CN1427729A - 生物材料消毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了对生物材料进行消毒以减少其中的活性生物污染物，如病毒、细菌、酵母菌、霉菌、支原体和寄生虫含量的方法。

Description

生物材料消毒方法
技术领域
本发明涉及对生物材料进行消毒以减少其中的活性生物污染物，如病毒、细菌、酵母菌、霉菌、支原体和/或寄生虫含量的方法。
背景技术
一些备制用于人体、兽体或实验用途的血液制品中可能含有不希望或具有潜在危险性的污染物，如病毒、细菌、酵母菌、霉菌、支原体和寄生虫。因此，在使用制品之前将制品中含有的所有生物活性污染物进行去活化处理至关重要，特别是当制品在输血、器官移植和其他形式的人体治疗中直接施行于人体时尤其如此，并且对于在含有各种类型的原生质的介质中培育的，并可能含有支原体或其他病毒污染物的各种生物技术制品来说，去活化处理也尤其重要。
过去，人们采取的最多的方法是从制品中筛选或检测出某种特定的污染物，而不是将制品中的污染物去除或去活化。污染物检测呈阳性的制品不再被使用。例如，筛选步骤可包括从捐血者的血液中检测某种特定的病毒。然而，这些步骤并不总是可靠，因为其无法检测出数量很小的病毒。由于可导致虚假的阳性结果，检测的价值或可靠性打了折扣。虚假阳性结果在某些情况下可危及生命，比如可能导致感染获得性免疫缺损综合症(艾滋病)。此外，在某些情况下，需要几周，甚至几个月来判断制品中是否含有污染物。
较新的方法旨在去除或去活化制品中的污染物。这些方法包括热处理，过滤和向制品中添加化学去活化剂或敏化剂。热处理要求将制品加热到约60℃，并保持70小时，但这可能会对敏感制品造成破坏。热去活化可破坏制品中多达50％的生物活动。过滤是指对制品进行过滤，用物理方法去除污染物。遗憾的是，这种方法会将分子重量较大的制品一并去除，并且，在某些情况下，由于制品的分子结构较大，较小的病毒无法通过过滤方法去除。化学敏化步骤是指在制品中添加有毒试剂，使其与病毒的脱氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA)结合，并通过紫外线(UV)或离子辐射进行活化，产生自由基，突破病毒DNA/RNA主链中的化学键，或者将其复杂化，使病毒无法复制。由于敏化剂有毒，甚至可诱变或致癌，不能直接施行于人体，因此该步骤要求将未结合的敏化剂从细胞制品中洗出。
另一种对制品进行消毒的方法是用伽马射线进行照射。在进行大剂量照射时，伽马辐射可有效地破坏病毒和细菌。(参看：基斯利，Keasly等，《照射之后生命是否存在？》“Is There Life AfterIrradiation？第二部分，《生物制药》(BioPharm)1993年7-8月，和莱特曼，Leitman，《血液细胞照射在防止输血后的移植体抗宿主疾病中的应用》“Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention ofPost Transfusion Graft-vs-Host Disease”，《输血科学》(Transfusion Science)10：219-239(1989))。然而，本领域公开发表的论文同时揭示，伽马辐射可破坏辐射敏感制品，如血液。特别是大剂量的辐射会对红细胞、血小板和粒细胞造成伤害(莱特曼)。美国第4,620,908号专利案提出，蛋白质制品必须在照射之前进行冷冻，以维持蛋白质制品的存活能力。该专利指出，“如果在环境温度下对蛋白质材料进行伽马照射，材料将被完全破坏，即：材料的活性将变得极低，实质上不再有效。”然而，如果为了照射目的将生物制品进行冷冻，然后在施行于人体前将其融化，那么许多敏感生物制品，比如血液，将失去生存力和活性。
由于存在上述困难，我们仍需要寻找对生物材料进行消毒的方法，其既能降低活性生物污染物的含量，又不会对生物材料造成反作用。
发明概述
因此，本发明的目的是提供既能降低活性生物污染物含量，又能避免对生物造成反作用的生物材料消毒方法。本发明的其他目的、特征和优点将在下文的较佳实施例部分进行详细阐述，通过本说明书的说明和对本发明的实践，本发明的目的、特征和优点将更加明显。本发明的这些目标和优点可通过说明书和权利要求书中所特别指明的组合物和方法实现和获得。
依照这些和其他目标，本发明的第一实施方案是一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，其包括：(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护生物材料抵御离子辐射的水平；和(ii)按有效剂量率用射线对生物材料照射一段有效时间，使其得到消毒。
本发明的第二实施方案是一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，其包括：(i)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护生物材料抵御离子辐射；和(ii)按有效剂量率用射线对生物材料照射一段有效时间，使其得到消毒。
本发明的第三实施方案是一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，其包括：(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护生物材料抵御离子辐射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护生物材料抵御离子辐射；和(iii)按有效剂量率用射线对生物材料照射一段有效时间，使其得到消毒。在本实施例中，步骤(i)和(ii)可互相颠倒。
附图说明图1和2显示某些稳定剂对暴露于45kGy低剂量伽马照射的冻干的抗胰岛素单细胞抗体的保护效果。图3A-3C显示某些稳定剂对暴露于45kGy低剂量伽马照射的冻干的抗胰岛素单细胞抗体的保护效果。图4显示首次冻干和二次冻干对单细胞抗体敏感性的保护效果。图5显示冷冻干燥和/或添加稳定剂对因子VIII(Factor VIII)活性的保护效果。图6显示某些稳定剂对暴露于25kGy低剂量伽马照射的液体或冻干的抗血凝酶III的保护效果。图7-14显示某些稳定剂对冻干的抗胰岛素单细胞抗体的活性的保护效果。图15显示当以高剂量率(30kGy/小时)照射试样时，稳定剂对冻干的抗胰岛素单细胞抗体的活性的保护效果。图16显示稳定剂对接受伽马射线照射的冻干的凝血酶的效果。图17显示稳定剂对接受伽马射线照射后的免疫球蛋白M(IgM)的活性的效果。图18为色谱图，显示伽马照射对白蛋白的效果。图19显示冻干和/或添加稳定剂对接受伽马射线照射后的凝血酶活性的保护效果。图20-25显示某些稳定剂对暴露于45kGy伽马照射(1.8kGy/小时)的液体免疫球蛋白(IVIG)多细胞抗体的保护效果。图26显示pH值对添加稳定剂之后接受照射的尿激酶(液体或冻干)恢复的效果。
具体实施方式
A.定义
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语均与所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明中提及的所有的专利案和出版物均以引用方式明确并入本文中。
本说明书中所使用的术语“生物材料”指任何源自或来自活生物体的物质。生物材料包括，但不仅限于以下几种：细胞；组织；血液或血液成分；蛋白质，包括重组蛋白质和转基因蛋白质；植物制剂；食物材料，等等。生物材料的较佳实例包括，但不仅限于以下几种：韧带；腱；神经；骨骼，包括去矿质骨基质、骨质移植物、关节、股骨、股骨头等等；牙齿；皮肤移植片；骨髓，包括全部或已处理的骨髓细胞悬液；心脏瓣膜；软骨；角膜；动脉和静脉；可移植器官，如：心脏、肺、肝、肾、肠、胰脏、四肢和手、脚趾；类脂；碳水化合物；(天然、无原纤维、可溶性和不溶性)胶原；几丁质(chitin)及其衍生物，包括几丁多糖(chitosan)及其衍生物，包括NO-羧基几丁多糖(NOCC)；干细胞、郎格罕氏岛(islet of langerhans)细胞，以及其他移植细胞，包括基因改变的细胞；红血球；白血球，包括单核细胞和干细胞；以及血小板。
本说明书中所使用的术语“消毒”指依照本发明降低所处理的生物材料中的至少一种生物污染物的含量。
本说明书中所使用的术语“生物污染物”指当与生物材料直接或间接接触时可对生物材料造成有害作用的污染物。这些生物污染物包括所属技术领域的技术人员已知的各种病毒、细菌和寄生虫，通常存在于或感染全血或血液成分等生物材料。生物污染物包括，但不仅限于以下几种：病毒，比如人类免疫缺陷病毒和其他逆病毒、疱疹病毒、副粘病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒、披膜病毒、埃布斯滕巴尔病毒(EbsteinBarr virus)和小病毒；细菌，比如埃希氏杆菌、芽孢杆菌、弯曲菌、链球菌和葡萄球菌；寄生虫，比如锥虫和疟原虫，包括疟原虫种；酵母菌、霉菌、支原体；以及蛋白病毒。本说明书中所使用的术语“活性生物污染物”指有能力导致有害作用的生物污染物。
本说明书中所使用的术语“血液成分”指可从全血中分离出来的一种或更多种成分，包括，但不仅限于血液细胞成分，比如红血球、白血球和血小板；血液蛋白质，比如：凝血因子、酶类、白蛋白、血纤维蛋白溶酶原、血纤维蛋白原和免疫球蛋白；以及液体血液成分，比如：血浆和含血浆的化合物。
本说明书中所使用的术语“血液细胞成分”指包含细胞，比如：红血球、白血球或血小板的一种或更多种全血成分。
