型组相比：*：P<0.05，差异显著；**：P<0.01，差异极显著。

由表2和图1可以看出，在给予4周的高脂饲料和同时在第四周给予一周的药物治疗后，模型组大鼠体重均显著高于其它药物组(P<0.01)。经过5周的相关药物治疗后，正常组、阳性血脂康组、BZ高、中、低剂量和BZW高、中、低剂量各组大鼠的体重均显著低于模型组大鼠(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明，各药物组均具有一定的对抗高血脂大鼠体重异常增长的趋势。

由表3和图2、3、4、5可知，各个实验组大鼠的肾脏、脾脏和心脏系数在统计学上无差异(p>0.05)，说明药物干预在此期间并未有显著性差异。然而，在给予5周的药物治疗后，正常组、阳性血脂康组、BZ高中低剂量组以及BZW高剂量组的肝脏系数明显低于模型组，在统计学上表现为极显著的差异性(P<0.01)，BZW中剂量组的肝脏系数与模型组相比也表现出了显著性差异(P<0.05)，而BZW低剂量药物组的肝脏系数与模型组之间则差别不大，在统计学上无显著性差异。

表3不同实验组大鼠的心、肝、脾、肾体重比值

与模型组相比：*：P<0.05，差异显著；**：P<0.01，差异极显著。

2.3不同药物组对高血脂大鼠血脂水平的影响

表4各实验组大鼠血脂水平

与模型组相比：*：P<0.05，差异显著；**：P<0.01，差异极显著。

(1)总胆固醇(TC)

由表4和图6可知，高脂模型组TC含量极显著的高于正常对照组(P<0.01)，阳性药物组TC水平显著的低于模型组(p<0.01)，但高于正常对照组。BZ高中低剂量和BZW高中低剂量组的TC含量均极显著的低于高脂模型组(P<0.01)，且BZ高中低剂量和BZW高中剂量组TC含量均低于阳性药物组，说明其对TC水平的降低作用优于阳性药物组。而且，各药物的高剂量组降低高血脂大鼠血清中TC含量的作用要优于中剂量组，更优于低剂量组。以上结果表明，各药物组即BZ、BZW均有明显降低高血脂大鼠血清中总胆固醇含量的作用，且具有剂量依赖效应。

(2)总甘油三酯(TG)

由表4和图8可知，高脂模型组TG含量极显著的高于正常对照组(P<0.01)，阳性药物组TG水平则极显著的低于模型组(P<0.01)，其含量与正常对照组相当。BZ高中低剂量和BZW高中低剂量组的TG含量均极显著的低于高脂模型组(P<0.01)。而且，各药物的高剂量组降低高血脂大鼠血清中TG含量的作用要优于中剂量组，更优于低剂量组。以上结果表明，各药物组即BZ、BZW均有明显降低高血脂大鼠血清中总甘油三酯含量的作用，且具有剂量依赖效应。

(3)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)

由表4和图8可知，高脂模型组HDL-C含量极显著的低于正常对照组(P<0.01)，阳性药物组HDL-C水平则极显著的高于模型组(P<0.01)。BZ高中低剂量和BZW高中剂量组的HDL-C含量均极显著的高于高脂模型组(P<0.01)，而BZW低剂量组的HDL-C水平与模型组相比仅表现出显著性差异(P<0.05)。BZ高剂量组的HDL-C水平高于阳性药物组。而且，各药物的高剂量组增加高血脂大鼠血清中HDL-C含量的作用要优于中剂量组，更优于低剂量组。以上结果表明，各药物组即BZ、BZW均有明显增加高血脂大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇含量的作用，且具有剂量依赖效应。

(4)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)

由表4和图9可知，高脂模型组LDL-C含量极显著的高于正常对照组(P<0.01),其含量为正常组的2倍多。阳性药物组LDL-C水平则极显著的低于模型组(P<0.01)。BZ高中低剂量和BZW高中低剂量组的LDL-C含量均极显著的低于高脂模型组(P<0.01)，BZ高中剂量组和BZW低剂量组的LDL-C水平要低于阳性药物组。而且，各药物的高剂量组降低高血脂大鼠血清中LDL-C含量的作用要优于中剂量组，更优于低剂量组。以上结果表明，各药物组即BZ、BZW均有明显降低高血脂大鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇含量的作用，且具有剂量依赖效应。

