CN108495660B - 电子束辐射的骨诱导骨植入物 - Google Patents

Abstract

提供了一种制备电子束辐射的骨诱导植入物的方法。所述方法包括：将含有脱矿质骨基质(DBM)纤维的骨诱导植入物暴露于剂量为从约10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射一段时间。所述电子束辐射减少了所述骨诱导植入物中的微生物，并且所述电子束辐射的骨诱导植入物保留了骨诱导性质。还公开了植入方法和辐射的骨诱导植入物。

Description

电子束辐射的骨诱导骨植入物

背景技术

据估计，每年在美国进行超过50万例骨移植手术，费用超过25亿美元。这些数据预计到2020年将翻一番。此外，美国生物性骨材市场已经变得非常拥挤并竞争激烈。医院在依旧要求高性能产品的同时，在定价方面面临着巨大的压力。在进入拉丁美洲、中国、中东等新兴市场时，定价也是一个重大的障碍。

天然骨和骨替代物都已用作移植材料。天然骨可以是自体移植物或同种异体移植物。骨替代物包括天然或例如胶原、硅酮、丙烯酸树脂、磷酸钙、硫酸钙等合成材料。骨移植物至少有三种方式可以帮助修复缺损。第一种是骨生成，通过在被称为骨祖细胞的骨形成细胞的存在下，在移植物内形成新骨。第二种是骨诱导，该过程为移植物中包含的分子(例如，骨形态发生蛋白和其它生长因子)将祖细胞转变为骨形成细胞。第三种是骨传导，这是一种物理效应，通过该物理效应，通常含有移植材料的基质作为支架，在该支架上受体中的骨和细胞能够形成。支架促进用于骨再生的骨细胞的迁移、增殖和分化。

脱矿质骨基质(DBM)已经显示出具有诱导和/或进行骨形成的能力。因此，希望在需要骨生长的部位植入和维持脱矿质骨基质。用于植入的基于骨纤维的脱矿质骨基质在机械性质上表现出提升，包括内聚性、纤维长度、纤维直径或宽度、纤维纵横比或多个变量的组合。

DBM脱矿质骨纤维(DBF)是一种含有人类DBM纤维的高性能、无载体、低水分的骨移植物，并且无菌处理以保持骨诱导潜力。无菌处理需要对供体进行广泛的预筛选、严格的环境控制，并且仍旧可能无法满足每个市场的所有要求。

所有辐射均源自电离辐射，电离辐射可来自放射源或高加速电子。以医疗放射治疗或工程为目的，最常见的辐射形式涉及能量高达千电子伏特(KeV)和兆电子伏特(MeV)的光子以及能量在4到15MeV范围内的电子。在X射线管中，阴极通过热离子发射产生电子并充当电子源，这些电子在强电场中加速后撞击到带正电的阳极上。电子的动能转换为X辐射，然后在减速时转变为轫致辐射。阳极由具有大轫致辐射横截面和产生轫致辐射的高概率的高原子序数材料组成，其中撞击阳极的电子的约99％的动能转化为了热能。

带电粒子在与物质相互作用时产生电磁辐射，该物质作为对发射元素具有特定能量的特征线光谱发射，并且具有连续光谱的轫致辐射。源于它们的大elm(电荷除以质量)比率(该比率远大于其他如质子、氘核或更重离子的带电粒子的elm比率)，电子显著地产生更多的轫致辐射。对于商业用途而言，加速器的特定特性是其电子能量和平均束功率。工业电子加速器通常根据其能量范围进行分类，其分为为低(80至300keV)、中(300keV至5MeV)、和高(高于5MeV)。

电子束处理或电子束辐射(EBI)是一个涉及使用通常具有高能量的电子在各种温度和氮气氛下处理物体以用于各种目的的过程。EBI还用于处理具有高能电子束加速器的产品，该加速器利用具有类似于阴极射线电视的通用设计的开关技术。电子能量通常在keV至MeV范围内，具体取决于所需的穿透深度。典型的电子束处理装置的基本部件有电子枪、剂量室、磁体、发射器、栅极、阳极和偏转线圈。电子枪用于产生和加速主光束，而磁光学聚焦透镜和偏转线圈用于控制电子束撞击移植物的通道。阴极发射器是热发射电子源，电子被加速并通过由栅极和阳极建立的静电场几何塑造为准直光束。然后电子束通过能量等于施加到阴极的负高压值的地平面阳极中的出口孔从枪部件射出。这种由直接高压产生高能电子束的使用，可以将输入的交流电在高于95％的效率下转换为束功率，这使得电子束材料处理成为一种高能效技术。离开枪后，束通过一个电磁聚焦透镜和磁偏转线圈系统。聚焦透镜用于在移植物上产生聚焦或散焦的束斑，而偏转线圈用于将束斑定位在静止位置或提供某种形式的振荡运动。

EBI技术已经在工程和制造业中使用，主要用于产品改进。第一个改进是基于聚合物的产品的交联，以改善其机械性质、热性质、化学性质。第二个目的是降解，通常用于材料的回收。第三个目的是医疗和药品的灭菌。

对于微生物灭菌，EBI能够破坏生物体(如细菌)的DNA链，导致微生物死亡并使其栖息的空间无菌。EBI已被用于医疗产品的灭菌、食品无菌包装材料的开发以及消毒剂。EBI的杀菌作用也可用于生物材料，如骨移植物。关于灭菌，EBI与目前使用的其它灭菌方法相比具有显着的优势。该过程快速、可靠、且与大多数材料兼容、以及该过程之后不需要任何隔离期。对于一些对氧化效应敏感的材料和产品，其对EBI的辐射耐受水平可能略高于对γ射线暴露。这是由于其较高的剂量率和较短的EBI暴露时间，这已被证明可降低氧的降解效应。

作为病原体消毒的一种方法，EBI可以取代过时且环境不友好的方法，如熏蒸和化学浸渍。先前已经提到电子束对脱矿质骨产品的骨诱导潜力具有不利影响，因为它通过破坏DNA链破坏微生物并且还部分破坏其它生物成分，例如天然形成的蛋白质(胶原、生长因子等)。

发明内容

提供了一种制备电子束辐射的骨诱导植入物的方法。所述方法包括：将含有脱矿质骨基质(DBM)纤维的骨诱导植入物暴露于剂量为约10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射一段时间，以减少所述骨诱导植入物中的微生物并获得所述电子束辐射的骨诱导植入物，其中所述电子束辐射的骨诱导植入物保留了骨诱导性质。

提供了一种处理骨腔的方法。所述方法包括：将骨诱导植入物植入所述骨腔中，所述骨诱导植入物用剂量为约10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射进行辐射一段时间以减少所述骨诱导植入物中的微生物，所述骨诱导植入物含有脱矿质骨基质(DBM)纤维并且不含载体。

在一些实施例中，提供了骨诱导植入物。所述骨诱导植入物包含不含载体的脱矿质骨基质(DBM)纤维。用剂量为约10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射来辐射所述骨诱导植入物一段时间以减少所述骨诱导植入物中的微生物。

各种实施例的其它特征和优点中的一部分将在下面的说明书中阐述，并且它们中的部分通过说明书将会显而易见，或者可以通过对各种实施例的实践来学习。通过说明书和所附权利要求书中特别指出的元素和组合物的方式，可实现和获得各种实施例的目标和其它优点。

附图说明

在某种程度上，参考以下说明书、所附权利要求书和附图，实施例的其它方面、特征、益处和优点将是显而易见的，其中：

图1描绘了电子束辐射对大鼠骨植入物的骨诱导性的影响。

图2A和2B描绘了辐射的无菌样品的间隔图。汇总的标准差用于计算间隔。95％的置信区间(CI)用于平均值。

图2C和2D描绘了电子束辐射和γ射线辐射对大鼠骨植入物的骨诱导性的影响。

图3描绘了具有增加了表面积的矿化纤维。该纤维是使用任何合适的设备(例如筒式研磨机)从骨干上研磨而得。将纤维研磨成包括具有磨损部分和/或钩状部分的卷曲形状，以便于纤维的机械互锁。

图4描绘了包含经碾磨和冻干的脱矿质骨纤维粘附物的骨材料。纤维的冻干改变了纤维的卷曲，以促进纤维的机械互锁。冻干纤维在不使用粘合剂或载体的情况下形成粘附物。

图5描绘了圆柱形状的骨材料。在研磨骨纤维之后，将纤维脱矿质并随后放入模具或冲头中并冻干以形成含有水合通道的圆柱形的粘附物。粘附物可以通过诸如血液、水或盐水的液体水合。

图6描绘了圆盘形状的骨材料。与图7中的粘附物相似，粘附物是在脱矿质后，将纤维放入模具中，然后冻干而形成的。或者，可以将粘附物冲压或打压成所需形状，然后冻干或者脱矿质后冻干，然后冲压或打压成所需形状。粘附物呈圆盘形状并包含促进水合的储存器。

图7描绘了栓塞形状的骨材料。

图8描绘了立方体形状的骨材料。

图9描绘了含有水合通道以便于水合的圆柱形状的骨材料。

图10描绘了圆柱形状的骨材料。该骨材料包括内部水合通道以促进水合。

图11描绘了圆柱形状的骨材料。该骨材料包括外部水合通道和内部水合通道的组合，以促进粘附物的水合。

应当理解的是，附图不是按比例绘制的。此外，图中对象之间的关系可能不是按比例的，并且实际上其大小可能具有相反的关系。附图旨在使所示每个对象的结构易于理解和保证清晰，因此，为了说明结构的特定特征，可能放大了某些特征。

具体实施方式

出于促进对本公开的原理进行理解的目的，现在将参考某些实施例，并且将使用特定语言来描述这些实施例。然而，应当理解的是，并非旨在限制本公开的范围，本公开所涉及领域技术人员通常会想到所示装置中的此类替换和进一步改进，以及如本文所述的本公开的原理的此类进一步应用。

出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、材料的百分比或比例、反应条件、和其他数值的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”所修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数都是近似值，其可能根据本申请试图得到的所需性质而变化。至少但并不作为尝试将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报道的有效数字的位数并通过应用普通的取整技术进行解释。

尽管提出本公开的宽范围的数值范围和参数是近似值，但数值表示尽可能精确。然而，任何数值都固有地包含必要的必然误差，是由其各自的测试试验中发现的标准差所导致的。此外，本文公开的所有范围应理解为包括其中包含的任何和所有子范围。例如，“1到10”的范围包括最小值1和最大值10之间(并含端点)的任何和所有子范围，即，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值的任何和所有子范围，例如5.5至10。

另外，除非另有限定或在上下文中显而易见，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义具有相同的含义。

除非明确说明或从上下文中显而易见，否则以下术语是短语，其定义如下：

定义

应当注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非明确且毫无疑义地限于一个指代物。因此，例如，提及“同种异体移植物”时包括一个、两个、三个或更多个同种异体移植物。

术语“可生物降解的”包括载体和/或植入物的全部或部分将可通过酶的作用、水解作用和/或人体中的其它类似机制随时间降解。在各种实施例中，“可生物降解的”包括在治疗剂已经或正在释放之后或之时，载体和/或植入物可在体内分解或降解成无毒组分。“可生物蚀解的”是指载体和/或植入物将随着时间的推移而腐蚀或降解，至少部分是由于与周围组织中发现的物质、流体接触或通过细胞作用。

术语“哺乳动物”是指来自分类学“哺乳动物”类的生物，包括但不限于人类、其它灵长类动物如黑猩猩、猿、猩猩和猴子、大鼠、小鼠、猫、狗、牛、马等。

“治疗有效量”或“有效量”是这样的量，以至于当被施用时，药物(例如，生长因子)导致生物活性的改变，例如，举例来说，促进骨、软骨和/或其它组织(例如，血管组织)生长、抑制炎症、减轻或缓和疼痛、通过抑制免疫应答改善病症等。给予患者的剂量可以是单剂量或多剂量，取决于多种因素，其包括药物的给药药物动力学特性、给药途径、患者病症和特征(性别、年龄、体重、健康状况、尺寸等)、症状程度、同时发生的治疗、治疗频率和期望效果。在一些实施例中，植入物被设计为立即释放。在其他实施例中，植入物被设计为持续释放。在其他实施例中，植入物包括一个或多个立即释放表面以及一个或多个持续释放表面。