本说明书中所使用的术语“血液蛋白质”指通常存在于全血中的一种或多种蛋白质。存在于哺乳动物(包括人类)体内的血液蛋白质包括，但不仅限于，凝固蛋白质(依赖维生素K蛋白，如因子VII或因子IX，以及不依赖维生素K蛋白，如因子VIII和冯威乐布兰氏(vonWillebrands)因子、白蛋白、脂蛋白(高密度脂蛋白和/或低密度脂蛋白)、补体蛋白、球蛋白(如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE)，等等。血液蛋白的较佳群组包括因子I(凝血因子)、因子II(凝血酶原)、因子III(组织因子)、因子IV(钙)、因子V(促凝血球蛋白原)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(前转变素、血清凝血酶原转变加速因子)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(斯图尔特因子(Stuart-Prower Factor))、因子XI(血浆凝血活素前质)、因子XII(海格曼因子(Hageman Factor))、因子XIII(Protansglutamidase)，冯威乐布兰氏因子(vWF)，因子Ia、因子IIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa和因子XIIIa。
本说明书中所使用的术语“液体血液成分”指全血中的一种或更多种液体、非细胞成分，比如血浆(人类或动物血液凝固前的液体、非细胞部分)或血清(人类或动物血液凝固后的液体、非细胞部分)。
本说明书中所使用的术语“生物相容溶液”(指通过悬浮或溶解等方式含有生物材料，并保持其活性，即：保持其基本生物和生化特征的溶液。这些生物相容溶液最好含有有效剂量的至少一种抗凝剂。
本说明书中所使用的术语“生物相容缓冲溶液”指pH值和渗透属性(如：渗透压、渗透浓度和/或胶体渗透压)适合于保持生物材料完全性的生物相容溶液。适当的生物相容缓冲溶液的pH值通常在5到8.5之间，并且等渗，或适度低渗或高渗。所属技术的技术人员了解并可方便地得到生物相容缓冲溶液。
本说明书中所使用的术语“稳定剂”指一种化合物或材料，能够在当生物材料接受照射的剂量不足，妨碍了该材料的安全和有效使用时减少对生物材料的破坏。稳定剂包括，但不仅限于以下几种：抗氧化剂，如抗坏血酸和生育醇；以及自由基净化剂，如乙醇。稳定剂的较佳实例包括，但不仅限于以下几种：脂肪酸，包括6，8二巯基辛酸(硫辛酸)及其衍生物和类似物(α、β、二氢化、双降和四环硫辛酸)、硫辛酸，6，8二巯基辛酸、dihydrolopoate(DL-6，8-二硫辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二硫甲酯和四环二硫辛酸、呋喃脂肪酸；油酸、亚油酸和棕榈酸及其酸盐和衍生物；类黄酮、苯基丙醇和黄酮醇，如槲皮黄酮、芸香苷及其衍生物，芹菜素、氨基黄酮、儿茶酚、桔皮苷以及柚苷；胡萝卜素，包括β胡萝卜素；C0-Q10；叶黄素；多羟基醇，如丙三醇、甘露醇；糖类，如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖、海藻糖；氨基酸类，如组氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、钠carpryl N-乙酰氨酸癸酰基钠和甲硫氨酸；叠氮化物，如叠氮化钠；酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶；尿酸及其衍生物，如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；别嘌呤醇；硫醇类，如谷胱甘肽和巯基丙氨酸；微量元素，如硒；维生素，如维生素A、维生素C(包括其衍生物和盐类，如抗坏血酸钠和棕榈酰抗坏血酸维生素C)和维生素E(及其衍生物和盐类，如醋酸生育酚和α三烯生育酚)；色原烷醇-α-C6；6羟基2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2羧基酸(Trolox)及其衍生物；外源蛋白质，如凝胶和白蛋白；三-3-甲基-2-苯基-2-吡唑啉-5-1(MCI-186)；西替沃酮；puercelin；柯因；二甲基亚砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧基补骨脂素(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；还原物质，如丁羟甲醚(BHA)和丁羟甲苯(BHT)；胆固醇；丙丁酚；吲哚衍生物；水杨乙汞；氨基类固醇衍化物(Lazaroid)和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；原花青素；硫酸铵；聚乙烯醇超氧化物歧化酶(PEG-SOD)；N-第三丁基-α-苯基硝酸灵(PBN)；和4-异烟肼-2，2，6，6-四甲基胡椒酸-1-烃氧基(Tempol)。
本说明书中所使用的术语“溶剂残留量”指生物材料中的自由液体(freely-available liquid)含量。自由液体是指存在于生物材料中，但是不与生物材料中的某种或更多种非液体成分(如：蛋白质、金属离子或盐类等等)结合或复合的水或有机溶剂(如：乙醇、异丙醇、聚乙二醇，等等)液体。自由液体包括细胞内水分。本说明书所引用的溶剂残留量是指采用经美国食品及药物管理局(FDA)批准的，经过修正的卡尔-费歇尔法(Karl Fischer method)测定的含量(梅尔(Meyer)和博伊德(Boyd)，《化学分析》(Analytical Chem.)，31，215-219，1959；梅(May)等人，《化学标准化》(Biol.Standardization)，10，249-259，1982；FDA生物制品鉴定和研究中心，备审案件号89D-0140，83-93；1990)。
本说明书中所使用的术语“敏化剂”指一种能够选择性地针对病毒、细菌和/或寄生虫污染物的物质，使其对辐射去活化更加敏感，因而与不添加敏化剂的情况相比，可以采用较低的辐射率和/或较短的照射时间。适当的敏化剂包括，但不仅限于以下几种：补骨脂素及其衍生物和类似物(包括3-碳乙氧基补骨脂素(3-carboethoxy psoralens)；白芷素、凯林(khelins)和含有卤代物和半水溶物(watersolubilization moiety)的香豆素，如四价铵离子或磷离子；核酸结合化合物；溴化血卟啉；鄰-二苯；羟基茜草素；卟啉(porphorin)；二聚血卟啉酯衍生物的卤代物或金属代物、二聚血卟啉衍生物、苯卟啉衍生物、氢化二苯卟啉(hydrodibenzoporphyrin)二顺丁烯二酰亚胺、氢化二苯卟啉、二氰化二磺(dicyano disulfone)、四乙酸二苯卟啉，和四乙酸二苯卟啉三丙酸氨基化合物；可用卤素或金属原子改良的阿霉素和道诺霉素；纺锤菌素；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，如金丝桃素、亚甲基蓝、四溴荧光素、荧光素(及其衍生物)，黄素、部花青540；感光化合物，如佛手柑内酯；和SE肽。
本说明书中所使用的术语“蛋白质材料”指至少包括一种蛋白质或肽的细胞材料。该材料最好主要由蛋白质和/或肽组成。其可以是以自然状态存在，或经过处理/提纯和/或衍生作用的天然存在的材料。该材料还可通过化学合成或采用基因重组/转基因技术进行人工制造。该人工制造的材料同样可以进行处理/提纯和/或衍生。蛋白质材料包括，但不仅限于以下几种：通过组织培养产生的蛋白质/肽；奶(乳制品)；腹水；荷尔蒙；生长因子；医药材料，包括从动物组织(如肝磷脂、胰岛素)或植物物质中分离或提取的医药品；血浆(包括新鲜、冷冻或冻干血浆)；纤维蛋白原、纤维蛋白和/或纤维蛋白密封剂；全血；蛋白质C；蛋白质S；α-1抗胰岛素(α-1蛋白酶抑制剂)；丁基胆碱脂酶；抗凝因子，如香豆素药品(灭鼠灵)；链激酶；组织纤溶蛋白激活因子(TPA)；促红细胞生成素(EPO)；尿激酶；白血球生成素；抗凝血酶-3；α-葡(萄)糖苷酶；(胎儿的)牛血清/马血清；肉类；免疫球蛋白，包括抗血清、单克隆抗体、多克隆抗体和基因改造或制造的抗体；白蛋白；α球蛋白；β球蛋白；γ球蛋白；可凝固蛋白；补体蛋白质；和干扰素。
本说明书中所使用的术语“离子辐射”指具有足够能量使被照射生物材料离子化(产生离子)的辐射。离子辐射包括，但不仅限于以下类型：(i)粒子辐射(亚原子粒子流，如中子、电子、和/或质子流)；(ii)电磁辐射(从不同的电磁场中产生，如无线电波、可见光和不可见光、X射线和γ射线等)。B.特别优选实施方案
本发明的第一优选实施方案为一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，其步骤包括：(i)将生物材料中的溶剂残留量减低到足以有效保护该生物材料抵御离子辐射的水平；以及(ii)按有效剂量率用射线对生物材料照射一段有效时间，使其得到消毒。
本发明的第二实施例是一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，其包括：(i)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护生物材料抵御离子辐射；和(ii)按有效剂量率用射线对生物材料照射一段有效时间，使其得到消毒。