2.4肝脏的组织病理学观察

对各组大鼠离体肝脏组织外观的影响：对将刚解剖出来的各组大鼠肝脏进行肉眼观察，发现正常组大鼠的肝脏呈现鲜亮的红色，整体上看无肝脏肿胀的现象，而且表面光滑并富有组织弹性，质地比较柔软，边缘比较锐利整齐；模型组大鼠的肝脏包膜较紧张，呈现出类似猪油的微白色，表面比较粗糙，边缘较厚钝，质地相对于正常组大鼠肝脏来说较硬，接触其切面时手指有油腻感，且较正常大鼠的肝脏肥大，以上表明自制高脂饲料有导致大鼠脂肪肝形成的趋势；阳性组、BZ高剂量组大鼠肝脏的外观形态基本接近正常组；BZ中低剂量组和BZW高中剂量组肝脏的异常形态均得到了不同程度的改善。BZ中剂量组大鼠肝脏的颜色由微白逐渐变红，BZ低剂量组和BZW高中剂量组大鼠的肝脏质地由硬变软，且表面的包膜由紧张逐渐变疏松，而BZW低剂量组的大鼠的肝脏仍存在比较严重程度的肿胀，其改善效果最差。

肝脏病理切片观察发现：如图10所示，正常组大鼠肝小叶的结构完整，肝静脉窦清晰可见，肝细胞排列较整齐，中央静脉周围的肝细胞呈放射状排列，细胞质丰富并且比较均匀，无脂肪滴液泡细胞出现；模型组大鼠肝脏的中央静脉的周围分布着大量的大小不一的脂肪空泡细胞，并且肝细胞肿大并呈现气球样变性，还有一定程度局部肝细胞的坏死，同时肝细胞核被脂滴排挤而偏向一侧，中央静脉也呈现异常扩大，有发展成为非酒精性的脂肪肝的趋势；与模型组相比较，阳性药物组的空泡细胞显著减少，但肝组织有稍微的水样病变。BZ高剂量组大鼠肝脏中基本上无空泡细胞，肝细胞肿大与气球样变性也基本恢复正常，而且无坏死的肝细胞，中央静脉缩小并且胞浆质丰富，细胞核排列在肝细胞中央；BZ中低级剂量组和BZW高中剂量组的肝细胞变化主要表现在脂肪细胞与肿胀细胞显著减少，其胞浆质含量也非常的丰富，肝细胞的结构也基本趋于正常，然而较BZW低剂量组大鼠的肝脏组织中仍有大量的肿胀细胞和脂肪细胞存在。

3结论

本研究通过饲喂高脂饲料同时灌喂脂肪乳的方法建立大鼠高血脂模型，结果表明模型组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均显著地高于正常对照组，同时模型组大鼠血清中HDL-C含量也显著地低于正常对照组，说明降血脂模型建立成功。对白刺种子提取物(BZ)、提取物石油醚萃取剩下的水部位(BZWH)的降血脂活性进行研究从而筛选出一个更为有效的降血脂作用药物，结果发现各个药物的高中低剂量组均能比较显著的降低高血脂大鼠血清中的TC、TC和LDL-C，同时提高HDL-C的作用，说明其均有降低高血脂大鼠血脂的作用。同时，各个药物组均能抵抗高血脂大鼠体重异常增长的趋势。对肝脏组织进行病理学切片观察结果也表明不同的药物组均有不同程度的改善肝脏组织和细胞形态的作用。而且，其降血脂作用与药物剂量呈现一定的剂量依赖系关系。

Claims (10)

1.一种白刺种子提取物，其特征在于：它是由如下方法制备得到的：

取白刺种子，以50％～75％V/V乙醇水溶液为溶剂提取，所得乙醇提取物即为白刺种子提取物。

2.根据权利要求1所述的白刺种子提取物，其特征在于：所述乙醇水溶液的浓度为70％～75％V/V，优选为75％V/V。

3.根据权利要求1或2所述的白刺种子提取物，其特征在于：提取温度为50～80℃，进一步为60～70℃，优选为65℃。

4.根据权利要求1所述的白刺种子提取物，其特征在于：在乙醇水溶液提取前，将白刺种子进行粉碎。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的白刺种子提取物，其特征在于：所述白刺为蒺藜科Zygophyllaceae白刺属植物唐古特白刺Nitraria Tangutorum Bobr。

6.一种白刺种子提取物的制备方法，其特征在于：它包括如下操作方式：

取白刺种子，以50％～75％V/V乙醇水溶液为溶剂提取，所得乙醇提取物即为白刺种子提取物。

7.权利要求1～5任意一项所述白刺种子提取物在制备改善血脂异常的药物或保健品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述药物或保健品是降低血清TC、TG和LDL-C，提高HDL-C的药物或保健品。

9.权利要求1～5任意一项所述白刺种子提取物在制备预防或治疗脂肪肝的药物或保健品中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝；进一步地，所述脂肪肝为单纯性脂肪肝。