当与疾病或病症一起使用时，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指执行可能包括骨修复过程的方案，其中将骨植入物和/或一种或多种药物施用于患者(人、其它正常或不正常或其它哺乳动物)，以努力减轻疾病或病症或免疫应答的迹象或症状或填充骨腔。缓解可发生在出现疾病或病症的迹象或症状之前，也可以是出现之后。因此，治疗(treating)或治疗(treatment)包括疾病或非期望病症的预防(preventing)或预防(prevention)。此外，治疗(treating)、治疗(treatment)、预防(preventing)或预防(prevention)不要求迹象或症状的完全缓解，不要求治愈，并且特别的包括对患者仅具有微小作用的方案。

如本文所用，术语“骨”是指自体、同种异体、异种或转基因来源的皮质、松质或皮质-松质骨。

术语“同种异体移植物”是指从与受体相同物种但具有不同基因组成的供体获得的组织移植物，是一种两个人之间的组织移植物。

术语“自体的”是指同从一个体的身体衍生或转移，例如自体骨髓移植。

如本文所用，术语“骨传导性”是指非骨诱导性物质用作骨可生长的合适的模板或物质的能力。

如本文所用，术语“骨诱导性”是指能够从具有刺激新骨形成潜力的宿主募集细胞的性质。任何可以诱导动物软组织中异位骨形成的材料都被认为是骨诱导性的。

术语“骨诱导”是指能刺激多能间充质干细胞(MSC)增殖和分化的能力。在软骨内骨形成过程中，干细胞分化为成软骨细胞和软骨细胞，产生软骨细胞外基质(ECM)，随后钙化并重塑为板层骨。在膜内骨形成过程中，干细胞直接分化为成骨细胞，成骨细胞通过直接机制形成骨。骨诱导可以被成骨生长因子刺激，尽管一些ECM蛋白也可以驱使祖细胞驱向成骨表型。

术语“骨传导”是指刺激移植物材料内血管细胞和成骨细胞的附着、迁移和分布的能力。影响移植物骨传导活性的物理特性包括孔隙度、孔径和三维结构。此外，基质蛋白和细胞表面受体之间的直接生物化学相互作用在宿主对移植物材料的反应中起主要作用。

术语“成骨性”是指移植材料独立地产生骨的能力。为了具有直接的成骨活性，移植物必须含有直接诱导骨形成的细胞成分。例如，接种有活化的MSC的同种异体移植物将具有直接诱导骨形成的潜力，而不会募集和活化宿主MSC群。由于许多骨传导同种异体移植物还具有结合和传递生物活性分子的能力，因此它们的骨诱导潜力将会被大大增强。

如本文所用，术语“骨植入物”是指根据本公开的实施例制备的任何骨衍生植入物，因此，旨在包括诸如骨移植物的表达。

术语“骨诱导性评分”是指根据Edwards等人的或等效的校准测试方法测定的从0至4的评分。《人体脱矿质骨的骨诱导：大鼠模型中的表征(Osteoinduction of HumanDemineralized Bone:Characterization in a Rat Model)》Edwards《临床骨科及相关研究(Clinical Orthopaedics&Rel.Res.)》357:219-228，1998年12月。在Edwards等人的方法中，得分“0”表示没有新的骨形成；得分“1”代表1％至25％的植入物参与新骨形成；“2”代表26至50％的植入物参与新骨形成；“3”代表51％至75％的植入物参与新骨形成；并且“4”代表大于75％的植入物参与新骨形成。在大多数情况下，在植入后28天之后评估得分。然而，骨诱导性评分可以在较早的时间点获得，例如植入后7、14或21天之后。在这些情况下，可能需要包括正常DBM对照组，例如不含载体的DBM粉末，并且如果可能，也需要包括阳性对照组，例如BMP。偶尔也可以在较晚的时间点例如植入后40、60或甚至100天之后对骨诱导性进行评分。“骨诱导性百分比”是指在给定时间点的骨诱导性评分，表示为指定参考评分的活性百分比。可以在无胸腺大鼠或人体中评估骨诱导性。通常，如本文所讨论的，骨诱导评分的评估是基于无胸腺大鼠中的骨诱导性。即使电子束辐射后，本申请的骨诱导植入物仍保留骨诱导效力。与不使用电子束辐射的无菌处理相比，电子束辐射后的骨诱导性有约1％至约20％的略微降低。

如本文所用，术语“不含载体”是指本公开的骨诱导植入物不置于载体(例如甘油)中。因此，骨诱导植入物超过95％至99.9％至100％不含载体，包括但不仅限于的载体如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚(α-羟基酸)、聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA或PLG)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PG)、聚(α-羟基酸)的聚乙二醇(PEG)缀合物、聚原酸酯、聚阿司匹林、聚磷酸肌酸、胶原、淀粉、预凝胶化淀粉、透明质酸、壳聚糖、明胶、藻酸酯、白蛋白、血纤蛋白、维生素E类似物例如α-生育酚醋酸酯、d-α生育酚琥珀酸酯、D,L-丙交酯或L-丙交酯、己内酯、葡聚糖、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、PVA-g-PLGA、PEGT-PBT共聚物(多活性的)、甲基丙烯酸酯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、PEO-PPO-PEO(普朗尼克)、PEO-PPO-PAA共聚物、PLGA-PEO-PLGA、PEG-PLG、PLA-PLGA、泊洛沙姆407、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物、SAIB(蔗糖醋酸异丁酸酯)、甘油或其组合。这是在电子束灭菌之前或期间。在一些实施例中，在电子束灭菌之后，骨诱导植入物可以在植入之前水合成油灰状物或糊状物。

如本文所用，术语“消毒”是指将骨纤维暴露于加速电子消毒束下，即电子束(电子束)。包括电子束的粒子束可以包括定向轰击，也就是仅从一个方向轰击，并且可以包括单侧辐射或多侧辐射。

如本文所用，术语“生物负荷”是指生活在未经灭菌的表面上的细菌数量。如本文所用，“生物负荷减少”是指植入物表面上微生物减少。在一些实施例中，当植入物经受电子束辐射时，生物负荷按CFU降低量可以从约1-log减少至约10-log。在一些实施例中，使植入物经受电子束辐射的log减少量是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-log减少量。

如本文所用，术语“无菌保证水平”或“SAL”是指单个单元在经受灭菌后未灭菌的可能性。在一些实施例中，SAL为约10^-6、约10^-5、约10^-4、约10^-3、约10^-2或约10^-1。

由于是DBM纤维，植入物可具有芯吸特性。如本文所用，术语“芯吸”或“芯吸特征”是指移植物能够在狭窄空间中吸收或抽出液体而无需通过毛细管作用的辅助。由于脱矿质骨纤维的表面特征和/或脱矿质骨纤维的排列或构造，使其可能发生芯吸。在一些实施例中，当植入物的水分含量降低时，芯吸能力增加。芯吸材料可包括脱矿质骨纤维。其它的芯吸材料可以是合成的和/或天然的。在一些实施例中，芯吸材料可以形成为编织材料，包括编织物、非织造基质、轴向对齐或以其它任何合适的方式。

如本文所用，术语“水分含量”是指在辐射之前或之后植入物中存在的流体的量或百分比。在一些实施例中，植入物包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％的水分含量。

术语“患者”是指可以施用治疗的生物系统。生物系统可包括例如单个细胞、一组细胞(例如，细胞培养物)、器官或组织。另外，术语“患者”可以指动物，包括但不限于人。

如本文所用，术语“脱矿质”是指通过从组织(例如骨组织)中移除矿物材料而产生的任何材料。在某些实施例中，本文所述的脱矿质组合物包括含有少于5％、4％、3％、2％或1％重量钙的制剂。部分脱矿质骨(例如，按重量计含有大于5％的钙但含有少于原始钙开始量100％的制剂)也被认为在本公开的范围内。在一些实施例中，部分脱矿质骨是含有高于原始钙起始量5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的制剂。在一些实施例中，脱矿质骨含有低于其原始矿物质含量的95％。在一些实施例中，脱矿质骨含有小于其原始矿物质含量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。脱矿质旨在包含诸如“基本上脱矿质的”、“部分脱矿质的”和“完全脱矿质的”这样的表达。在一些实施例中，骨的部分或全部表面是可以脱矿质的。例如，同种异体移植物的部分或全部表面可以脱矿质至深度为约100至约5000微米、或约150微米至约1000微米。在一些实施例中，同种异体移植物的部分或全部表面可以脱矿质至深度约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950至约5000微米。如果需要，可以用抗酸涂层遮蔽椎间植入物的外表面或以其它方式处理以选择性地使椎间植入物的外表面的未遮蔽部分脱矿质，使得表面脱矿质在植入物上处于离散位置。

如本文所用，术语“脱矿质骨基质”是指通过从骨组织中除去矿物质而产生的任何材料。在一些实施例中，本文使用的DBM组合物包括含有少于5％、4％、3％、2％或1％重量钙的制剂。

如本文所用，术语“表面脱矿质”是指骨衍生元素具有至少其原始无机矿物质含量的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的重量百分比。如本文所用，表述“部分脱矿质”是指骨衍生元素具有其原始无机矿物质含量的从约8至约90的重量百分比。在一些实施例中，部分脱矿质是指骨衍生元素具有原始无机矿物质含量的约8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88至约90的重量百分比。如本文所用，表述“完全脱矿质”是指含有小于其原始矿物环境8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的骨。

如本文所用，术语“粉碎的骨”、“粉末状骨”或“骨粉”是指从相对细的粉末到粗颗粒甚至更大的碎片具有宽范围平均粒度的骨颗粒。

同种异体移植物可包含骨纤维。纤维包括骨元素，其平均长度与平均厚度比或纤维的纵横比为从约50:1到约1000:1。从整体外观看，纤维骨元素可描述为细长骨纤维、线、窄条、或薄片。通常，在生产薄板的情况下，它们的边缘倾向于向彼此卷曲。纤维状骨元素在外观上可以是基本上线性的或者它们可以盘绕成类似弹簧的形状。在一些实施例中，细长骨纤维具有不规则形状，包括例如线性、蛇形或弯曲形状。细长骨纤维是完美脱矿质的，然而，当特定实施例需要时，可以保留一些原始矿物质含量。湿润时，纤维松散，因为它们是多孔的，当它们干燥时，它们变得更加缠结并在纤维互连时形成粘附物。在一些实施例中，即使当纤维是湿的时，它们仍然是粘性的。

如本文所用，“非纤维状”是指平均宽度基本上小于纤维状骨元素的平均厚度或纵横比小于从约50:1至约1000:1的元素。例如，同种异体移植骨纤维将具有纤维形状，而非纤维材料将不具有纤维形状，但是具有诸如三角形棱柱、球形、立方体、圆柱形、正方形、三角形、颗粒状、粉末、以及其他规则或不规则的形状。

如本文所用，“压制的骨纤维”是指通过向骨原料施加压力而形成的骨纤维。用作起始材料或原料的骨的尺寸范围可以从相对小的骨块到可以用于识别其解剖学起源的如此尺寸骨。骨可以是基本上完全脱矿质的、表面脱矿质的、部分脱矿质的或非脱矿质的。通常，整个骨原料的片或部分的范围可为在中值长度方面从约1至约400mm、从约5至约100mm，在中值厚度方面从约0.5至约20mm、或从约2至约10mm，在中值宽度方面从约1至约20mm、或从约2至约10mm。通过压制形成的骨纤维使得骨纤维整体上的长度比其它方法产生的保留更多的天然胶原结构的细长骨纤维长。骨纤维可以通过筒式磨机制备。

如本文所用，“高孔隙率”是指具有有助于细胞向内生长的孔结构，以及促进细胞粘附、增殖和分化的能力。

如本文所用，“可再吸收的”是指当置于哺乳动物体内时表现出化学可溶解的材料。

如本文所用，“生物活性剂”或“生物活性化合物”是指改变、抑制、激活或以其它方式影响生物或化学事件的化合物或实体。例如，生物活性剂可包括但不限于：成骨的或成软骨的蛋白质或肽、抗艾滋病物质、抗癌物质、抗生素、免疫抑制剂、抗病毒物质、酶抑制剂、激素、神经毒素、阿片类药物、催眠药、抗组胺剂、润滑剂、镇静剂、抗惊厥药、肌肉松弛剂和抗帕金森物质、抗痉挛药和肌肉收缩剂，包括通道阻滞剂、缩瞳剂和抗胆碱剂、抗青光眼化合物、抗寄生虫和/或抗原生动物化合物、细胞与ECM相互作用的调节剂，包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子、血管舒张剂、DNA、RNA或蛋白质合成的抑制剂、抗高血压剂、镇痛剂、退热剂、甾体和非甾体类抗炎药、抗血管生成因子、血管生成因子、抗分泌因子、抗凝剂和/或抗血栓形成剂、局部麻醉剂、眼药、前列腺素、抗抑郁药、抗精神病药物、止吐药和显像剂。在某些实施例中，生物活性剂是药物。在一些实施例中，生物活性剂是生长因子、细胞因子、ECM分子或其片段或衍生物，例如譬如RGD的细胞附着序列。