本发明的第三实施例是一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，其包括：(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护生物材料抵御离子辐射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护生物材料抵御离子辐射；和(iii)按有效剂量率用射线对生物材料照射一段有效时间，使其得到消毒。在本实施例中，步骤(i)和(ii)可互相颠倒。
依照本发明的方法进行消毒的生物材料可以是源自或从活或死生物体中获得的任何材料，包括固体材料或液体材料，或任何固体在任何液体中的悬浮液，或生物或非生物基质上的任何固定或液体涂覆层。
依照本发明的方法，在用离子辐射对生物材料进行照射之前，应降低生物材料的溶剂残留量。溶剂残留量应降低到足以保护生物材料抵御离子辐射的水平。溶剂残留量的适当水平取决于接受照射的特定生物材料的性质和特点，也可由所属技术领域的技术人员根据经验确定。当溶剂是水时，溶剂残留量应低于约2.0％，低于0.5％更好，最好是低于0.2％。
尽管不希望与任何操作性理论结合，但是人们公认降低溶剂残留量可降低生物材料的自由度，因而保护其抵御电离性辐射的影响。通过将生物材料的温度降低到其低共熔点或凝固点以下来降低生物材料的自由度可获得相似结果。这些结果允许采用更高的照射率。
可采用所属技术领域的技术人员已知的任何方法和技术来降低生物材料中的溶剂残留量，将溶剂从生物材料中去除。降低生物材料溶剂残留量的一种特别较佳方法是冻干法。根据本发明的特别优选实施方案，可将生物材料在照射之前储存在真空或惰性空气中(惰性气体较佳，如氦或氩，高分子重量惰性气体更佳，最好是氩)进行冻干。
本发明中所采用的离子辐射可以是任何能够将需处理的生物材料中的一种或更多种生物污染物有效去活化的离子辐射。较佳的离子辐射为电磁辐射，特别较佳的离子辐射形式是伽马辐射。
根据本发明的方法，用离子辐射照射生物材料的剂量率应足以将生物材料的一种或更多种生物污染物有效去活化。适当的照射剂量率取决于离子辐射的特定形式以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物污染物的性质和特点。适当的照射剂量率也可由所属技术领域的技术人员根据经验确定。在消毒程序持续过程中，照射剂量率最好保持不变。
根据本发明的一个特别优选实施方案，照射的剂量率不应超过约3.0Kgy/小时，在约0.1kGy/小时和3.0kGy/小时之间较佳，在约0.25kGy/小时和2.0kGy/小时之间更佳，在约0.5kGy/小时和1.5kGy/小时之间更佳，在约0.5kGy和1.0kGy/小时之间最佳。
根据本发明的另一特别优选实施方案，照射剂量率至少为约3.0kGy/小时，至少为约6kGy/小时较佳，至少为约16kGy/小时更佳，至少为约30kgy/小时最佳。
用离子辐射照射生物材料一段时间，使生物材料中的一种或更多种生物污染物有效地去活化。适当的电离时间取决于离子辐射的特定形式和剂量率，以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物污染物的性质和特征。适当的电离时间还可由所属技术领域的技术人员根据经验确定。
在用离子辐射照射生物材料之前，可选择向生物材料中添加至少一种有效剂量的敏化剂。适当的敏化剂为所属技术领域的技术人员已知的敏化剂。
依照本发明的方法，对生物材料进行照射可在任何对需处理的生物材料无害的温度下进行。根据本发明的一个优选实施方案，在环境温度下照射生物材料。根据本发明的一个替代优选实施方案，在对比温度下，最好在生物材料的低共熔点或更低的温度下照射生物材料。C.实施例
以下实施例用来说明，而并非限制本发明。所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种修正和改进。实施例1 血液消毒
本例采用一袋200ml一日型旧浓缩红血球。细胞中添加了乙醇，以获得最终乙醇浓度0.01％v/v。采用改良的柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)溶液按1比10的系数稀释红血球细胞，CPD溶液的pH值为约6.4到6.7之间，总容积为500ml，并含有以下成分：
一水柠檬酸               0.2克
二水柠檬酸钠             27.3克
单碱式磷酸钠             2.2克
二碱式磷酸钠             1.0克
葡萄糖                   3.2克
细胞在含有一个钴60源支架的工业规格伽马辐照器内接受照射。照射在托架下的一个无防护的盒子里进行。以大约1kGy/小时的剂量率照射细胞24小时。照射阶段结束后，通过目测发现红血球具有活力，呈亮红色。而由没有经过上述CPD溶液稀释的浓缩红血球所组成的控制试样在照射后没有活力。
照射程序结束4天之后，对稀释细胞中的各种血液成分的含量进行检测，结果如表一所示。控制试样与测试试样来自同一袋血液，但是没有经过照射。表一说明，对人类血液细胞进行稀释和照射并不会显著改变白血球的数量。血小板数量和血细胞含量值比控制试样略低；然而，这些数值仍在成人血液的正常范围以内。控制试样中的血红蛋白含量高意味着某些红血球确实已在照射程序中溶解，这一点也可以从红血球数量减少中得到证明。但是，与先前的论点相反，按照本程序进行的高达50kGy的辐射并没有破坏血液成分。在经过以1kGy/小时的低剂量率进行的25kGy的伽马照射之后，细胞数量没有大量减少，而且具有活力。
                表1
成分 已照射血液 控制试样血样
白血球 4K/mm3  4.8K/mm3
红血球 3Mi/mm  7.2Mi/mm3
血红蛋白 42g/dl  21g/dl
白血球容量 46％  64％
血小板 100k/mm3  120k/mm3
实施例2 葡萄糖消毒
包含葡萄糖的溶液用于治疗碳水化合物和体液缺失，用于治疗低血糖，并作为血浆扩张剂用于肾透析，以及用来抵制肝毒素(默克索引，(The Merck Index)第11版，Merck & Co.，Inc.(1989)，和《马丁代尔大药典》、(Martindale：The Extra Pharmacopoeia)p.l 265)。葡萄糖还是母体营养团(parental nutrition regiments)中较佳的碳水化合物来源(默克索引，第11版，(1989)，和《马丁代尔大药典》(Martindale’s The Extra Pharmacopoeia)p.l 265)。在以上所有应用中，葡萄糖都必须在使用前进行消毒。对含葡萄糖产品的消毒通常采用加热消毒或高压蒸汽灭菌。遗憾的是，据报道这些方法可导致含葡萄糖的溶液退化(degrade)或变成棕色，因而使溶液颜色改变。(《马丁代尔大药典》(Martindale’s The Extra Pharmacopoeia)p.l265)据报道，对葡萄糖进行伽马照射也能分解含葡萄糖溶液(Kawakishi等人，《绝氧条件下辐射引起的D-葡萄糖退化》(“Radiation-Induced Degradation of D-glucose in AnaerobicCondition”)，《农业化学生物》(Agric.Biol.Chem.)1977年6月)因此，需要找到一种能够避免制品本身产生退化的制品消毒方法。鉴于现有技术中的问题，我们按以下步骤，用本发明的方法来处理葡萄糖溶液。
将5％的葡萄糖溶液以大约1kGy/小时的剂量率照射24小时。照射之后对制品进行检测，发现与没有接受照射的控制试样相比，可见光谱没有任何改变。因此，该方法能够用于消毒含葡萄糖的制品。
除了上述实验以外，我们将5％和50％的新鲜葡萄糖溶液在环境温度下以25kGy的剂量照射36小时，结果与上述方法相似。此外，紫外光/可见光(UV/VIS)扫描结果说明，完全没有出现《美国药典》(USP)中所规定的283.4nm的“糠醛”峰值。相反，采用高压蒸汽法进行消毒的葡萄糖试样含有283.4nm的糠醛峰值。“糠醛”为致癌物质。实施例3 人类血清白蛋白消毒
采用伽马辐照装置Gammacell220(Co60为该装置中的伽马射线源)将正常人类血清白蛋白作为25％贫盐(salt-poor)溶液照射36小时，总照射剂量为25kGy。在照射过程中不控制温度，但是估计容纳白蛋白溶液的容器温度约为23℃。HPLC分析结果如表二所示。
                              表2
   参数   控制试样(％)   已照射试样(％)
   聚合物     2     3
   二聚物     7     8
   单体     90     86
   低分子重量     1     3
   pH值     7.05     6.97
   NTU(必须＞20)     11.4     11.4
结果说明，正常人类血清白蛋白可在室温下安全地接受25kGy的照射(剂量率约为0.7kGy/小时)，并且蛋白质的基本属性不会受到负面影响。这在以往没有得到论证。照射血清白蛋白的其他尝试要求在冷冻阶段进行照射，这增加了照射的成本和难度。实施例4
将来自健康捐血者的正常人类血液放进肝素化的试管，用标准CPD溶液冲洗三次，然后用含有0.01％v/v乙醇的CPD按1∶20的比例进行稀释。含有0.01％v/v乙醇的CPD溶液被称为SCPD。然后将两毫升试样放入10毫升塑料试管，并在室温下以多达26kGy的不同剂量照射36小时以上。照射后没有产生溶血作用，细胞保持完整，只是有些增大和形状略微不规则。表三报告了三个不同实验的结果。
                       表3
