CN108490189A - 检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法及试纸条制备方法 - Google Patents

检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法及试纸条制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法及试纸条的制备方法，其中，本检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法包括：阴性对照培养管、阳性对照培养管、测试培养管、荧光定量检测试纸条和检测器；其中，阴性对照培养管为含有抗凝血物质的培养管；阳性对照培养管为含有抗凝血物质和细胞凝集素的培养管；测试培养管为含有抗凝血物质和结核分枝杆菌特异性刺激抗原的培养管；荧光标记物为量子点微球；检测器为荧光检测器。本发明采用γ‑干扰素体外释放方法，特异性强，灵敏度高，操作简单，适用于批量样本的检测。

Description

检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法及试纸条制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于量子点微球定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所导致的慢性传染病，是造成人类死亡人数最多的疾病之一，严重威胁着人类健康。当前全球1/3的人感染结核分枝杆菌，每年有800万新发结核病患者，有300万人死于结核病，是全世界由单一致病菌导致死亡人数最多的疾病。我国结核患者数量居全球第二位，是结核高负担国家之一。由于结核感染后大部分发展成为无症状感染者，而无症状感染者在免疫能力低下等情况下较易发展成活动性结核。因此，结核病的早期诊断和治疗将极大地影响着我国结核病预防和控制效果。
目前我国临床诊断结核病的金标准为结核分枝杆菌培养，但由于培养时间较长(2-6周)，难以满足临床需求。另外，结核病还可以通过影像学、结核菌素皮肤实验(tuberculin skin test，TST)、分子生物学等方法确认，但是这些方法存在若干缺陷，例如患者免疫功能低下导致实验假阴性、接种卡介苗引起假阳性、实验操作繁琐、肺外结核病人取样困难等，限制了其在临床的应用。近年来，出现了一种更敏感更特异的血液检测方法—γ-干扰素释放实验(Interferon-γrelease assays，IGRA)。IGRA的原理为：机体感染结核杆菌后，血液中的T淋巴细胞会在再次接触结核杆菌特异性抗原时，产生和分泌相应的细胞因子(IFN-γ)，通过定量检测IFN-γ的浓度判断个体是否感染结核分支杆菌。该方法特异性高，取样简单，速度较快，适用于临床应用。
目前市场上利用IGRA原理的检测方法主要是酶联免疫斑点测定(ELISPOT)法和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法两种。ELISPOT方法在抽取病人血样后需要进行淋巴细胞分离计数，操作复杂；ELISA方法需要制作标准曲线，操作耗时较长，且不适于单份样本的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于量子点微球定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的层析方法，将量子点微球作为荧光标记物，充分利用量子点微球的产率高、荧光强、光化学稳定性好、不易猝灭、可以接受长时间反复激发的优点，因而该检测方法灵敏度高、特异性好、准确性强、操作简便，适用于临床检测。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种荧光免疫层析方法，包括：阴性对照培养管、阳性对照培养管、测试培养管、荧光定量检测试纸条和检测器；其中阴性对照培养管为含有抗凝血物质的培养管；阳性对照培养管为含有抗凝血物质和细胞凝集素的培养管；测试培养管为含有抗凝血物质和结核分枝杆菌特异性刺激抗原的培养管；荧光标记物为量子点微球；检测器为荧光检测器。
进一步，所述荧光免疫层析方法还包括：在阴性对照培养管、测试培养管、阳性对照培养管中分别加入血样，并使血样与各培养管中的物质充分混合均匀后静置，以吸取相应培养管中的上清液；将各上清液分别加入相应样本缓冲液混合后，加入到荧光定量检测试纸条的加样孔中，由荧光检测器进行检测。