如本文所用，“粘附物”是指多个骨纤维，在一些实施例中，通过纤维的机械互锁特性彼此结合。粘附物可以具有各种形状和尺寸，并且可植入外科手术部位。粘附物包括至少两个卷曲或部分卷曲的骨纤维，它们彼此缠结以在不使用粘合剂或载体的情况下保持连接。在一些实施例中，湿润时，纤维松弛，因为它们是多孔的，当它们干燥时，它们变得更加缠结并在纤维互连时形成粘附物。

如本文所用，术语“氧甾醇”意指包括一种或多种形式的氧化胆固醇。如WO2013169399A1中所述，本文所述的氧甾醇单独地或共同地活化患者的骨生长。

氧甾醇可以是药用盐。潜在的药用盐的一些实例包括那些不会显着增加化合物毒性的可形成盐的酸和碱，例如碱金属(如镁、钾和铵)盐，无机酸(如盐酸、氢碘酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)盐，以及有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、古洛糖酸、琥珀酸、芳基磺酸，如对甲苯磺酸等)盐。

氧甾醇的药用盐包括由药用的无毒碱或酸制备的盐，包括无机或有机碱、无机或有机酸以及脂肪酸。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、亚锰、钾、钠、锌等。衍生自药用有机无毒碱的盐包括伯、仲和叔胺的盐、包括天然取代胺在内的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、丁三醇胺等。当本申请的化合物是碱性时，盐可以由药用无毒酸制备，包括无机酸和有机酸。这些酸包括醋酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等。也可以使用脂肪酸盐，例如含有大于2个碳、大于8个碳或大于16个碳的脂肪酸盐，譬如丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸等。

在一些实施例中，为了降低氧固醇的溶解度以帮助获得控制释放库效果，将氧甾醇用作游离碱或用于具有相对较低溶解度的盐中。例如，本申请可以使用不溶性盐，譬如脂肪酸盐。代表性的脂肪酸盐包括油酸、亚油酸盐或含有8至20个碳溶解度之间的脂肪酸盐，譬如棕榈酸酯或硬脂酸酯。

氧固醇可以是“成骨的”，其可以增强或加速新骨组织的向内生长。

现在将详细参考本公开的某些实施例。本公开旨在覆盖可以被所附权利要求书限定的本公开内容包括在内的所有替换、修改和等价物。

下面的标题并不意味着以任何方式限制本公开；任一标题下的实施例可以结合任何其它标题下的实施例使用。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本文教导的精神或范围的情况下，可以对本文描述的各种实施例进行各种修改和改变。因此，各种实施例旨在覆盖本教导的范围内的各种实施例的其它修改和改变。

电子束辐射

提供了一种制备电子束辐射的骨诱导植入物的方法。该方法包括将含有脱矿质骨基质(DBM)纤维的骨诱导植入物暴露于剂量为约10千戈瑞(kGy)至100千戈瑞的电子束辐射一段时间，以减少骨诱导植入物中的微生物并获得电子束辐射的骨诱导植入物，其中电子束辐射的骨诱导植入物保留了骨诱导性质。

植入物不含载体，并且在一些实施例中不含甘油。如本文所用，术语“不含载体”是指本公开的植入物不是施用、保留或置于载体中。载体包括但不限于固体或液体形态的聚合物载体。在一些实施例中，植入物不是没有载体，并且在植入物已经通过电子束辐射进行辐射之后被添加入载体，如下所述。

在一些实施例中，在将DBM纤维暴露于电子束辐射之前，植入物的DBM纤维被冻干或干燥。在一些实施例中，在将DBM纤维暴露于电子束辐射之后，植入物的DBM纤维被冻干或干燥。

在一些实施例中，植入物在经电子束辐射后水合以形成可模塑或可延展的油灰状物或糊状物，如下所述。

在一些实施例中，植入物暴露于电子束辐射照，其剂量为从约10千戈瑞(kGy)至约100、从约10千戈瑞至约90千戈瑞、从约10千戈瑞至约80千戈瑞、从约10千戈瑞至约70千戈瑞、从约10千戈瑞至约60千戈瑞、从约10千戈瑞至约50千戈瑞、从约10千戈瑞至约40千戈瑞、从约10千戈瑞至约30千戈瑞、从约10千戈瑞至约20千戈瑞、从约15至约100千戈瑞、从约15千戈瑞至约90千戈瑞、从约15千戈瑞至约80千戈瑞、从约15千戈瑞至约70千戈瑞、从约15千戈瑞至约60千戈瑞、从约15千戈瑞至约50千戈瑞、从约15千戈瑞至约40千戈瑞、从约15千戈瑞至约30千戈瑞、从约15千戈瑞至约20千戈瑞、从约20千戈瑞至约100千戈瑞、从约20千戈瑞至约90千戈瑞、从约20千戈瑞至约80千戈瑞、从约20千戈瑞至约70千戈瑞、从约20千戈瑞至约60千戈瑞、从约20千戈瑞至约50千戈瑞、从约20千戈瑞至约40千戈瑞从约20千戈瑞至约30千戈瑞、和/或从约20千戈瑞至约25千戈瑞。

在一些实施例中，植入物暴露于剂量为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和/或100千戈瑞的电子束辐射。

在一些实施例中，植入物暴露于单剂量或多剂量的电子束辐射。在一些实施例中，植入物暴露于多个相同或不同剂量的电子束辐射。在一些实施例中，植入物暴露于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量的电子束辐射。在一些实施例中，剂量是均匀的或者是非均匀剂量。在一些实施例中，电子束辐射会辐射植入物的全部或仅一部分。

在约15℃至约27℃、约18℃至约24℃、约19℃至约23℃、或约20℃至约21℃的温度下，将植入物暴露于电子束辐射。在一些实施例中，在约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或约27℃的温度下，将植入物暴露于电子束辐射。

将植入物暴露于电子束辐射的一段时间为从约1分钟至约60分钟、从约1分钟至约45分钟、从约1分钟至约30分钟、从约1分钟至约15分钟、从约1分钟至约10分钟、从约1分钟至约5分钟、从约1分钟至约4分钟、从约1分钟至约3分钟、或从约1分钟至约2分钟。在一些实施例中，植入物暴露于电子束辐射一段时间，约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60分钟。

将植入物暴露于能量范围为从约80至约300keV、从300keV至约5MeV或高于5MeV的电子束辐射。

在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射将微生物降低至约10^-6的无菌保证水平(SAL)。在一些实施例中，SAL为约10^-6、约10^-5、约10^-4、约10^-3、约10^-2或约10^-1。

在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使微生物减少1-log至10-log的减少量、1-log至9-log的减少量、1-log至8-log的减少量、1-log至7-log的减少量、1-log至6-log的减少量、1-log至5-log的减少量、1-log至4-log的减少量、1-log至3-log的减少量或1-log至2-log的减少量。在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使微生物减少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-log的减少量。

在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使植入物灭菌，使得植入物为从约90至约99.9％无菌。在一些实施例中，植入物是约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9％无菌的。

在一些实施例中，微生物包括但不限于病毒、细菌、热原、朊病毒、微生物和/或病原体。在一些实施例中，可以被处理的一些细菌包括但不限于以下：葡萄球菌属；链球菌属，包括化脓链球菌；肠球菌属；芽孢杆菌属，包括炭疽芽孢杆菌和乳酸杆菌；李斯特菌属；白喉棒状杆菌属；加德纳氏菌属，包括阴道加德纳氏菌；诺卡式菌属；链霉菌属；普通高温放线菌；密螺旋体；弯曲杆菌属；假单胞菌属，包括铜绿假单胞菌；军团菌属；奈瑟球菌属，包括淋病奈瑟球菌和脑膜炎奈瑟球菌；黄杆菌属，包括脑膜脓毒性黄杆菌和气味黄杆菌；布鲁氏菌属；博德特氏菌属，包括百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌；埃希氏菌属，包括大肠埃希氏菌；克雷伯氏菌属；肠杆菌属；沙雷氏菌属，包括粘质沙雷氏菌和液化沙雷氏菌；爱德华氏菌属；变形杆菌属，包括奇异变形菌和普通变形菌；链杆菌属；立克次氏体科，包括立氏立克次体；衣原体，包括鹦鹉热衣原体和砂眼衣原体；分枝杆菌属，包括结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌，偶发分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鼠麻风分枝杆菌；和诺卡氏菌属；以及其膜中含有脂质的任何其它细菌。

在一些实施例中，辐射植入物的电子束可以除去感染因子，包括病毒、细菌、分枝杆菌、支原体、真菌、朊病毒和/或其成分。在各种实施例中，本申请的方法适用于去除披膜病毒科，特别是甲病毒属的病毒，例如丙型肝炎病毒，并用于防止它们在组织移植期间的传播；用于对抗小核糖核酸病毒科，特别是肠病毒属的病毒，更特别是脊髓灰质炎沙宾病毒，并防止它们在组织移植期间传播；用于对抗疱疹病毒科的病毒并防止它们在组织移植期间传播；用于对抗逆转录病毒科的病毒，特别是慢病毒属的病毒，更特别是人类HIV免疫缺陷病毒，并防止它们在组织移植期间传播。

在一些实施例中，辐射植入物的电子束使病毒灭活，尤其是包膜或脂质包覆的病毒、和蛋白质产物中无包膜的、蛋白质包覆的病毒，而不会引起显著的变性。在各种实施例中，辐射植入物的电子束使病毒和病毒状颗粒灭活。

在一些实施例中，病毒感染性生物可通过辐射植入物的电子束灭活，包括但不限于以下属的含脂质病毒：甲病毒属(甲病毒)、风疹病毒属(风疹病毒)、黄病毒属(黄病毒)、瘟病毒属(粘膜病病毒)、(未命名，丙型肝炎病毒)、冠状病毒属(冠状病毒)、环曲病毒属(环曲病毒)、动脉炎病毒属(动脉炎病毒)、副粘液病毒属(副粘液病毒)、德国麻疹病毒属(德国麻疹病毒)、麻疹病毒属(麻疹病毒)、肺病毒亚科(肺病毒)、肺病毒属(肺病毒)、水疱型病毒属(水疱型病毒)、狂犬病病毒属(狂犬病病毒)、短暂热病毒属(短暂热病毒)、质型弹状病毒属(植物弹状病毒A组)、核型弹状病毒属(植物弹状病毒B组)、线状病毒属(丝状病毒)、甲型、乙型流感病毒属(甲型和乙型流感病毒)、丙型流感病毒属(丙型流感病毒)、(未命名，类托高土病毒)、布尼亚病毒属(布尼亚病毒)、白蛉病毒属(白蛉病毒)、内罗毕病毒属(内罗毕病毒)、汉坦病毒属(汉坦病毒)、番茄斑萎病毒属(番茄斑萎病毒)、沙砾病毒属(沙粒病毒)、未命名的哺乳动物B型逆转录病毒，未命名的哺乳动物和爬行动物C型逆转录病毒、未命名的D型逆转录病毒、慢病毒属(慢病毒)、泡沫病毒属(泡沫病毒)、正肝去氧核糖病毒属(哺乳动物的嗜肝DNA病毒)、禽肝病毒属(鸟类的嗜肝DNA病毒)、单纯疱疹病毒属(单纯疱疹病毒)、水痘病毒属(水痘病毒)、β疱疹病毒亚科(巨细胞病毒)、巨细胞病毒属(巨细胞病毒)、鼠巨细胞病毒属(小鼠巨细胞病毒)、玫瑰疹病毒属(人疱疹病毒6)、疱疹病毒丙亚科(淋巴细胞相关疱疹病毒)、淋巴细胞病毒属(类EB病毒)、猴病毒属(类松鼠猴-蛛猴疱疹病毒)、正痘病毒属(正痘病毒)、副痘病毒属(副痘病毒)、禽痘病毒属(禽痘病毒)、痘病毒属(类绵羊痘病毒)、黏液瘤病毒属(黏液瘤病毒)、猪痘病毒属(猪痘病毒)、软疣痘病毒属(传染性软疣痘病毒)、亚塔痘病毒属(亚巴痘和塔纳痘病毒)、未命名的非洲猪瘟样病毒、虹彩病毒属(小虹彩病毒)、蛙病毒属(前虹膜病毒)、淋巴细胞病毒属(鱼类淋巴囊肿病毒)、披膜病毒属、黄病毒属、冠状病毒属、Enabdoviridae、纤丝病毒属、副黏液病毒属、正黏液病毒属、布尼亚病毒属、沙粒病毒属、逆转录病毒属、嗜肝DNA病毒属、疱疹病毒属、痘病毒属和任何其它含脂质的病毒。