  参数   RCB1   HGB2   HCT3   MCV4   MCH5   MHC6   RDW7     标记
  1*控制试样   1.08.99   4133   .0970.89   89.590.2   38.333.0   427366   17.715.3 接近正常
  2*   95.0   32.3   339   12.0
12 kGy 1 1.221.38 4545 .166.199 135.8144.7 36.533.0 269228 27.324.9   1+异形红细胞3+巨型红细胞
116 kGy 1.040.54 3229 .169.088 163.0162.5 31.354.5 152335 18.818.8   1+异形红细胞3+巨型红细胞
  2 0.820.81 2726 .128.124 156.5152.6 32.832.4 209212 19.820.2   2+异形红细胞3+巨型红细胞
  120 kGy 0.791.26 24428 .125.203 158.4161.5 30.822.1 194137 19.419.0   1+异形红细胞3+巨型红细胞
  2 0.930.92 3030 .141.143 151.5155.5 32.332.1 213207 20.120.5   2+异形红细胞3+巨型红细胞
  26kGy 1 1.151.15 3434 .180.176 155.9153.0 29.429.9 189195 19.123.4   1+异形红细胞3+巨型红细胞
*试验1和试验21.红血球数量：细胞×1012/升2.血红蛋白：克/升3.红细胞容量4.细胞平均体积：千万亿分之一升5.血红蛋白平均重量：微微克6.血红蛋白细胞平均浓度：可/升
我们可以很容易地将细胞放入悬浮液，在淡缓冲液中进行重组。
以下三个实验(实施例5、6和7)是为了确定本方法在处理受人类免疫缺陷病毒(HIV)污染的血液时的功效。在各实施例中，细胞处理方式相似。在这些实验中，在经过12、16和24小时的照射之后将细胞轻轻搅动。此外在第三个实验(实施例7)中，细胞被放在T25烧瓶中，以增加表面面积和降低因在离心管底部产生沉淀所导致的浓缩作用。在所有情况下，照射细胞的剂量率总是为大约0.7kGy/小时。实施例5 含HIV血液的消毒
以下实验是为了实现下列特定目标：
1.评估该方法在处理红血球(RBC)时的毒性。
2.评估该方法的抗逆转录活性。
方法
首先，从一名HIV-血清反应阳性的捐血者体内抽取2毫升抗凝血血液。将血液离心，去掉血浆。将剩下的细胞球(cell pellet)重新悬浮进10毫升的CPD缓冲液，并离心。该冲洗方法总共进行三遍。将最终的细胞球重新悬浮进40毫升的CPD缓冲液，并按2毫升等份试样分配到塑料试管，形成16个单独试样备用。在其中的8个试管中添加HTLV-IIIB试样，这是HIV病毒的实验室菌株，每个需感染的试管中还添加了100个组织培养感染剂量(TCID)。对于其他8个试管，通过添加少量非感染性实验室缓冲液——磷酸盐缓冲盐水来进行“模拟”感染。用该方法处理4个感染的试管和4个未感染的试管。为了进行比较，另外的8个试管(4个受感染，4个未感染)也用类似方式进行处理，但是不经过该程序。
应当指出的是，在研究开始时，我们从捐血者身上抽取了一个单独的试样。该试样在临床血液学实验室进行处理，并获得了完整的血象。对研究试样重复这些测试，并与这些基准结果进行比较，其中包括评估4个已处理和4个未处理的试样，所有试样均未感染HIV。
将每个受感染研究试样中的0.5毫升等份试样移植到三天前采集的单核细胞(MC)上。这些细胞已在RMPI培养基中悬浮，并添加了10％牛胎血清和其他添加剂(青霉素、链霉素、谷氨酰胺和HEPES缓冲液)，以及1μg/ml PHA-P。在进行移植的同时，将细胞重新悬浮在rIL-2(20U/ml)淡培养基中。培养过程持续7天，每周两次采集部分培养基，测量HIVp24抗原含量(工业用酶联免疫试剂盒(ELISA kit)，Coulter Electronics，Hialeah，FL)以测定病毒生长状况。
将8个受感染研究试样的单独等份试样用于病毒滴定实验。我们可以简单地将连续四重(four-fold)稀释的含病毒液体(从1∶16到1∶65，536)三重移植入96孔平底组织培养板。在每个孔中添加经PHA刺激(PHA-stimulated)的MC(2ml培养基中有400万个细胞，包括IL-2)。每周两次从每个培养孔中采集上层清夜等份试样，用于测量HIVp24抗原含量。如果一个孔的HIVp24抗原含量值大于30pg/ml，则该孔被记录为“阳性”。
根据史丕曼-卡伯法(Spearman-Karber method)(参看ACTG，病毒学规程手册)，我们采用以下公式来计算病毒滴定度：
M＝xk+d[0.5-(1/n)r]
M：滴定度(在log4中)
xk：最高稀释剂量
d：稀释之间的空间
n：每次稀释的孔数
r：总孔数
结果
基准试样，以及已处理和未处理研究试样的红血球参数如表4所示。
                         表4
  试样编号     MCV     MCH     MCHC
    基准     94.5     32.0     339
    未处理-1     91.4     34.4     376
    未处理-2     90.2     37.9     420
    未处理-3     92.1     40.0     433
    未处理-4     91.0     40.2     442
    已处理-1     133.4     37.8     284
    已处理-2     131.5     45.0     342
    已处理-3     128.5     38.9     303
    已处理-4     131.1     39.4     301
表4中的缩略语见表3下的解释。
如上所述，HIV培养基使用已处理和未处理的研究试样的0.5ml等份试样建立。表5显示根据第4天和第7天培养基测定的研究试样P24抗原含量(pg/ml)。
                  表5
试样编号     p24第4天     p24第7天
    未处理-1     1360     484
    未处理-2     1180     418
    未处理-3     1230     516
    未处理-4     1080     563
    已处理-1     579     241
    已处理-2     760     303
    已处理-3     590     276
    已处理-4     622     203
最后，选择一个已处理试样和一个未处理试样在没有培养基的情况下进行直接病毒滴定，结果如表6所示。
                  表6
    试样编号     滴定度(log 10ml)
    未处理-1     1.5
    已处理-1     0.0
尽管观察到一些可再生的巨红细胞，但是红血球在该方法中受到的影响微乎其微。尽管在共同培养已处理试样过程中似乎出现了一些残留活病毒，但是没有得到直接滴定实验的证实。实施例6
本实验的目标是以全面方式评估该方法在处理红细胞时的毒性。
方法
在本实验中，与第一个实验一样，从一名HIV-血清反应阳性的捐血者体内抽取1毫升抗凝血血液。将血液离心，去掉血浆。将剩下的细胞球重新悬浮进10毫升的CPD缓冲液，并离心。该冲洗方法总共进行三遍。将最终的细胞球重新悬浮进20毫升SCPD缓冲液，并按2毫升等份试样分配到塑料试管，形成10个单独试样备用。其中的8个试管按照该方法进行处理，余下两个试管作为未处理的控制试样。处理结束之后，将所有试管离心，将形成的细胞球悬浮进100μl缓冲液。再获得这些重新浓缩的研究试样的完整血象。
与第一个实验一样，在采集研究试样时，我们从捐血者身上抽取了一个单独的试样，并获得了该基准试样的完整的血象。当研究试样重新浓缩到其初始状态的33-50％时，则可将其与基准试样进行比我们先前的实验更直接的比较。
结果
基准试样，以及未处理和已处理研究试样的红血球参数如表7所示。表7中的缩略语请参看表3中的定义。
                               表7
试样编号     RBC     HGS   MCV     MCH     MCHC
基准     4.76     152   94.9     31.9     336
未处理-1     0.99     33   90.2     33.0     366
未处理-2     1.08     41   89.5     38.3     427
已处理-1     1.15     34   153.0     29.9     195
已处理-2     1.15     34   155.9     29.4     189
已处理-3     1.26     28   161.5     22.1     137
在所有已处理试样中均出现巨红细胞，从未处理和已处理试样中测得可比的血红蛋白。这些绝对值适合于残留稀释。红血球得以保存。实施例7
方法
在本实验中，与第两个实验一样，从同一名HIV-血清反应阳性的捐血者体内抽取5毫升抗凝血血液。将血液离心，去掉血浆。将剩下的细胞球重新悬浮进100毫升CPD缓冲液，并离心。该冲洗方法总共进行三遍。将最终的细胞球重新悬浮进100毫升SCPD缓冲液，并按25毫升等份试样分配到T25组织培养烧瓶中，形成4个等份试样备用。其中的两个烧瓶按照该方法进行处理，余下两个烧瓶作为未处理的控制试样。处理结束之后，观察每个烧瓶的内容并目测细胞吸收氧气的能力(当暴露于环境空气时，呈现更亮的红色)。然后，抽出和离心烧瓶的内容，并将残留细胞球重新悬浮进少量缓冲液。再获得这些重新浓缩的研究试样的完整血象。
与第五和第六个实验一样，在采集研究试样时，我们从捐血者身上抽取了一个单独的试样，并获得了该基准试样的完整的血象。当研究试样重新浓缩到其初始状态的33-50％时，则可将其与基准试样的一些特定参数进行直接的比较。
结果
当目测时，已处理和未处理的研究试样之间没有明显区别。特别来说，悬浮良好的细胞呈均匀分布。当暴露于环境空气时，所有烧瓶的内容均变成更亮的红色。没有特别测定充氧量。
基准试样，以及未处理和已处理研究试样的红血球参数如表8所示。表8中的缩略语请参看表3中的定义。
                              表8
试样编号     RBC     HGS     MCV     MCH     MCHC
基准     4.75     153     95.0     32.3     339
未处理-1     0.93     30     151.5     32.3     213
未处理-2     0.92     30     155.5     32.1     207
已处理-1     0.82     27     156.5     32.8     209
已处理-2     0.81     26     152.5     32.4     212
本实验设计用来更好地评估即将输入人体的红血球的状态，因此实验采集的试样量更大。初步结论为，该方法并未削弱红血球携带氧气的能力，尽管对此没有进行正式的测定。有趣的是，在本实验中，已处理和未处理试样的细胞大小没有差别，均大于基准。我们测量了所有研究试样中的血红蛋白含量。实施例8
在本实验中，我们对冻干形式的免疫球蛋白G(IgG)进行照射。
方法
对IgG进行HPLC分析的结果如表9所示。其结果显示，在室温下接受剂量为25kGy，剂量率为大约0.7kGy/小时的照射后，制品没有受到影响。这一点是首次得到证明。
                         表9
    参数   控制试样(％)   已照射试样(％)
 聚合物(必须＞2％)     1     1
 二聚物     10     13
 单体     88     84
 低分子重量     1     2
结果
格治利(Gergely)等人采用冻干IgG进行实验后所提出的结果显示，在按标准剂量率照射了12kGy到25kGy的剂量之后，部分蛋白质成为不可溶。(格治利，J，等人，《伽马射线照射后的人类免疫球蛋白G研究》(“Studies of gamma-Ray-Irradiated Human ImmunoglobulinG”)SM-92/12 I.A.E.A.)但是，采用本发明以大约0.7kGy/小时的剂量率进行照射时，没有蛋白质成为不可溶，这意味着蛋白质的变化和退化很小或根本没有。此外，格治利等人发现人类IgG的一种液体剂型在照射之后丧失了活性。而采用本方法对液态的静脉免疫球蛋白(IVIG)的研究显示，超免疫IVIG中保持了70％以上的一种特定抗体。实施例9
在本实验中，我们对冻干形式的α1蛋白酶抑制剂和凝血因子进行照射。
方法
将试样放进伽马辐照装置Gammacell220中，依照本方法进行总剂量为25kGy的照射。然后试样返回实验室进行分析。剂量率为0.72kGy/小时。
结果
已处理和控制α1蛋白酶抑制剂均为一个标准的正常合并(pooled)血浆试样的40％。在化验中采用孟氏放射免疫扩散技术(Mancini radical immunodiffusion technique)。
将当前讨论的凝血因子化合物小试管在10ml的水中重组，将硫酸鱼精蛋白小试管在10ml中重组。在试样中添加浓缩度为10mg/ml的硫酸鱼精蛋白。在全部三次备制中都立刻产生了单体。实施例10
在本实验中，我们对冻干形式的因子VII、VII和IV进行照射。
方法
将试样放进伽马辐照装置Gammacell220中，按大约1kGy/小时的剂量率进行总剂量不定的照射。
结果
因子VII在接受20kGy的照射后保持67％的活性，在10kGy照射后保持75％的活性。因子VIII在接受20kGy的照射后保持77％的活性，在10kGy照射后保持88％的活性。同样，因子IV在接受20kGy的照射后保持70％的活性，在10kGy照射后保持80％的活性。
三种因子的结果都十分优异。据我们所知，以往没有人能够在环境温度下进行如此大剂量的照射之后还能获得因子活性损失如此之小的结果。这与Kitchen等人的实验结果形成鲜明对比，Kitchen等人在《伽马照射对人类免疫缺陷病毒和人类凝固蛋白质的效果》(“Effectof Gamma Irradiation on Human Immunodeficiency Virus and humanCoagulation Proterins”一文中提出：“对冻干浓缩物进行照射的程序是不可行的”。同样，Hiemstra等人在《通过伽马照射将人类免疫缺陷病毒去活化及其对血浆和凝固因子的影响》(“Inactivation ofHuman Immunodeficiency Virus by Gamma Radiation and Its Effecton Plasma and Coagulation Factors”)，《输血》(Transfusion)31：32-29(1991)一文中也指出：“伽马照射不可能成为血浆和血浆衍生制品的消毒方法，因为在血浆成分的生物活性能够恢复的辐射剂量下，病毒的传染性并不能得到有效降低。”实施例11
在本实验中，我们按照0.5kGy/小时的剂量率对红血球进行7.5到90分钟的照射，以去除细菌污染物。
方法
从健康的捐血者的EDTA中提取红血球，用CPD溶液清洗三遍，并重新悬浮进DPC中，根据初始血液体积，按1∶20的比例进行稀释。然后将细胞悬浮液分装进14个试管。向其中的7个试管中添加大约1.0×104的表皮葡萄球菌(Straphylococcus epidermidia)。将细胞放在冰上并运送到照射装置。将所有的试样置于环境温度下的辐照箱中，以0.5kGy/小时的剂量率进行照射，总剂量分别为0.625、0.125、0.250、0.375、0.500和0.750kGy。在各时间点移开并搅动试样，然后将其放在冰上，运送到微生物实验室或血液学实验室进行分析。
结果
表10为微生物化验结果。
                        表10
  辐射剂量(kGy)     时间(分钟)     存活数量
    0     92,200
    0.625     7.5     84,500
    0.125     15     35,000
    0.250     30     10,067
    0.375     45     1,800
    0.500     60     250
    0.750     90     0
因此，0.75kGy的剂量使细菌存活量减少4.5log10这是一个重要的血液安全系数。此外，D10值约为0.125kGy，与其他文献中报道的葡萄球菌相似物质的各项数值相吻合(B.A.Bridges，《N-乙基马来酰胺对细菌的放射敏感度的影响》(“The Effect of N-Ethylmaleimideon the Radiation Sensiviity of Bacteria”)J.Cen.Microbiol.26：467-472(1962)，和Jacobs，G.P.和Sadeh，N.《羟基苯甲酸所导致的金黄色葡萄球菌放射敏化作用》(Radiosensitization ofStaphyloccocus Aureus by p-Hydroxybenzoic Acid”)Int.J.Radiat.Biol.41：351-356(1982)。
为了说明红血球在照射方法之后仍然具有活力，我们测定了细胞的以下参数：白血球(WBC)、中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞。这些参数仅计算细胞数量。当然，所有有核细胞可通过实施辐射剂量进行去活化。表11列举了我们监测的其他的红血球参数。即使经过了0.75kGy的辐射剂量，正铁血红蛋白值仍然保持不变，与控制试样相同。该实验说明，可以采用本方法在室温下对红血球进行剂量为0.75kGy的安全照射，而细胞功能不受损失。实施例12
本实验采用实施例11的方法进行，目的是证实实施例11的发现，并详细阐述测量的某些参数。本实验的结果参看表12。
结果(见以下表12)
这些结果证实了先前的结果，并且意味着红血球可接受足够剂量的辐射，使细菌数量减少4.5log10。
可以预料，未来对血小板的实验也将得到类似的结果。因此，无需，或只需进行很少的额外操作，并且无需添加外来物质就可利用本方法处理红血球，并提供在细菌学上安全的制品，进而降低接受辐射的物质发生不良反应的风险。
                                 表11
                  接受一定辐射剂量照射后的红血球功能值
参数                          总剂量(kGy)
    全血     0     0.625     0.125     0.250     0.500
    RBC     5.06     1.49     1.27     1.77     1.73     1.43
    HGB     153     43     41     56     56     46