在各种实施例中，这些病毒包括以下人和动物病原体：罗斯河病毒、发热病毒、登革热病毒、墨累谷脑炎病毒、蜱传脑炎病毒(包括欧洲和远东蜱传脑炎病毒)、人类冠状病毒229-E和OC43等(引起感冒、上呼吸道感染，可能是肺炎和可能是胃肠炎)、人副流感病毒1和3、腮腺炎病毒、人副流感病毒2、4a和4b、麻疹病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒、沙粒病毒：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)病毒、拉沙病毒、人类免疫缺陷病毒1和2、或任何其它免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、亚科：人类疱疹病毒1和2、疱疹病毒B、爱泼斯坦-巴尔病毒)、(天花)病毒、牛痘病毒、传染性软疣病毒。

所有含有脂质的，尤其是在其质膜中含有脂质的原生动物都包括在本申请的范围内。在一些实施例中，可以通过辐射植入物的电子束灭活的原生动物，包括但不限于以下含脂质的原生动物：布氏锥虫、冈比亚锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、利什曼原虫、利什曼原虫、蓝氏贾第虫、贾第鞭毛虫；阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、哈氏内阿米巴、耐格里属种、棘阿米巴种、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、弓形虫、小隐孢子虫、鼠隐孢子虫、贝氏等孢子球虫、卡耶坦环孢子虫、肠袋虫属种、牛巴贝虫、果氏巴贝虫、分歧巴贝虫、脑炎微孢子虫、匹里虫属种、眼微孢子虫、角膜条微孢子虫、肠有膈微孢子虫、肠微孢虫、脆双核阿米巴、芽囊虫属、肉孢子虫属、卡氏肺囊虫、非洲微孢虫、锡兰微孢虫、堆型艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、柔嫩艾美尔球虫和新孢子虫。应当理解的是，本申请不限于上面列表中提供的原生动物。

在一些实施例中，辐射植入物的电子束可以处理包括球孢子虫的原生动物，其包括等孢子虫物种、隐孢子虫物种、环孢子虫物种、弓形虫物种、肉孢子虫物种、新孢子虫物种和艾美尔球虫物种。这些球孢子虫寄生虫会引起肠道疾病、淋巴结病、脑炎、心肌炎和肺炎。

术语“原生动物感染”或“传染病”是指由原生动物感染性生物引起的疾病。这些疾病包括但不限于：非洲昏睡病、恰加斯病、利什曼病、贾第虫病、毛滴虫病、阿米巴病、原发性阿米巴脑炎、肉芽肿性阿米巴脑炎、疟疾、弓形虫病、隐孢子虫病、等孢子虫病、环孢子虫病、肠袋虫病、巴贝虫病、小孢子菌病、脆双核阿米巴感染、人芽囊原虫感染、肉孢子虫病、肺炎和球虫病。在一些实施例中，用本申请的方法处理的原生动物感染是球虫病，其是由等孢子虫物种、隐孢子虫物种、环孢子虫物种、弓形虫物种、肉孢子虫物种、新孢子虫物种和艾美尔球虫物种引起的。这些球孢子虫寄生虫会引起肠道疾病、淋巴结病、脑炎、心肌炎和肺炎。这些球虫寄生虫也会引起动物疾病，包括牛、狗、猫和鸟类。特别是禽类、鸡、火鸡和鹌鹑受到球虫病的影响，特别是艾美尔球虫，如堆型艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫和柔嫩艾美尔球虫。

在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射减少了植入物的骨诱导性评分。在一些实施例中，植入物的骨诱导性评分从4降低至3。在一些实施例中，植入物的骨诱导性评分为4保持相同，然而，骨诱导性的百分比略微降低。

在一些实施例中，电子束辐射的骨诱导植入物保留其骨诱导性质。在各种实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使辐射的骨诱导植入物的骨诱导性质仅降低多最多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％。在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使辐射的骨诱导植入物的骨诱导性质仅降低0至最多2％、0至最多3％、0至最多4％、0至最多5％、0至最多6％、0至最多7％、0至最多8％、0至最多9％、0至最多10％、0至最多11％、0至最多12％、0至最多13％、0至最多14％、0至最多15％、0至最多16％、0至最多17％、0至最多18％、0至最多19％或0至最多20％。

提供了一种处理骨腔的方法。该方法包括：将骨诱导植入物植入骨腔中，骨诱导植入物用约10千戈瑞至100千戈瑞的剂量的电子束辐射进行辐射一段时间以减少骨诱导植入物中的微生物，该骨诱导植入物含有脱矿质骨基质(DBM)纤维并且不含载体。

在一些实施例中，植入物不含甘油。在各种实施例中，该方法进一步包括在植入之前用液体水合骨诱导植入物。在一些实施例中，在水合后，骨诱导植入物形成油灰状物或糊状物。在一些实施例中，该方法进一步包括在水合之后但在植入之前将骨诱导植入物模制成某一形状。

在一些实施例中，将含有脱矿质骨基质纤维的植入物暴露于电子束辐射将微生物降低至约10^-6的无菌保证水平(SAL)。在一些实施例中，SAL为约10^-6、约10^-5、约10^-4、约10^-3、约10^-2或约10^-1。

在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使微生物减少1-log至10-log的减少量、1-log至9-log的减少量、1-log至8-log的减少量、1-log至7-log的减少量、1-log至6-log的减少量、1-log至5-log的减少量、1-log至4-log的减少量、1-log至3-log的减少量或1-log至2-log的减少量。在一些实施例中，将植入物暴露于电子束辐射使微生物减少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-log的减少量。

在一些实施例中，在植入物被电子束辐射之前，将其处置/放置入容器中。然后植入物在容器中被辐射。在一些实施例中，容器应该是气密的(不透气的)和液密的，并且能够承受宽的温度范围，使得容器在辐射或储存期间不会被损坏。在一些实施例中，容器包括箔、包裹物、不透明小袋、透明小袋或玻璃容器。容器壁可由合适的材料形成，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯乙烯醇和铝箔、或多层组合物，例如聚乙烯乙烯醇和聚丙烯组合物。在一些实施例中，容器可具有各种厚度和尺寸。在一些实施例中，容器可以是约1mm厚至约10cm厚。在一些实施例中，容器可为约1mm至约9cm、约1mm至约8cm厚、约1mm至约7cm、约1mm至约6cm、约1mm至约5cm、约1mm至约4cm、约1mm至约3cm、或约1mm至约2cm、或约1mm至约1cm厚。在一些实施例中，植入物在被辐射后放置/处置在容器中。

骨诱导植入物

在一些实施例中，提供了骨诱导植入物。骨诱导植入物包含不含载体的脱矿质骨基质(DBM)纤维。用剂量为从约10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射来辐射骨诱导植入物一段时间以减少骨诱导植入物中的微生物。辐射的骨诱导植入物的骨诱导性质仅降低从约0％至20％。在一些实施例中，辐射的骨诱导植入物的骨诱导性质仅降低从约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至20％。在各种实施例中，在室温下、防潮包装中储存后直至6、12、18、24、32或36个月，测量辐射的骨诱导植入物的骨诱导性质。

在一些实施例中，植入物不是没有载体，并且在植入物已经通过电子束辐射之后被添加入载体。合适的载体包括但不限于液体和/或固体载体。在一些实施例中，载体包含生物聚合物和合成聚合物，例如人皮肤、人发、骨、胶原、脂肪、含有纤维和/或纤维和碎片的薄交联片、聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、藻酸盐片、纤维素片、透明质酸片、以及聚(丙交酯-共-乙交酯)的共聚物共混物PLGA。

在一些实施例中，载体还可包括其它生物相容的和可生物再吸收的物质。载体可包括，例如，天然聚合物譬如蛋白质和多肽、糖胺聚糖、蛋白多糖、弹性蛋白、透明质酸、硫酸皮肤素、明胶、或其混合物或复合物。合成聚合物也可以掺入载体中。这些包括例如，可生物降解的合成聚合物譬如聚乳酸、聚乙交酯、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(“PLGA”)、聚己内酯(“PCL”)、聚(二恶烷酮)、聚(三亚甲基碳酸酯)共聚物、聚葡萄糖酸酯、聚(丙烯酸富马酸酯)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)、聚乙二醇、聚己内酯共聚物、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯和任何无规或(多)嵌段共聚物譬如二元共聚物、三元共聚物、四元共聚物等，它们可以从与先前列出的均聚物和共聚物相关的单体聚合而得。

在一些实施例中，可生物蚀解的聚合物可具有从约1,000至约30,000道尔顿(Da)的分子量。在各种实施例中，聚合物可具有从约2,000至约10,000Da的分子量。在一些实施例中，聚合物可具有从约2,000至4,000Da或从约3,000至4,000Da的分子量。在一些实施例中，可生物蚀解的聚合物可具有1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或约30,000Da的分子量。

在一些实施例中，所述植入物在没有载体的情况下提供并且包含DBM纤维，所述DBM纤维以这样的方式处理，即它提供纤维之间的内聚力，而不提供额外的容纳或粘合剂。研磨骨干以产生卷曲的骨纤维，随后将其脱矿质并冷冻干燥。在干燥过程中纤维形状发生改变，这使得相邻纤维之间的物理缠结和表面与表面之间的相互作用。纤维的缠结/相互作用是最终产品的粘结性的原因。因此，本公开提供了一种纤维状骨材料，其尺寸和形状提供了增加的表面积和彼此机械互锁以形成植入物的能力。

在一些实施例中，DBM纤维是人骨纤维并且包含从约1至约70微米、从约125至约250微米、从约10微米至约500微米或从约250至约500微米的长度。在一些实施例中，DBM纤维包含具有长度约为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498和/或500微米。在一些实施例中，纤维的长度为从约100微米至约2mm。在一些实施例中，骨纤维的长度为从约0.5cm至约10cm、约1cm至约8cm、约3cm至约5cm、约0.5mm至约50mm、约1.0mm至约25mm、或约5mm至约10mm。纤维的直径为约100微米至约2mm。

在一些实施例中，以这样的方式研磨纤维，以便以紧凑的形状和尺寸提供增加的表面积。在一些实施例中，纤维包括卷曲形状，使得卷曲纤维的直径在约50微米和约3mm之间，并且扁平构型的纤维直径为约125微米至约5mm。在一些实施例中，纤维包括卷曲形状，使得卷曲纤维的直径在约100微米至约1mm之间，并且扁平构型的纤维直径为约250微米至约2mm。

在一些实施例中，纤维的直径为从约100μm至约2mm。在一些实施例中，骨纤维的长度为从约0.5mm至约50mm。在一些实施例中，骨纤维的平均长度为从约0.5cm至约10cm。在一些实施例中，纤维的纵横比为从约50:1至约1000:1、从约50:1至约950:1、从约50:1至约750:1、从约50:1至约约500:1、从约50:1至约250:1、从约50:1至约100:1、从约10:1至约50:1、或从约5:1至约10:1。

在一些实施例中，植入物不含甘油。在一些实施例中，在植入物水合之前，植入物包含低于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％水分的低水分含量。

在一些实施例中，植入物在电子束辐射后水合以形成可模塑或可延展的油灰状物或糊状物。一旦水合，将植入物放置在由医师确定的位置处的手术部位中。植入物中的纤维保持其粘结性和机械相互作用，使得在原位放置时油灰状物不需要粘合剂或载体。在一些实施例中，植入物在植入约1％至约60％之前或之后用液体水合。在一些实施例中，植入物用液体水合在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59至约60％情况下。

在一些实施例中，用于使植入物水合的液体包括血液、水、盐水或其组合。在一些实施例中，用于使植入物水合的液体与冻干纤维混合而不需要粘合剂，以形成可模塑的冻干DBM纤维。

在一些实施例中，植入物具有芯吸特征，其被配置为吸收多种流体。在一些实施例中，植入物具有芯吸特征，其被配置为吸收液体以使植入物水合。在一些实施例中，当植入物的水分含量降低时，其芯吸能力增加。芯吸材料可包括DBM纤维。在一些实施例中，其它的芯吸材料可以是合成的和/或天然的。在一些实施例中，芯吸材料可以形成为编织材料，包括编织物、非织造基质、轴向对齐或以其它任何合适的方式。

在一些实施例中，本公开的植入物的DBM组合物允许骨生成、骨诱导和/或骨传导。在一些实施例中，植入物的DBM组合物(例如，骨纤维)由不含粘合剂的骨材料制成。

在一些实施例中，将骨材料(例如，DBM纤维)冻干。在一些实施例中，DBM纤维是被筒式研磨的并且具有带状形状和增加的表面积。在一些实施例中，经研磨和冻干的DBM纤维的粘附物是筒式研磨纤维，其具有带状形状、增加的表面积和卷曲部分。在一些实施例中，研磨和冻干的DBM纤维的粘附物包括自体移植物或同种异体移植物骨。

在一些实施例中，骨材料(例如，DBM纤维)包括皮质骨、松质骨、皮质松质骨或其混合物。在一些实施例中，骨材料是由自体骨、同种异体骨、异种骨或其混合物获得的。在一些实施例中，将包含DBM纤维的植入物冻干并成形。在一些实施例中，植入物的形状是立方体、正方形、三角形、矩形、圆形、圆盘形或圆柱形的。

在一些实施例中，植入物是骨移植材料，其在愈合过程中被再吸收/重塑并被宿主骨替代。在一些实施例中，本文公开的骨材料包括另外的添加剂，例如合成陶瓷和/或可生物蚀解的聚合物，其产生高浓度的钙、磷酸盐和硅离子，它们用于新骨形成的病灶，如本文所讨论的。由于可生物蚀解的聚合物比陶瓷降解地更快，因此越来越多的骨诱导性DBM颗粒被暴露出来。较慢的再吸收陶瓷可以作为干细胞和成骨细胞附着并开始形成新骨的固体表面。

所公开的植入物具有良好的柔韧性并且是抗压缩的。它还具有保留活性的去矿质骨基质的骨诱导性。这些特性使其成为优良的骨移植替代物，使得它在植入体内时不会损坏、破裂或变形。

植入物可以是来自同种异体移植骨的骨基质纤维和非同种异体移植骨材料纤维的组合。非同种异体移植骨材料的纤维包括嵌入或分散在非同种异体移植骨材料的纤维内的非纤维DBM颗粒。来自同种异体移植材料的DBM纤维与非同种异体移植材料纤维的比例范围为从约20:80至约70:30。在一个实施例中，来自同种异体移植材料的纤维与非同种异体移植材料的纤维的比例为从约40:60至约60:40。在一个实施例中，来自同种异体移植材料的DBM纤维与非同种异体移植材料纤维的比例为约50:50。

在一些实施例中，DBM包括非纤维状颗粒。在一些实施例中，颗粒是粉末、微球、海绵、糊状、凝胶和/或粒状。在一个实施例中，颗粒是粉末。

在各种实施例中，纤维的长宽比为从约50:1至约1000:1、从约50:1至约950:1、从约50:1至约750:1、从约50:1至约500:1、从约50:1至约250:1、从约50:1至约100:1、从约10:1至约50:1、或从约5:1至约10:1。在其它实施例中，纤维的长宽比为约4:1、17:1、或23:1。

该组合物具有非常低的免疫原性和良好的相容性。

用于本公开的DBM纤维可以从商购获得或者可以通过已知技术制备。通常，有利的骨诱导性DBM材料可以通过皮质和/或松质骨纤维的脱钙来制备，通常通过酸提取。纤维可被研磨，例如筒式研磨。酸提取过程可以被引导以使胶原、非胶原蛋白和生长因子一起留在固体纤维中。制备生物活性脱矿质骨的方法，作为举例，在美国专利第5,073,373、5,484,601和5,284,655号中有描述。DBM产品也可商购，包括例如来自RegenerationTechnologies,Inc.(佛罗里达州阿拉楚阿)、The American Red Cross(弗吉尼亚州阿灵顿县)等来源。仅具有骨传导性的骨纤维可以使用类似的技术制备，所述技术已被修改或补充以去除或灭活(例如通过交联或以其它方式变性)骨基质中负责骨诱导性的组分。本公开中使用的骨诱导性和/或骨传导性DBM材料可以源自人类供体组织，特别是关于旨在用于人类受试者的植入装置。

关于植入物的纤维含量，基于干重计时骨纤维材料可占组合物的约5％至约100％，按重量计约20％至约80％或约25％至约75％。

在一些实施例中，骨纤维的平均长度与平均厚度比或纤维的纵横比为从约50:1至约1000:1。在整体外观上，骨纤维可以是条带、线、窄条和/或薄片的形式。细长的骨纤维在外观上可以是基本线性的或者它们可以盘绕成类似弹簧的形状。在一些实施例中，骨纤维含有线性部分和盘绕部分。在一些实施例中，骨纤维具有不规则形状，包括例如线性、蛇形或弯曲形状。在一些实施例中，纤维可在边缘处卷曲以具有基本上半圆形的横截面。在一些实施例中，纤维可以是完全或部分螺旋形、环绕的或螺旋形的形状。细长的骨纤维可以是脱矿质的，但是当特定实施例需要时，可以保留一些原始矿物质含量。骨移植纤维还可包含矿化骨材料。

骨纤维伸长并卷曲以增加条带的表面积。卷曲的纤维可含有沿边缘的磨损部分以促进与其它骨纤维的相互作用。在一些实施例中，将卷曲的纤维研磨成沿着纤维边缘具有钩状的部分，所述钩状部分被配置为与其它纤维接合。例如，在图3和图4中展示出了这种磨损的和钩状的部分。钩状部分可以与其它纤维的其它钩状部分、磨损部分、拉直部分或卷曲部分接合。纤维的钩状和磨损部分以及卷曲形状提供了纤维之间的缠结，使得纤维形成粘附物而不需要载体或粘合剂。例如，图3示展出了由筒式研磨生产的骨纤维74。图4展示出了在脱矿质和通过酒精浸泡除去污染物之后的脱矿质骨的粘附物，该湿纤维在干燥后松弛并进一步缠结。

骨纤维的尺寸和形状可以以多种方式形成，例如，通过筒式研磨。一个合适的筒式研磨的这样的例子是骨生物研磨机，正如受让人为Warsaw Orthopedic,Inc的美国专利公布第2012/0160945号中所述。然而，可以设想的是，骨纤维可使用虎钳、切割器、辊子、旋转锉刀或往复式叶片研磨机交替地被研磨。

非骨材料添加剂

在一些实施例中，在形成包含DBM纤维的植入物之后，可以在植入之前向其中添加活性剂。在一些实施例中，植入物包含含有氧甾醇的活性剂。

氧甾醇是由胆固醇的氧化衍生物组成的分子类。氧甾醇被参与到许多生物过程，并且已发现其具有成骨特性。例如，一种天然存在的氧甾醇，20(S)-羟基胆固醇具有成骨和抗脂肪形成的性质。这种氧甾醇可用于愈合骨折、长骨融合手术、脊柱融合手术、椎体间脊柱融合手术、后外侧脊柱融合手术、颈椎椎间盘切除术和融合手术、牙科手术、和颅/颌面手术。

氧甾醇还在各种生理过程中起作用，例如细胞分化、炎症、细胞凋亡、和类固醇产生。氧甾醇是胆固醇氧化的产物，并且在体内通过包括成骨细胞在内的多种细胞类型形成(Schroepfer《生理概述(Phyep Rev)》80:361-554，2000年；Bjorkhem和Dicsfalusy《动脉硬化、血栓和血管生物学(Arterioscler Thromb Vase Biol)》22:734-742，2002年)。某些氧甾醇，如20(S)-羟基胆固醇、以及22(S)-或22(R)-羟基胆固醇，在多能间充质细胞如M2-10B4(M2)骨髓基质细胞和C3H10T1/2胚胎成纤维细胞中诱导成骨分化(Kha等人《骨矿物研究杂志(J Bone Miner Res)》19:830-840，2004年)。氧甾醇可通过激活刺猬信号通路诱导成骨和抑制间充质干细胞的脂肪形成分化，而刺猬信号通路又反过来分别调节控制成骨和脂肪形成分化的主开关，即Runx2和PPARγ(Richardson等人《细胞生物化学杂志(J CellBiochem)》100:1131-1145，2007年；Dwyer等人《生物化学杂志(J Biol Chem)》282:8959-8968，2007年；Kim等人《骨矿物研究杂志(J Bone Miner Res)》22:1711-1719，2007年)。一些氧甾醇还提供治疗骨缺陷或诸如骨质疏松症的疾病的治疗用途。

在一些实施例中，植入物包含用于诱导局部骨形成和治疗骨缺陷的氧甾醇。氧甾醇保留在植入物中并随时间释放，而植入物允许骨细胞流入以便长骨并填充缺损。在一些实施例中，此类应用是基于这些氧甾醇化合物诱导刺猬信号通路的能力。在一些实施例中，植入物使间充质干细胞显示出成骨细胞分化标志物的诱导表达。本文所述的植入物可用于多种治疗用途，包括但不限于诱导局部骨形成和治疗骨缺损。在一些实施例中，当植入物接触人或动物细胞时，含有本文所述的氧甾醇的植入物诱导生物反应。在一些实施例中，细胞可以是间充质干细胞或骨髓基质细胞。在一些实施例中，生物反应包括刺激成骨细胞分化、抑制脂肪细胞分化、或刺激软骨形成。在一些实施例中，植入物被配置为用于释放氧甾醇的植入物以在手术部位或骨缺损部位处或附近诱导生物反应。

氧甾醇可用于诱导全身骨形成以治疗骨缺陷，例如骨质疏松症，诱导局部骨形成以治疗诸如骨不连的骨折、或其它骨疾病，例如牙科应用/植入物中的颌骨缺陷，以及诱导脊柱融合。在一些实施例中，植入物可仅包括氧甾醇或与一种或多种骨形态发生蛋白或成骨剂组合。在一些实施例中，植入物中存在多于一种氧甾醇。在一些实施例中，植入物包括Oxy133。

在一些实施例中，植入物包括有助于骨生成的氧甾醇。在一些实施例中，植入物或基质包括Oxy34、Oxy49和/或Oxy133。在一些实施例中，植入物包括含有以下结构的氧甾醇：

或其药用盐、水合物或溶剂化物，其中R1包含具有至少一个碳原子的脂族或环状取代基。

在一些实施例中，R包括烷基、杂烷基、烷烃基、杂烷烃基、烯基、杂烯基、炔基、杂烷烃基、烷基二基、杂烷基二基、亚烃基、杂亚烃基、芳基、芳基二基、亚芳基、芳基芳基、联芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基二基、杂亚芳基、杂芳基-杂芳基、杂双芳基、杂芳基烷基或其组合。在一些实施例中，R取代基包含(C1-C20)烷基或杂烷基、(C₂-C₂₀)芳基或杂芳基、(C₆-C₂₆)芳烷基或杂烷基和(C₅-C₂₀)芳基烷基或杂芳基-杂烷基、(C₄-C₁₀)烷基二基或杂烷基二基或(C₄-C₁₀)亚烃基或杂亚烃基。R取代基可以是环状或非环状、支链或非支链、取代或未取代的、芳族、饱和或不饱和链的或其组合。在一些实施例中，R取代基是脂族基团。在一些实施例中，R取代基是环状基团。在一些实施例中，R取代基是己基。

在一些实施例中，本公开可包括包含具有在体外促进成骨分化能力的成骨性氧甾醇(例如，Oxy133)的植入物。Oxy133是一种特别有效的成骨剂。在各个应用中，Oxy133在治疗得益于骨形成的局部刺激的病症中有用，例如脊柱融合、骨折修复、骨再生/组织应用、牙齿植入物的颌骨骨密度的增加、骨质疏松症等。Oxy133的一个特别优点是与其它成骨性氧甾醇相比，它提供了更容易的合成方法和改善的融合时间。Oxy133是一种小分子，可作为骨生长的合成代谢治疗剂，以及治疗各种其它病症的有用药剂。

在一些实施例中，植入物包括Oxy133，具有分子式：

或其药用盐、溶剂化物或水合物。Oxy133可以用作包含Oxy133或其药用盐、溶剂化物或水合物的生物活性剂或药物组合物。Oxy133的IUPAC名称为(3S,5S,6S,8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-((S)-2-羟基辛烷-2-基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[a]菲-3,6-二醇。