    HTC     .483     .142     .120     .156     .163     1.31
    MCV     95.5     95.6     94.3     94.2     93.7     32.1
    MCH     31.2     31.1     32.2     31.7     32.2     32.5
    MCHC     327     325     341     336     344     353
    RDW     13.93     12.1     12.7     12.9     12.9     13.2
    METHgB     0.9     0.3     0.3     0.3     0.0     0.9
                                    表12
                 接受一定辐射剂量照射后的红血球功能值
参数                                     总剂量(kGy)
    0    0.625     0.125    0.250     0.375     0.555   0.750
    HGB     1.8    1.7     1.8    1.7     2.0     2.0   2.0
    ％O     96.6    96.5     96.2    96.3     96.4     96.5   96.0
    ％CO     1.0    1.2     1.6    1.3     1.7     1.5   1.5
    ％NET     0.5    0.5     -0.5    0.4     -0.2     0.4   0.8
    ％Reduced     1.9    1.9     2.7    2.4     3.2     1.7   1.7
    p60(mm Hg)     34    nd     nd    Nd     nd     nd   nd
    Hill系数     2.1    nd     nd    Nd     nd     nd   nd
nd＝未测出高铁血红蛋白含量误差为±2％；在p50情况下为±4％(置信度95％)实施例13
在本实验中，我们通过将冻干抗胰岛素单细胞抗体暴露于45kGy的低剂量伽马辐射来评估某些稳定剂的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、蛋氨酸和硫辛酸。
方法
在2ml玻璃小试管中，将总容积为0.5ml，含有50μg抗胰岛素单细胞抗体、5mg牛血清白蛋白(1％)和无稳定剂或50mM稳定剂的试样冻干。在真空状态中将试样塞紧。用伽马射线照射试样(总剂量45kGy，剂量率1.83kGy/小时，温度4℃)，然后用水重组。
用标准ELISA规程测定独立副样的抗体结合活性：96孔微滴定板，用2.5μg/ml的胰岛素抗原覆盖一夜。采用从5μg/ml开始的抗胰岛素单细胞抗体试样的三重连续稀释液。使用50ng/ml的与磷酸酶共轭的山羊抗小鼠Ig。在DEA缓冲液中使用1mg/ml的∑104碱性磷酸酶基质。通过405-620nm的吸收率测定结合活性。
通过估算接受照射的试样的滴定曲线相对于未接受照射试样的位移(即：观察到同样结合量所需的抗体浓缩)来测定相对保护作用，未接受照射试样处于未接受照射试样的最大吸收率标志的约50％处。
结果
不含稳定剂的冻干试样在经受45kGy的伽马照射后保持50％的抗体活动性。这一结果与先前45kGy伽马照射几乎破坏了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的结果形成了对照。因此，显而易见，通过冻干减少残留水分可非常有效地保护蛋白质。
添加抗坏血酸钠使试样在接受照射之后能够完全恢复其活性。经过与未接受照射的试样相比可以发现，蛋氨酸和硫辛酸也能充分恢复活性(76-83％)。实验结果如图1和2所示。实施例14
在本实验中，我们通过将冻干抗胰岛素单细胞抗体暴露于45kGy的低剂量伽马辐射来评估某些稳定剂的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽以及尿酸/trolox混合物和抗坏血酸/尿酸/trolox混合物。
方法
在3ml玻璃小试管中，将总容积为1.0ml，含有100μg抗胰岛素单细胞抗体、10mg牛血清白蛋白(1％)和无稳定剂或稳定剂的试样冻干。在真空状态中将试样塞紧。用伽马射线照射试样(总剂量45kGy，剂量率1.83kGy/小时，温度4℃)，然后用1.0ml水重组。
用标准ELISA规程测定独立副样的抗体结合活性：96孔Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰岛素抗原覆盖一夜。采用从5μg/ml开始的抗胰岛素单细胞抗体试样的三重连续稀释液。使用50ng/ml的与磷酸酶共轭的山羊抗小鼠Ig。通过405-620nm的吸收率测定结合活性。
采用平行线分析软件包(PLA 1.2，Stegmann Systemberatung)测定相对保护作用。
结果
不含稳定剂的冻干试样在经受45kGy的伽马照射后保持70％的抗体活动性。这一结果不同于先前45kGy伽马照射几乎破坏了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的结果。因此，显而易见，通过冻干减少残留水分可非常有效地保护蛋白质。
添加抗坏血酸钠使试样在接受照射之后使活性增加恢复20％，即：照射之后，活动性恢复90％。其他稳定剂恢复活性77-84％。实验结果如图3A-3C所示。实施例15
在本实验中，我们测定首次冻干(制品中仍留有相对“高水分”)和二次冻干(使制品只含“低水分”)对单细胞抗体敏感度的效果。
方法
在3ml玻璃小试管中，将总容积为1.0ml，含有100μg抗胰岛素单细胞抗体(mAb)、10mg牛血清白蛋白(1％)和无稳定剂或100mM稳定剂的试样冻干。在真空状态中将试样塞紧。用伽马射线照射试样(总剂量45kGy，剂量率2.03到2.13kGy/小时之间，温度4℃)，然后用1.0ml水重组。
用标准ELISA规程测定独立副样的抗体结合活性：Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰岛素抗原覆盖一夜。采用从5μg/ml开始的抗胰岛素单细胞抗体试样的三重连续稀释液。使用50ng/ml的与磷酸酶共轭的山羊抗小鼠Ig。通过405-620nm的吸收率测定结合活性。
结果
不添加稳定剂时，已经经过二次“低水分”干燥期的抗胰岛素mAb在照射之后的恢复度更好，即：在不添加稳定剂的情况下，较低的总水分含量可改善恢复度。
然而，在添加稳定剂时，抗体在经过45kGy照射后具有非常好的恢复度，无论是仅经过首次“高水分”干燥期的试样还是经过了二次“低水分”干燥期的试样。
本实验的结果如图4所示。实施例16
在本实验中，我们测定冻干和/或添加稳定剂对因子VIII活性的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、尿酸钠、trolox、抗坏血酸/trolox混合物、抗坏血酸/尿酸/trolox混合物、尿酸/trolox混合物、抗坏血酸/尿酸混合物。
方法
在真空状态中将试样冻干并塞紧。用伽马射线照射试样(总剂量45kGy，剂量率1.9kGy/小时，温度4℃)，然后用水重组。试样中因子VIII活性可利用MLA Electra 1400C自动凝固分析仪进行单级凝结化验来测算。
结果
在不添加稳定剂时，冻干试样在照射之后，因子VIII恢复良好(未照射的控制试样的69-88％)。在添加稳定剂时，照射后的因子VIII的恢复度与不添加稳定剂时相似(未照射的控制试样的69-89％)。
但是，稳定剂与冻干结合可以使因子VIII恢复到未照射的控制试样的83-90％(抗坏血酸钠+冻干：恢复度90％；trolox+冻干：恢复度84％；尿酸钠+冻干：恢复度83％)。本实验结果如图5所示。实施例17
在本实验中，我们通过将液体或冻干抗凝血酶III(ATIII)暴露于25kGy的低剂量伽马辐射来评估某些稳定剂的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠(200Mm)。
方法
单独照射ATIII，或添加抗坏血酸作为稳定剂。可通过以下步骤与稳定剂混合：(i)将ATIII与稳定剂混合成液体，然后冻干混合液，并在真空状态下塞紧；或(ii)在当ATIII和稳定剂均为干燥粉末时将两者混合(即：各自事先分别冻干)。
照射(总剂量25kGy，剂量率1.8kGy/小时)之后，用水将冻干抗凝血酶III粉末(∑A9141，批号113H9316)+抗坏血酸重组为40U/ml的浓缩液。照射之后，将液体和重组的干ATIII粉末试样(+抗坏血酸)在水中稀释到20U/ml。备制凝血酶(1U/ml)和肝素(800U/ml)水溶液。
在预先冷冻的96孔板化验中，备制ATIII试样的双重连续稀释液。在每个孔中添加肝素(25μl 800U/ml溶液)或水，然后在37℃的温度下保温培育。添加凝血酶(50μl 1U/ml溶液)，再在37℃的温度下保温培育。
然后添加100μl水中的1600μM凝血酶基质(基质的最终浓缩液为800μM)，随后在环境温度下保温培育。我们通过在添加基质后的固定时间测量405-620nm之间的吸收率来测定活性。
结果