在一些实施例中，Oxy133的剂量为从约10pg/天至约80g/天。在一些实施例中，Oxy133的剂量为从约1.0g/天、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5至约60.0克/天。Oxy133的其它剂量包括从约2.4ng/天至约50mg/天、约50ng/天至约2.5mg/天、约250ng/天至约250mcg/天、约250ng/天至约50mcg/天、约250ng/天至约25mcg/天、约250ng/天至约1mcg/天、约300ng/天至约750ng/天或约0.50mcg/天至500ng/天。在各种实施例中，剂量可为约0.01至约10mcg/天或约1ng/天至约120mcg/天。在一些实施例中，Oxy133的剂量更大。例如，在一些实施例中，Oxy133的剂量为从0.01mg/天至5g/天。

植入物可包含在其整个范围中或离散区域中均匀分布的氧甾醇(例如，Oxy133)。在一些实施例中，氧甾醇在整个植入物中均匀或不均匀分布。氧甾醇可以置入植入物中，并且可以组成植入物总重量的从约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5至约60％w/v、w/w和/或v/v。

在一些实施例中，氧甾醇可以置入到植入物中并且组成其从约5wt％至约80wt％或从约5wt％至约90wt％的重量百分比。在一些实施例中，高浓度的氧甾醇可以置入到植入物中并且组成植入物的从约20wt％至约99wt％的重量百分比。在一些实施例中，氧甾醇可以以植入物的从约50wt％至约90wt％的量置入到植入物中。在一些实施例中，氧甾醇可以以约20wt％至约30wt％、约30wt％至约40wt％、约40wt％至约50wt％、约50wt％至约60wt％、约60wt％至约70wt％、约70wt％至约80wt％、约80wt％至约90wt％或约90wt％至约99wt％的量置入到植入物中。在一些实施例中，氧甾醇可以以植入物的约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95至约99wt％的量置入到植入物中。

氧甾醇可以置入植入物中，并且可以组成植入物的从约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5至约60mg/cc。在一些实施例中，氧甾醇可以约400mg/cc的量置入到植入物中。在一些实施例中，氧甾醇可以以植入物的约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490至约500mg/cc的量置入到植入物中。

除化合物Oxy133外，本公开的其它实施例包括在Oxy133中存在的任何立体中心的任何和所有单独的立体异构体，包括该化合物的非对映异构体、外消旋物、对映异构体和其它异构体。在本公开的实施例中，Oxy133可包括化合物的所有多晶型物、溶剂化物或水合物，例如水合物和与有机溶剂形成的那些化合物。

制备盐的能力取决于化合物的酸度或碱度。合适的化合物盐包括但不限于：化合物的酸加成盐，例如用盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、碳酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、环己烷氨磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸制成的盐；用糖精制成的盐；碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；和与有机或无机配体形成的盐，例如季铵盐。另外的合适的盐包括但不限于：醋酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙二醇阿散酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐，扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(扑酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘和戊酸盐。

在各种实施例中，Oxy133包括一种或多种生物学功能。也就是说，当与间充质干细胞或骨髓基质细胞接触时，Oxy133可以诱导生物反应。例如，Oxy133可刺激成骨细胞分化。在一些实施例中，包含Oxy133的生物活性组合物在施用于哺乳动物细胞，例如体外细胞或人或动物细胞时，可包括一种或多种生物学功能。例如，这种生物活性组合物可刺激成骨细胞分化。在一些实施例中，这种生物学功能可以来自刺猬通路的刺激。

在一些实施例中，可以将多种生物活性成分中的一种添加到植入物中。这些活性成分可能或可能不与组合物的骨修复能力相关。合适的活性成分有：止血剂、骨形态发生蛋白(BMP)、基因、生长分化因子(GDF)或其他非胶原蛋白如TGF-β、PDGF、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、细胞因子等。

在一个实施例中，植入物可包括至少一种BMP，其是一类被认为在内源性骨组织上具有骨诱导或生长促进活性、或起到前胶原前体的作用的蛋白质。已知的BMP类元素包括但不限于BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、BMP-16、BMP-17、BMP-18以及其多核苷酸或多肽、以及相同编码的成熟多肽或多核苷酸。

用作骨诱导剂的BMP包含下列中的一种或多种：BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、BMP-16、BMP-17或BMP-18、以及这些BMP中的一种或多种的任何组合，包括全长BMP或其片段，或其组合，或者类似多肽或多核苷酸编码的所有所述BMP的多肽片段。分离的BMP骨诱导剂可以作为多核苷酸、多肽、全长蛋白质或其组合施用。

在另一个实施例中，颗粒可包括一种或多种放置在隔室中或放置在粘附物上或其中的生长分化因子(“GDF”)。已知的GDF包括但不限于：GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-7、GDF-10、GDF-11和GDF-15。例如，可用作分离的骨诱导剂的GDF包括但不限于以下GDF：GDF-1多核苷酸或对应于基因银行编录号为M62302、AAA58501和AAB94786的多肽、以及成熟GDF-1多肽或相同编码的多核苷酸。GDF-2多核苷酸或对应于基因银行编录号为BC069643、BC074921、Q9UK05、AAH69643或AAH74921的多肽、以及成熟GDF-2多肽或相同编码的多核苷酸。GDF-3多核苷酸或对应于基因银行编录号为AF263538、BCO30959、AAF91389、AAQ89234或Q9NR23的多肽、以及成熟GDF-3多肽或相同编码的多核苷酸。GDF-7多核苷酸或对应于基因银行编录号为AB158468、AF522369、AAP97720或Q7Z4P5的多肽、以及成熟GDF-7多肽或相同编码的多核苷酸。GDF-10多核苷酸或对应于基因银行编录号为BC028237或AAH28237的多肽、以及成熟GDF-10多肽或相同编码的多核苷酸。

GDF-11多核苷酸或对应于基因银行编录号为AF100907、NP005802或095390的多肽、以及成熟GDF-11多肽或相同编码的多核苷酸。GDF-15多核苷酸或对应于基因银行编录号为BC008962、BC000529、AAH00529或NP004855的多肽、以及成熟GDF-15多肽或相同编码的多核苷酸。

在一些实施例中，植入物含有其它生物活性剂，其可以与本公开的材料一起递送。在某些实施例中，生物活性剂是药物。这些生物活性剂可以包括，例如，抗微生物剂、抗生素、抗分枝杆菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂(antineoplastic agents)、抗肿瘤剂(antitumor agents)、影响免疫反应剂、血钙调节剂、用于葡萄糖调节药剂、抗凝血剂、抗血栓形成剂、抗高血脂药、强心药药剂、拟甲状腺素和抗甲状腺药物、肾上腺素能药、抗高血压药、胆碱能药、抗胆碱能药、解痉药、抗溃疡药、骨骼肌和平滑肌松弛剂、前列腺素、变应性反应的一般酶抑制剂、抗组胺剂、局部麻醉剂、镇痛剂、麻醉药拮抗剂、止咳药、镇静催眠药药物、抗惊厥药、抗精神病药、抗焦虑药、抗抑郁药、减食欲药、非甾体类抗炎药、甾体类抗炎药、抗氧化剂、血管活性剂、骨活性剂、成骨因子、抗关节炎药和诊断剂。

适用于本公开使用的生物活性剂和特定药物的更完整列表可以在SusanBudavari等人编辑的《默克指数：化学品、药物和生物制品百科全书(The Merck Index：AnEncyclopedia of Chemicals，Drugs，and Biologicals)》和由美国药典委员会《theUnited States Pharmacopeial Convention,Inc.》(马里兰州罗克维尔)2013出版的《美国药典/国家处方集XXXVII/XXXII(the United States Pharmacopoeia/NationalFormulary XXXVII/XXXII)》中找到。

生物活性剂还可以通过掺入到可植入组合物中来提供。通过简单的混合或其它方式，可以将如本文所述的那些生物活性剂均匀地或区域地掺入植入物材料中。此外，它们可以借助介质如微球或另一种微粒制剂掺入。用于形成微粒的合适技术是本领域公知的，并且可以用于夹带或包封生物活性剂，然后微粒可以在其制备之前或之后分散在骨移植复合物中。

可以理解的是，所用添加剂的量将根据添加剂的类型、所用特定添加剂制剂的具体活性和组合物的预期用途而变化。用户可以容易地确定所需的量。

在制备可植入组合物之前、期间或之后，可将任何各种医学和/或外科手术有用的物质掺入骨材料中或与骨材料相关联。因此，例如当使用骨材料时，可以将一种或多种这样的物质引入骨纤维中，例如，通过将这些骨纤维浸泡或浸入所需物质的溶液或分散液中。

在一些实施例中，植入物骨纤维可以和一种或多种生长因子(例如，BMP、GDF等)、药物冻干，使得它可以以持续释放的方式从植入物中释放。

在一些实施例中，在形成植入物之后，可以在植入之前向其中添加粘合剂。但是，在一些实施例中，植入物的DBM纤维不含粘合剂并且在不使用粘合剂的情况下保持在一起。在形成植入物后可选地可以包括的合适的粘合剂的实例包括但不限于：(i)多羟基化合物，例如，诸如无环多元醇、非还原糖、糖醇等类化合物、糖酸、单糖、二糖、水溶性或水分散性低聚糖、多糖和前述的已知衍生物。具体的多羟基化合物包括1,2-丙二醇、甘油、1,4-丁二醇三羟甲基乙烷、三羟甲基丙烷、赤藓糖醇、季戊四醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、丙二醇、二丙二醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，例如，已知的并且可以以商品名Pluronic和Emkalyx商购的类型；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如，已知的和以商品名Poloxamer商购的类型；烷基酚羟基聚氧乙烯，例如，已知的和可以以商品名Triton商购的类型、聚氧化烯二醇如聚乙二醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、卫矛醇、阿拉伯糖、木糖、核糖、阿东糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽糖醇、乳糖醇、水苏糖、麦芽五糖、环麦草六糖、角叉菜胶、琼脂、葡聚糖、海藻酸、瓜尔豆胶、黄蓍胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、黄原胶、直链淀粉、任何前述物质的混合物。

有用的试剂包括溶剂，如二氯甲烷、三氯乙酸、乙腈；和酸，如三氟乙酸和氟化氢。在一些实施例中，可以添加润滑剂，例如水或聚乙二醇。

在一些实施例中，含有纤维的植入物还可含有其它有益物质，包括例如防腐剂、助溶剂、悬浮剂、粘度增强剂、离子强度和渗透压摩尔浓度调节剂和/或其它赋形剂。也可使用合适的缓冲剂，包括但不限于：碱土金属碳酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、硼酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐等。说明性具体的缓冲剂包括例如磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠和氨基甲酸钠(TRIS)。

在一些实施例中，植入物的骨纤维可以与致孔剂材料混合，该致孔剂材料随后在制备期间被去除以增强干燥的粘附物的孔隙率。合适的致孔剂材料可以由任何生物相容的、可生物降解的物质制成，该物质可以形成颗粒并且至少能够在植入物的制备期间基本上保持其形状，但是当与水溶液或其它液体接触时被去除或降解或溶解。在一些实施例中，致孔剂可以是无机的或有机的，例如，它们可以由明胶、有机聚合物(例如，聚乙烯醇)、聚氨酯、聚原酸酯、PLA、PGA和PLGA共聚物、糖、钙盐、氯化钠、磷酸钙或其混合物而制成。成孔剂颗粒可为约100至约500微米。

在一个实施例中，给定形态的所有致孔剂颗粒可具有至少一个约100至约500微米的平均轴向、横向或侧面维度。在一些实施例中，所用的所有致孔剂颗粒可独立地具有至少一个约100至约500微米的轴向、横向或侧面维度。在一些实施例中，所用的所有致孔剂颗粒可共同地具有至少一个约100至约500微米的平均轴向、横向或侧面维度。在一些实施例中，致孔剂颗粒的至少一个维度可为约100微米或更大、或约120微米或更大、或约140微米或更大。在一些实施例中，致孔剂颗粒的至少一个维度可为约500微米或更小、约425微米或更小、约350微米或更小、约300微米或更小或约250微米或更小。在一些实施例中，致孔剂颗粒的至少一个维度可为约120至约400微米。

在一些实施例中，植入物含有单个或多个浓度的尺寸受控纤维，以影响植入物的稠度并影响水合后植入物的处理。

在一些情况下，纤维可以与植入物中的颗粒混合以影响植入物的稠度并影响水合后植入物的处理。

在一些情况下，可以将多个植入物包装在一起以在水合之前和之后促进植入物的水合和/或处理。

在一些情况下，植入物可在干燥之前用极性或非极性溶液和/或盐溶液水合，以增强植入物的后续再水化。

DBM纤维

本公开还提供了用于使包含纤维的植入物成形的方法，如图3-11中所示。

图3描绘了具有增加了表面积的矿化纤维。该纤维是使用任何合适的设备(例如筒式研磨机)从骨干上研磨而得。将纤维研磨成包括具有磨损部分和/或钩状部分的卷曲形状，以便于纤维的机械互锁。例如，如图3所示，研磨骨材料产生纤维74和与纤维分离的骨颗粒76。可以定制同种异体移植物的形状以适合其所处的位置。例如，它可以是碎屑、塞子、销、钉、圆柱、块、楔、环、片等形状。

在一个实施例中，该方法包括在脱矿质和/或冻干之前将同种异体移植骨纤维置于模具中。然后将纤维脱矿质、灭菌和/或冻干以形成成形的植入物，如图3-11所示。可以将纤维放入模具中，然后进行脱矿质和/或冻干以制成所需的形状，或者可以将纤维脱矿质和/或冻干，然后通过打压或冲压所需的形状来成形。如本文所讨论的，脱矿质和冻干步改变纤维的形状以促进缠结和机械互锁。因此，在一些实施例中，通过在模具腔(未示出)中进行脱矿质和/或冻干，将纤维成形为粘附物。纤维在不使用粘合剂或载体的情况下形成这种粘附物。

在一些实施例中，将纤维置于模具中并成形以根据医疗过程的需要形成在预定形状和尺寸范围的植入物。在一些实施例中，植入物可以通过注射成型、压缩成型、模压、粉浆浇铸、激光切割、水射流加工、砂型铸造、壳模铸造、丢失组织支架铸造、石膏模铸造、真空铸造、永久模铸造、搪塑、压铸、铸造、离心铸造、挤压铸造、轧制、锻造、型锻、挤压、剪切、纺纱或其组合制备。

纤维可以模制成盘形植入物70，其具有贮存器72以促进水合，如图6所示。植入物70可包括均匀的厚度或可变的厚度横穿其表面，以便于包装和/或水合。贮存器72包含植入物70表面上的凹陷区域，以在水合期间留住液体。如图6所示，储存器72包括圆形形状。但是，在其它实施例中，储存器可能包括可变的横截面形状，例如多边形、椭圆形或不规则形状。

纤维可以模制成圆锥形或塞子形状以形成第二植入物50，如图7所示。第二植入物50包括具有第一直径的第一端和具有第二直径的第二端。在一些实施例中，第一直径比第二直径宽。

纤维可以模制成立方体形状以形成第三植入物52，如图8所示。在其它实施例中，植入物可包括其它类似于第三植入物52的棱柱形构造。例如，植入物可以是矩形、金字塔形、三角形、五边形或其它多边形或不规则的棱柱形状。

纤维可以模制成圆柱形以形成第四植入物56，如图9所示。第四植入物56包括具有第一直径的第一端和具有第二直径的第二端。在一些实施例中，第一直径与第二直径相同。

纤维可以模制成圆柱形以形成具有外部水合通道58的植入物56，如图9所示。第四植入物56包括具有第一直径的第一端和具有第二直径的第二端。在一些实施例中，第一直径比第二直径宽或具有相同尺寸。水合通道58存在于第五植入物56的外表面上，并且被配置以便于促进水合液体进入第五植入物56，如本文所述。外部水合通道58包括由钻孔或压制形成的圆形内表面。但是，在其它实施例中，通道58可被开槽并包括直的内表面。纤维是多孔的，并且液体可以穿过粘附物，然而，水合通道58增强了流体的通过。

纤维可以模制成圆柱形以形成具有内部水合通道62的粘附物60，如图10所示。粘附物60包括具有第一直径的第一端和具有第二直径的第二端。在一些实施例中，第一直径比第二直径宽或具有相同尺寸。水合通道62至少延伸穿过粘附物60的一部分，并且被配置以便于促进水合液体进入粘附物60，如本文所讨论的。内部水合通道62包括由钻孔或压制形成的圆形内表面。纤维是多孔的并且液体可以穿过粘附物，然而，水合通道62增强了流体进入植入物的通过。

纤维可以模制成圆锥形或塞形以形成具有外部水合通道66和内部水合通道68的粘附物64，如图11所示。粘附物64包括具有第一直径的第一端和具有第二直径的第二端。在一些实施例中，第一直径比第二直径宽或具有相同尺寸。外部水合通道66存在于粘附物64的外表面上，并且内部水合通道68延伸穿过至少粘附物64的一部分。水合通道66、68被配置以促进水合液体进入粘附物64，如本文所讨论的。水合通道66、68包括由钻孔或压制形成的圆形内表面。

脱矿质

在从供体获得骨并研磨成纤维之后，使用本领域熟知的方法对其进行处理，例如清洁、消毒、脱脂等。然后可以将整个骨去除矿物质，或者如果需要，可以在脱矿质之前将骨切片。然后对整个骨或其一个或多个部分进行脱矿质处理，以将无机物含量降低至低水平，例如，含量低于约重量的10％，优选低于约重量的5％，更优选残留钙低于约重量的1％。

DBM可以以任何合适的方式制备。在一个实施例中，DBM通过从骨中酸提取矿物质来制备。它包括骨的胶原基质以及酸不溶性蛋白质，包括骨形态发生蛋白(BMP)和其它生长因子。它可以被配制成颗粒、凝胶、海绵材料或油灰状物使用，并可以冷冻干燥储存。诸如电子束辐射的灭菌程序被用于保护植入物免于疾病传播并且可以降低DBM中有益生长因子的活性。DBM提供了一个初始的骨传导基质并表现出一定程度的骨诱导潜能，包括诱导骨祖细胞从周围组织的下渗和分化。如上所述，在取自皮质长骨的骨颗粒的实施例中，脱矿质时骨颗粒的骨诱导潜力可能根据骨颗粒的来源而变化，无论是取自骨膜层、中间层还是骨内膜层。

DBM制剂已经在整形外科医学中使用很多年以促进骨的形成。例如，DBM已用于骨折的修复、椎骨的融合、关节置换手术以及治疗由于类风湿性关节炎等潜在疾病引起的骨质破坏。DBM被认为通过骨传导和骨诱导过程促进体内骨形成。植入的DBM组合物的骨诱导效应被认为是由于分离的基于胶原的基质上存在的活性生长因子的存在。这些因子包括TGF-β、IGF和BMP蛋白类的元素。骨诱导因子的具体实例包括TGF-β、IGF-1、IGF-2、BMP-2、BMP-7、甲状旁腺激素(PTH)和血管生成因子。其它骨诱导因子如骨钙蛋白和骨桥蛋白也可能也存在于DBM制剂中。DBM中也可能存在其它未命名的或未被发现的骨诱导因子。

在一个脱矿质过程中，对骨进行酸脱矿质步骤，然后进行脱脂/消毒步骤，其中可形成骨纤维粘附物。将骨浸入酸中以实现脱矿质。可用于该步骤的酸包括无机酸，例如盐酸、以及有机酸，例如甲酸、乙酸、过乙酸、柠檬酸、丙酸等。脱矿质入骨表面的深度可以通过调节处理时间、脱矿质溶液的温度、脱矿质溶液的浓度和处理期间的搅拌强度来控制。因此，在各种实施例中，DBM可以是完全脱矿质的、部分脱矿质的或表面脱矿质的。

用无菌水和/或缓冲溶液冲洗脱矿质的骨以除去残留量的酸，从而提高其pH值。合适的脱脂/消毒溶液是乙醇的水溶液，乙醇是脂质的良好溶剂，水是良好的亲水载体，使溶液能够更深地渗透到骨颗粒中。乙醇水溶液还通过杀死营养微生物和病毒对骨进行消毒。通常，在脱脂消毒溶液中存在至少约10至40％重量的水(即，约60至90重量百分比的脱脂剂，例如醇)，以在给定的时间内产生最佳的脂质去除和消毒。脱脂溶液的合适浓度范围为从约60至约85重量百分比的醇或约70重量百分比的醇。

在一些实施例中，可以进一步处理脱矿质骨以实现骨的性质。例如，可以处理DBM以破坏DBM的胶原结构。这种处理可包括胶原酶处理、热处理、机械处理或其它。对于进一步的处理选择，可参考美国临时专利申请60/944,408、60/944,417和60/957,614。

替代干燥方法

在一些实施例中，骨纤维在常温或升高的温度、真空条件下干燥。在各种实施例中，骨纤维在常压、常温或升高的温度下干燥。

在一些实施例中，将骨纤维在模具中以获得所需形状或不在模具中冻干，其中其在模具中可以成形(例如，打压、冲压、切割等)。例如，含有骨和保存剂的瓶子最初被冷冻至-76℃，随后骨和保存剂经受小于100毫托的真空，同时温度保持在-35℃或低于-35℃。冻干过程的终点是测定的残留水分约为0％至20％。一旦将骨冻干后，在再重新使用之前，将其储存在密封的、真空的瓶子中。

在一些实施例中，脱矿质和冻干步骤可改变纤维的形状以促进缠结和机械互锁。因此，在一些实施例中，通过在模具腔(未示出)中进行脱矿质和/或冻干，将纤维成形为粘附物。纤维在不使用粘合剂或载体的情况下形成这种粘附物。例如，如图4所示，在脱矿质和冻干步骤之后，独立的纤维82形成了粘附物78。在纤维82的冻干期间，磨损/钩状部分80变得越来越彼此缠结以增加纤维的机械互锁。

为了便于现场制备和/或使用本文的组合物，脱矿质的纤维骨组分和非纤维骨组分(优选冻干或冷冻形式)可以在无菌条件下储存在单独的包装或容器中，并且在立即应用于骨缺损部位的使用时，使用任何合适的方法如刮刀、镊子、注射器、捣固装置等使其放入内部的混合物。或者，植入物可以被提前制备好，并在无菌条件下储存直至需要使用。当植入物被提前制备好时，优选在包装用于储存之前将其冻干。在一些实施例中，本文所述的组合物可与自体移植物骨髓抽吸物、自体移植骨、选择的自体移植细胞的制备物、含有在编码被置于缺损部位之前有促进作用的骨的基因的自体移植细胞结合。在各种实施例中，植入物被包装并准备好在合适的容器中使用，所述容器例如可重新密封的无毒瓶、袋网或袋、或作为可在需要时在外科医生的指导下制备的套件被提供。

水合

例如，如图5所示，在脱矿质、冻干和/或电子束辐射之后，植入物被水合以将植入物转变成可模制和可延展的油灰状物。在一些实施例中，植入物用水、盐水和/或血液、骨髓抽吸物、骨髓抽吸物浓缩物或其它血液成分和/或由血液制成的溶液水合。一旦水合，将植入物放置在由医师确定的位置处的手术部位中。植入物中的纤维保持其粘结性和机械相互作用，使得在原位放置时油灰状物不需要粘合剂或载体。

在一些实施例中，植入物可以用PBS或其它生理学上可接受的流体水合，并以水合形式被提供使用。植入物可以直接放置在手术部位并随后水合、或者可以水合形成湿糊状物并随后植入手术部位。

在一些含有水的实施例中，生理学上可接受的液体可以在植入物被放置到部位或缺陷之前，添加到骨修复植入物中。这种生理学上可接受的液体包括上面讨论的那些，包括生理盐水或血液制品。血液制品包括全血和血液成分，如富含血小板的血浆和贫血小板血浆。

在一些实施例中，植入物用生理学上可接受的液体水合。生理学上可接受的液体的非限制性实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、透明质酸、纤维素醚(例如羧甲基纤维素)、胶原、明胶、高压灭菌的骨粉、骨传导性载体、全血、血液成分、骨髓抽吸物、浓缩的骨髓抽吸物、及其混合物。血液成分的非限制性实例包括血清、血浆、富含血小板的血浆、浓缩的富含血小板的血浆、贫血小板血浆和浓缩的贫血小板血浆。在水合之后，骨修复植入物变成油灰状物或糊状物，其可以模制成预定形状或施用于骨缺损并且以促进愈合的方式操纵以符合骨缺损。例如，植入物可以用每2.5g组合的DBM和骨膜粉末约2ml盐水血水合。