当接受25kGy的低计量率伽马照射时，在不添加稳定剂的情况下，液体ATIII丧失了所有凝血酶抑制活性。但是，在添加抗坏血酸钠的情况下，液体ATIII在照射之后保持了55-66％的活性。
当接受25kGy的低计量率伽马照射时，在添加干粉末稳定剂的情况下，干粉末ATIII尽丧失43％的活性。
本实验的结果如图6所示。实施例18
在本实验中，我们某些稳定剂对冻干抗胰岛素单细胞抗体的活性的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠、trolox/抗坏血酸/尿酸混合物、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。
方法
冻干，并在真空状态下塞紧添加了1％人类血清白蛋白(以及5％蔗糖，可选)的抗胰岛素单细胞抗体，然后照射试样(总剂量45kGy，剂量率1.83到1.88kGy/小时之间)采用上述的标准ELISA规程测定抗体结合活性。
结果
以45kGy的剂量照射添加了1％HSA的抗胰岛素单细胞抗体导致其活动性平均损失约33％。添加下列稳定剂可明显改善恢复度：20mM抗坏血酸钠(恢复度100％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗坏血酸(恢复度87％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢复度82％)以及20mM谷胱甘肽(恢复度76％)。
以45kGy的剂量照射添加了1％蔗糖的含有1％HSA的抗胰岛素单细胞抗体导致其活动性平均损失约30％。添加下列稳定剂可明显改善恢复度：20mM抗坏血酸钠(恢复度88％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗坏血酸(恢复度84％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢复度72％)以及20mM谷胱甘肽(恢复度69％)。
这些实验的结果如图7-14所示。实施例19
在本实验中，我们测定当试样经受高剂量率(30kGy/小时)照射时，稳定剂(抗坏血酸)对冻干抗胰岛素单细胞抗体的活性的保护效果。
方法
冻干抗胰岛素单细胞抗体，并以的30kGy/小时的剂量率对其进行照射(总剂量45kGy)。采用上述的标准ELISA规程测定抗体结合活性。
结果
以45kGy的剂量照射冻干抗胰岛素单细胞抗体导致其活动性平均损失约32％。添加20mM抗坏血酸钠可将活性恢复到未照射试样的85％。本实验的结果如图15所示。实施例20
在本实验中，我们对添加稳定剂的冻干凝血酶进行照射。
方法
在环境温度下对低剂量率试样进行伽马照射，剂量率0.326kGy/小时，总剂量45kGy。在环境温度下对高剂量率试样进行伽马照射，剂量率30kGy/小时，总剂量45kGy。
照射结束之后，用500μl 50％甘油溶液重组所有样品，形成100U/ml的浓缩液，然后将其稀释到0.5U/ml。随后再使用SAR-Pro-Arg-PNA基质，根据标准呈色化验测定凝血酶的活性。
通过Sigma Plot2000程序，将单一矩形双曲线符合度公式(singular rectangular hyperbolic fit equation)用于每组平均数据来测定凝血酶Vmax和Km值。还可通过在MLA1400C分析仪上进行凝结时间化验来测定凝血酶活性。
结果
计算出的在环境温度下接受30kGy/小时照射的凝血酶的Vmax值为0.216，未照射的控制试样的Vmax值是0.287，这意味着凝血酶活性恢复度为77％。
计算出的在环境温度下接受0.326kGy/小时照射的凝血酶的Vmax值为0.189，未照射的控制试样的Vmax值是0.264，这意味着凝血酶活性恢复度为72％。对低剂量试样进行的凝结时间化验显示，其相对功效(relative potency)是未照射的控制试样的74％。
本实验的结果如图16所示。实施例21
在本实验中，我们以低剂量率照射添加或不添加稳定剂的特别用于鼠IgG3的IgM单细胞抗体。
方法
照射液体抗鼠IgG3单细胞IgM抗体(在含10mM叠氮化钠的PBS缓冲液中；抗体浓度为666μg/μl)，剂量率1.8kGy/小时，总剂量为10kGy或45kGy。试样不含稳定剂，或者含有包括20mM柠檬酸、300μM尿酸和200mM抗坏血酸的稳定剂混合物。
使用鼠IgG3作为覆盖抗原，以及与磷酸酶共轭的抗白鼠IgM检验抗体，根据标准ELISA规程分析抗体活性。
结果
在接受总剂量为10kGy或45kGy的伽马照射后，不含稳定剂的液体试样丧失了所有功能性抗体活性。但是，如果添加稳定剂混合物，接受10kGy伽马照射后，活性可完全恢复，接受45kGy伽马照射后，活性恢复88％。本实验的结果图17所示。实施例22
在本实验中，我们对冻干或液体白蛋白试样进行伽马照射。
方法
对试样进行照射的总剂量为10kGy或40kGy。照射之后，用1.1ml化验缓冲液(50mMTris，Ph8.8；50mM NaCl；0.1％PEG8000)重组冻干试样。
使用280nmUV检验系统装置，根据尺寸排除柱(size-exclusioncolumn)色谱法(TSKgel G4000SW×l 30m×7.8mm；洗脱缓冲液0.1M磷酸钠pH6.5/0.1M硫酸钠；流率1ml/分钟)分析(冻干和液体)试样。
结果
在进行总剂量为10kGy的伽马照射后，从液体或冻干白蛋白试样中观察不到退化制品。尽管在进行总剂量为40kGy的伽马照射后，从液体白蛋白试样中观察到一些退化制品，但是在接受了总剂量为40kGy的伽马照射后的冻干试样中没有观察到这一现象。本实验的色谱分析结果如图18所示。实施例23
本实验测定蛋白病毒(可传播海绵状脑病物质)对低剂量率离子辐射的敏感度。
方法
在一个50ml聚丙烯试管中，将0.3ml含有10％匀浆(在瘙痒传染病临终期采集自叙利亚金地鼠的脑浆)的磷酸盐缓冲盐水添加进29.7ml白蛋白。对试样进行总剂量为30kGy或55kGy的照射(控制试样不照射)。
向刚断奶的叙利亚金地鼠的脑内注射50μl未稀释的试样。然后评估所有动物的瘙痒病症状，记录其摇晃步态、无法直立和临终条件(实施无痛致死的时机)。计算注射之后每种症状出现的天数。
结果
与未注射的控制试样相比，高剂量照射(55kGy)使三种症状终点的平均诱导时间(incubation time)延长了13到15天，这相当于病原体滴定下降大约2log10ID50。低剂量照射(30kGy)使诱导时间延长了8到13天，这相当于病原体滴定下降大约1log10ID50，依然明显低于未照射的控制试样。
对数据进行线性回归分析产生95％的置信区间(confidenceinterval)，这意味着在病原体滴定中病原体含量的真实减少量可能高达3.5log10ID50。实施例24
本实验评估冻干和/或添加稳定剂对45kGy照射后的凝血酶活性的保护效果。
方法
备制包含1％牛血清白蛋白的凝血酶试样，并将其冻干到希望的水分含量。将抗坏血酸钠作为稳定剂添加到一些试样的200mM浓缩液中。
然后用伽马射线照射所有试样(总剂量45kGy，剂量率2.03-2.13kGy/小时，温度4℃)，随后测量凝血酶的活性。
结果
在不添加稳定剂的情况下，只经过首次干燥期的照射试样的凝血酶活性恢复到67％。添加稳定剂将恢复度提高到86％。实验结果如图19所示。实施例25
在本实验中，我们通过将液体IVIG多细胞抗体暴露于45kGy伽马照射(1.8kGy/小时)来评估某些稳定剂的保护效果。测试的稳定剂为：抗坏血酸钠和抗坏血酸/N-乙酰半胱氨酸混合物。
结果
不含稳定剂的照射试样呈现以下活性损失：对于风疹病毒损失1log；对于腮腺炎病毒损失0.5-0.75log；对于CMV损失1log。与未照射的控制试样相比，含有稳定剂抗坏血酸钠和抗坏血酸/N-乙酰基-半胱氨酸混合物的照射试样的活性没有损失。
本实验的结果如图20-26所示。实施例26
本实验设计用来评估pH值对于添加稳定剂(抗坏血酸钠、尿酸钠或其混合物)的尿激酶(液体或冻干)在接受照射后的恢复度的效果。
方法
将尿激酶(1000U/ml)与200mM抗坏血酸钠和/或300μM混合，并添加各种pH值的35mM磷酸盐缓冲液。对所有试样按2kGy/小时的剂量率进行总剂量为45kGy的照射。
结果
含有抗坏血酸钠的冻干照射试样在pH值为5.5-7.8(包括)时呈现约88-90％的尿激酶活性恢复度。含有抗坏血酸钠的液体照射试样在pH值为5.5-7.8时呈现约65-70％的尿激酶活性恢复度。本实验如图26所示。
以上通过实施例对本发明进行了充分说明，在不脱离本发明的范围及其任何实施例的情况下，所属技术领域的技术人员当可在更广或等同的条件、模式和其他参数范围内实施本发明。本说明书中所提及的所有专利或文献均以引用方式并入本文中。

Claims (58)

1.一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，该方法包括：
(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护所述生物材料抵御所述离子辐射的水平；和
(ii)按有效剂量率用适当电离射线对所述生物材料照射一段有效时间，使所述生物材料得到消毒。
2.一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，该方法包括：
(i)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述生物材料抵御所述离子辐射；和
(ii)按有效剂量率用适当电离射线对生物材料照射一段有效时间，使所述生物材料得到消毒。