处理方法

可以用本公开的植入物处理的说明性的骨修复部位包括例如由损伤、手术过程中引起的缺陷、感染、恶性肿瘤或发育畸形引起的那些。植入物可用于各种整形外科、牙周、神经外科和口腔颌面外科手术中，包括但不限于单纯骨折和有创骨折和骨折不愈合的修复；外部和内部固定；关节融合，如关节融合术；全身关节成形术；髋关节杯成形术；股骨和肱骨头置换术；股骨头表面置换和全关节置换；脊柱修复包括脊柱融合和内固定；肿瘤手术，例如，缺陷锉削；椎间盘切除术；椎板切除术；切除脊髓肿瘤术；前颈椎和胸椎手术；脊柱损伤的修复；脊柱侧凸、脊柱前凸和脊柱后凸治疗；颌间骨折固定术；颏成形术；颞下颌关节置换术；牙槽嵴增强和重建；镶嵌骨植入物；植入物的放置和修正；鼻窦增高术；美容增强等。可以用植入物修复或替换的特定骨骼包括但不限于筛骨；额骨；鼻骨；枕骨；顶骨；颞骨；下颌骨；颌骨；颧骨；颈椎；胸椎；腰椎；骶骨；肋骨；胸骨；锁骨；肩胛骨；肱骨；桡骨；尺骨；腕骨；掌骨；指骨；髂骨；坐骨；耻骨；股骨；胫骨；腓骨；髌骨；跟骨；跗骨和跖骨。

根据本公开的某些方面，本公开的植入物可以用作骨空隙填充物、或者可以结合在承重植入物中、上或周围，例如脊柱植入物、髋植入物(例如，在植入物杆中或周围和/或髋臼杯后面)和膝盖植入物(例如在杆中或杆周围)。在一些实施例中，本发明的植入物可以结合在具有至少约10000N的抗压强度的承载脊柱植入装置中、上或周围，例如融合笼、PEEK植入物、销钉或其它具有用于容纳骨诱导组合物的口袋、腔室或其它腔的可能的装置，并用于脊柱融合术，例如椎体间融合术。一种说明性的这种用途是与承载体间脊柱间隔器结合以实现椎体间融合。在这些应用中，植入物可以放置在间隔物中和/或周围以促进融合。

制备DBM的方法是本领域熟知的，如美国专利第5,314,476、5,507,813、5,073,373和5,405,390号中所描述。制备磷酸钙和/或羟基磷灰石的陶瓷粉末的方法描述于例如美国专利第4,202,055和4,713,076号中。

在一些实施例中，该方法包括通过在无菌条件下剃刮、研磨或压制片或块来获得纤维。可以优化纤维的形状，以通过纤维网络诱导新骨的形成和处理性质。

在另一方面，本公开提供了一种在可植入组织再生支架处加速骨形成的方法。在另一方面，本公开提供了一种在有需要的患者中再生骨的方法，包括用植入物植入患者。

在另一方面，本公开提供了一种利用包含DBM纤维组合的植入物治疗由损伤、疾病、伤口或手术引起的骨缺损的方法。

套件

本申请还提供了用于制备植入物的医疗套件、或用于治疗患者的公开内容，该套件包括至少一个包括如上所述的电子束辐射的医疗植入物的递送系统和在无菌条件下封闭的医疗植入物的包装。此类套件可包括含有组合物的固体成分的干燥材料以及含水介质或其它生物相容性用于与干燥材料组合以形成可延展的润湿材料的润湿液，或者可包括在合适的容器如小瓶(例如最终灭菌的)中配制的湿润可延展植入材料、和/或治疗物质，例如成骨物质如BMP。在一种具体形式中，这种医疗套件可包括干燥材料，例如颗粒或干燥体、冻干形式的BMP(例如rhBMP-2)、和用于重构BMP以制备水性制剂然后可以在制备本发明的植入物的过程中将其添加到干燥的材料中的水性介质。

植入物可能具有功能特征。或者，可以将具有功能特征的其它材料结合到植入物中。功能特征可包括射线不透性、杀菌性、释放材料的来源、粘性等。这些特征可基本上在整个植入物中或仅在植入物的某些位置或部分处被赋予。

合适的不透射线材料包括例如陶瓷、矿化骨、陶瓷/磷酸钙/硫酸钙、金属颗粒、纤维和碘化聚合物。合适的杀菌材料可包括例如痕量金属元素。在一些实施例中，痕量金属元素还可以促进骨生长。

诸如不透射线标记的功能材料可以在粘附物上的一个或多个位置处提供、或者可以基本上在整个植入物中提供。因此，例如，在圆柱形植入物中，可以在圆柱形植入物的尖端处提供不透射线的标记物。这种标记可以便于植入物的放置。不透射线材料可以结合到植入物中以通过植入物递送。此外，可以仅在植入物上的一些位置处提供不透射线的材料，如此那些位置的可视化可提供植入物在体内的取向的指示。

本公开的植入物可单独用作骨移植材料、用作用于修复、增强和替换骨组织的骨组织工程的支架、或用作生长因子的载体或基因的载体。

现在已经一般性地描述了本发明，通过以下参考以下实例可以更容易地理解本发明，这些实施例是以说明的方式提供的，并不意图限制本发明，除非另有说明。

实例

以下关于包含

DBM DBF作为生物活性剂的某些制剂的实例表明，通过电子束辐射进行的灭菌具有某些特别有利的结果。

实例1：辐射后

DBM DBF骨诱导性的28天体内评估

在本研究中，使用来自十(10)批

DBM DBF的二十(20)个成品单元。每批中的一个单元用电子束(25kGy，NuTek公司，加利福尼亚州海沃德)辐射，而第二单元仅进行无菌处理。使用Edwards等人(1998)描述的大鼠骨诱导(OI)测定法测试所有单元的骨诱导性。将每个植入物的四个重复体放置在无胸腺大鼠的肌间部位中28天。该生物测定法具有使用组织病理学评估区分不同水平的活性(骨诱导性)脱矿质骨制剂的能力。为了评估供体到供体的可变性，每个制造批次对应于不同的人体组织供体。使用Minitab17统计软件进行统计学分析。

结果总结在图1中。结果显示，

DBM DBF的电子束辐射使得评估的样品组的骨诱导率平均降低14％(无菌组为2.11±0.76，辐射组为1.82±0.89)。因此，与不使用电子束辐射的无菌处理相比，电子束辐射后的骨诱导率略微降低约14％。

DBM DBF的辐射通过ANOVA(p＝0.19)不会导致骨诱导性的统计学上显著地降低，并且两个单元表现出相似的骨诱导性。使用95％的置信区间，该分析的标准差为S＝0.25；R平方＝76.19％。图2A显示了辐射样品的残差图，包括线性正态概率图、拟合值图、直方图、和观察顺序总结于图2B中。

实例2：电子束和伽马射线辐射的

DBM DBF与非辐的对照组的骨诱导性的比较

在本研究中，使用了

DBM DBF的36(36)个成品单元。每批中的一个单元用电子束(25kGy，NuTek公司，加利福尼亚州海沃德)辐射、或用伽马射线辐射，而第三个单元仅进行无菌处理并且不接受辐射灭菌。使用Edwards等人(1998)描述的大鼠骨诱导(OI)测定法测试所有单元的骨诱导性。将每个植入物的四个重复体放置在无胸腺大鼠的肌间部位中28天。该生物测定法具有使用组织病理学评估区分不同水平的活性(骨诱导性)脱矿质骨制剂的能力。为了评估供体到供体的可变性，每个制造批次对应于不同的人体组织供体(n＝3)。使用Minitab17统计软件进行统计学分析。

结果总结在图2C和表1中。结果显示，

DBM DBF的电子束辐射使得评估的样本组的骨诱导率平均下降了7.15％(非辐射组为2.8±0.5，电子束辐射组为2.6±0.5)。结果显示，

DBM DBF的伽马射线辐射使得评估的样品组的骨诱导率平均降低53.57％(未辐射组为2.8±0.5，伽马射线辐射组为1.3±0.5)。

与未辐射的样本相比，

DBM DBF的电子束辐射未导致骨诱导性的统计学上显著地降低(p＝0.41，t-测试)，而伽马射线辐射导致骨诱导性显著地降低(p＝2.5×10^-07，t-测试)。用于上述分析的每个供体的单独的OI得分的结果总结在图2D和表2中。

表1平均OI得分

供体	非-辐射	伽马射线	电子束
				OCER7262455	3	1	3
OCER7262455	2	2	2
				OCER7262455	3	1	2
OCER7262455	2	2	2
				OCER7122707	3	1	3
OCER7122707	3	1	3
				OCER7122707	2	1	3
OCER7122707	3	1	2
				R7142468	3	2	3
R7142468	3	1	3
				R7142468	3	1	2
R7142468	3	2	3
				平均OI	2.8	1.3	2.6
标准差	0.5	0.5	0.5
				t-测试(与非辐射对比)	N/A	2.5x10<sup>-7</sup>	0.41

表2每个供体的OI得分

应当理解的是，前述内容涉及本公开的示例性实施例，并且可以在不脱离所附权利要求书中阐述的本公开的精神和范围的情况下进行修改。

Claims (21)

1.一种制备电子束辐射的骨诱导植入物的方法，所述方法包括：将含有脱矿质骨基质(DBM)纤维的骨诱导植入物暴露于剂量为10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射一段时间，以减少所述骨诱导植入物中的微生物并获得所述电子束辐射的骨诱导植入物，其中所述电子束辐射的骨诱导植入物保留了骨诱导性质，其中所述DBM纤维是人骨纤维并且长度为1至500微米，

其中，所述植入物在没有载体的情况下提供并且所包含的DBM纤维通过如下方式处理获得：研磨骨干以产生卷曲的骨纤维，随后将其脱矿质并冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将含有DBM纤维的所述骨诱导植入物暴露于所述电子束辐射使所述辐射的骨诱导植入物的所述骨诱导性质仅降低从0％至20％。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述辐射的骨诱导植入物(i)不含载体并且不含甘油；以及(ii)是DBM纤维的干燥粘附物。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述辐射的骨诱导植入物的所述骨诱导性质在室温、防潮包装中储存后直至6、12、18、24、32或36个月测量。

5.根据权利要求1所述的方法，其中将含有DBM纤维的所述骨诱导植入物暴露于所述电子束辐射发生在从19℃至23℃的温度下。

6.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述一段时间为从1分钟至60分钟；或(ii)所述剂量为25千戈瑞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述骨诱导植入物在辐射之前放置在容器中。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述DBM纤维暴露于所述电子束辐射之前，将所述骨诱导植入物的所述DBM纤维干燥。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述DBM纤维暴露于所述电子束辐射之前，将所述骨诱导植入物的所述DBM纤维冻干。

10.根据权利要求1所述的方法，其中将含有DBM纤维的所述骨诱导植入物暴露于所述电子束辐射使微生物减少至10^-6的无菌保证水平(SAL)。

11.根据权利要求1所述的方法，其中将含有DBM纤维的所述骨诱导植入物暴露于所述电子束辐射使微生物减少1-log减少量至10-log减少量。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子束辐射的骨诱导植入物被水合以形成油灰状物或糊状物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子束辐射的骨诱导植入物在辐射后水合从1％至60％。

14.根据权利要求12所述的方法，其中在所述骨诱导植入物水合之前，所述骨诱导植入物包括低水分含量，包括低于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的水分。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述骨诱导植入物在水合后被模制成与骨腔相符。

16.骨诱导植入物在制备用于以如下方法处理骨腔的产品中的用途，所述方法包括：将骨诱导植入物植入所述骨腔中，所述骨诱导植入物用剂量为10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射进行辐射一段时间以减少所述骨诱导植入物中的微生物，所述骨诱导植入物含有脱矿质骨基质(DBM)纤维并且不含载体，其中所述DBM纤维是人骨纤维并且长度为1至500微米，

其中，所述植入物在没有载体的情况下提供并且所包含的DBM纤维通过如下方式处理获得：研磨骨干以产生卷曲的骨纤维，随后将其脱矿质并冷冻干燥。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述方法进一步包括在植入之前用液体水合所述骨诱导植入物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中在水合后，将所述骨诱导植入物形成为油灰状物或糊状物。

19.根据权利要求17所述的用途，其中所述方法进一步包括在水合之后但在植入所述骨诱导植入物之前将所述骨诱导植入物模制成一形状。

20.一种骨诱导植入物，所述骨诱导植入物包括：不含载体的脱矿质骨基质(DBM)纤维，用剂量为10千戈瑞至100千戈瑞的电子束辐射来辐射所述骨诱导植入物一段时间以减少所述骨诱导植入物中的微生物，其中所述DBM纤维是人骨纤维并且长度为1至500微米，

其中，所述植入物在没有载体的情况下提供并且所包含的DBM纤维通过如下方式处理获得：研磨骨干以产生卷曲的骨纤维，随后将其脱矿质并冷冻干燥。

21.根据权利要求20所述的骨诱导植入物，其中(i)所述DBM纤维是长度为10微米至500微米的人骨纤维；以及(ii)所述辐射的骨诱导植入物的骨诱导性质仅降低从0％至20％。

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