3.一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，该方法包括：
(i)向生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述生物材料抵御所述离子辐射；和
(ii)按低剂量率用适当电离射线对生物材料照射一段有效时间，使所述生物材料得到消毒。
4.一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，该方法包括：
(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护所述生物材料抵御所述离子辐射的水平；和
(ii)按低剂量率用适当电离射线对所述生物材料照射一段有效时间，使所述生物材料得到消毒。
5.一种用于消毒对离子辐射敏感的生物材料的方法，该方法包括：
(i)将生物材料的溶剂残留量减低到足以有效保护所述生物材料抵御所述离子辐射的水平；
(ii)向所述生物材料中添加至少一种稳定剂，其剂量应足以有效保护所述生物材料抵御所述离子辐射；和
(iii)按有效剂量率用适当电离射线对所述生物材料照射一段有效时间，使所述生物材料得到消毒，其中步骤(i)和(ii)按颠倒顺序实施。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其步骤进一步包括，在实施所述照射所述生物材料的步骤之前减少所述生物材料中溶剂残留量。
7.根据权利要求1、4、5或6所述的方法，其中所述溶剂为水。
8.根据权利要求1、4、5或6所述的方法，其中所述溶剂为有机溶剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述残留水量通过添加一种有机溶剂来减少。
10.根据权利要求1-9所述的方法，其中所述生物材料在减少了所述溶剂残留量之后悬浮在一种有机溶剂中。
11.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为血液或血液成分。
12.根据权利要求1-11所述的方法，其中所述生物材料为蛋白质材料。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述蛋白质材料为血液成分。
14.根据权利要求1-13所述的方法，其中所述生物材料为凝血因子。
15.根绝权利要求14所述的方法，其中所述凝血因子选自：凝血因子、因子II、因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子XIIIa、冯威乐布兰氏因子和血纤维蛋白原。
16.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料选自：白蛋白、尿激素、多细胞免疫球蛋白、单细胞免疫球蛋白，以及一种或更多种多细胞和/或单细胞免疫球蛋白混合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白为免疫球蛋白G、免疫球蛋白M及其混合物。
18.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为哺乳动物组织或经处理的哺乳动物组织成分。
19.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为骨骼或经处理的骨骼成分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物材料为去矿质骨基质。
21.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为重组制造的生物材料。
22.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为转基因生物材料。
23.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为食物或植物制品。
24.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为碳水化合物或多糖。
25.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料选自：几丁质、几丁多糖、NOCC-几丁多糖及其衍生物。
26.根据权利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料为细胞代谢制品。
27.根据权利要求1-26所述的方法，其中所述有效剂量率不大于约3.0kGy/小时。
28.根据权利要求1-26所述的方法，其中所述有效剂量率不大于约2.0kGy/小时。
29.根据权利要求1-26所述的方法，其中所述有效剂量率不大于约1.0kGy/小时。
30.根据权利要求1-26所述的方法，其中所述有效剂量率不大于约0.3kGy/小时。
31.根据权利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效剂量率不大于约3.0kGy/小时。
32.根据权利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效剂量率不小于约6.0kGy/小时。
33.根据权利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效剂量率不小于约18.0kGy/小时。
34.根据权利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效剂量率不小于约30.0kGy/小时。
35.根据权利要求1-34所述的方法，其中所述生物材料保持在低氧环境中。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物材料保持在氩气中。
37.根据权利要求1，4-36所述的方法，其中所述溶剂残留量通过冻干来减少。
38.根据权利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶剂残留量少于约10.0％。
39.根据权利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶剂残留量少于约5.0％。
40.根据权利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶剂残留量少于约2.0％。
41.根据权利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶剂残留量少于约1.0％。
42.根据权利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶剂残留量少于约0.5％。
43.根据权利要求1-42所述的方法，其中在实施所述照射所述生物材料的步骤之前向所述生物材料中添加至少一种敏化剂。
44.根据权利要求1-43所述的方法，其中所述生物材料包含至少一种蛋白病毒作为生物污染物。
45.根据权利要求1-43所述的方法，其中所述生物材料包含至少一种病毒作为生物污染物。
46.根据权利要求1和4所述的方法，其中在实施所述照射所述生物材料的步骤之前向所述生物材料中添加至少一种稳定剂。
47.根据权利要求2，3，5-46所述的方法，所述至少一种稳定剂为抗氧化剂。
48.根据权利要求2，3，5-47所述的方法，所述至少一种稳定剂为自由基净化剂。
49.根据权利要求2，3，5-47所述的方法，所述至少一种稳定剂可减少由活性氧物质引起的破坏。
50.根据权利要求2，3，5-47所述的方法，所述至少一种稳定剂为下列中的一种：抗坏血酸，或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧基酸；尿酸，或其盐或酯；蛋氨酸；组氨酸；N-乙酰基-半胱氨酸；以及两种或更多种所述稳定剂的混合物。
51.根据权利要求50所述的方法，所述两种或更多种所述稳定剂的混合物为下列中的一种：抗坏血酸，或其盐或酯与尿酸，或其盐或酯的混合物；抗坏血酸，或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧基酸的混合物；抗坏血酸，或其盐或酯、尿酸，或其盐或酯与6-羟基2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧基酸的混合物；以及尿酸，或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧基酸的混合物。
52.根据权利要求1-51所述的方法，其中所述离子辐射为微粒辐射或电磁辐射，或两者的混合。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述电磁辐射为下列中的一种：无线电波、可见和不可见光、紫外光、X光射线和伽马射线。
54.根据权利要求1-51所述的方法，其中所述的离子辐射为伽马辐射。
55.根据权利要求1-51所述的方法，其中所述的离子辐射为电子束辐射。
56.根据权利要求1-51所述的方法，其中所述的离子辐射为可见光。
57.根据权利要求1-51所述的方法，其中所述的离子辐射为紫外光。
58.根据权利要求1-51所述的方法，其中所述的离子辐射为X光辐射。
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