进一步，所述结核分枝杆菌特异性刺激抗原为ESAT6和CFP10的独立蛋白混合或ESAT6和CFP10的融合蛋白。
进一步，所述抗凝血物质为肝素钠和/或肝素锂。
进一步，所述细胞凝集素为植物凝集素和/或刀豆凝集素。
又一方面，本发明还提供一种荧光定量检测试纸条的制备方法，包括：荧光微球标记物制备；样品垫的处理；制备检测线和质控线；以及荧光定量检测试纸条的组装。
进一步，所述荧光微球标记物制备包括：结核分枝杆菌γ干扰素量子点荧光微球标记物的制备；和兔IgG量子点荧光微球标记物的制备。
进一步，制备检测线和质控线的方法包括：将结核分枝杆菌γ干扰素包被抗体固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将羊抗兔二抗固定于硝酸纤维素膜上作为质控线。
进一步，所述样品垫的处理方法包括：用含有蔗糖和RBC的Tris缓冲液浸泡玻璃纤维素膜2-4h，然后置于37℃鼓风干燥箱中烘烤16-24小时至完全干燥，置于干燥环境中保存备用；其中样品垫材质为玻璃纤维素膜。
进一步，所述荧光定量检测试纸条的组装方法包括：在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，并剪切成4mm宽的试纸条装入卡壳中，即成为结核分枝杆菌γ干扰素免疫荧光定量检测试纸条。
本发明的有益效果是，本发明的基于量子点微球定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的荧光免疫层析方法以血液为检测样本，可有效解决肺外结核取样困难的问题，且特异性强，灵敏度高，操作简单，不需专业培训，适用于临床检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的荧光定量检测试纸条的标准工作曲线图。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
本发明提供了一种基于量子点微球定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的荧光免疫层析方法，包含有阴性对照培养管、阳性对照培养管、测试培养管、荧光定量检测试纸条和检测器。阴性对照培养管为含有抗凝血物质的培养管；阳性对照培养管为含有抗凝血物质和细胞凝集素的培养管；测试培养管为含有抗凝血物质和结核分枝杆菌特异性刺激抗原的培养管；荧光标记物为量子点微球；检测器为荧光检测器。
进一步，所述荧光免疫层析方法还包括：在阴性对照培养管、测试培养管、阳性对照培养管中分别加入血样，并使血样与各培养管中的物质充分混合均匀后静置，以吸取相应培养管中的上清液；将各上清液分别加入相应样本缓冲液混合后，加入到荧光定量检测试纸条的加样孔中，由荧光检测器进行检测。
在本发明一优选但非限制的实施例中，结核分枝杆菌特异性刺激抗原为ESAT6和CFP10的独立蛋白混合或ESAT6和CFP10的融合蛋白。
在本发明一优选但非限制的实施例中，抗凝血物质为肝素钠和/或肝素锂。
在本发明一优选但非限制的实施例中，细胞凝集素为植物凝集素和/或刀豆凝集素。
本发明以血液为检测样本，可有效解决肺外结核取样困难的问题，采用γ-干扰素体外释放方法，特异性强，灵敏度高，操作简单，便于大量样本的检测。
实施例1
基于量子点微球定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的荧光免疫层析方法，包括如下步骤：
(1)IFN-γ的体外释放
①血样采集：采用静脉穿刺技术，使用经过无菌处理的抗凝血样采集管(抗凝物质为肝素钠和/或肝素锂)抽取血样4.0ml以上。
②全血分装：在血样离体8小时以内，在阴性对照培养管(N管)、测试培养管(T管)、阳性对照培养管(P管)中分别加入1.0ml的全血，上下颠倒8-10次，使血样与培养管中的物质充分混合均匀。
③培养：将分装好的血样迅速放置于37℃恒温培养箱中，孵育20-24小时，培养过程中保持血样培养管处于竖直状态。
④收集：培养结束后，将培养管竖直放置于平整的桌面上，静置1分钟后分别从阴性对照培养管(N管)、测试培养管(T管)、阳性对照培养管(P管)中吸取上清液。
(2)IFN-γ的检测
①打开配套的荧光免疫分析仪，使其开机自检，确保仪器处于正常工作的状态，然后插入本批次产品所对应的标准曲线IC卡，读取标准曲线参数。
②按照阴性对照培养管(N管)、测试培养管(T管)、阳性对照培养管(P管)的顺序，分别吸取25微升的上清液样本加入样本缓冲液中，并反复抽吸混匀10次以上，保证样本与样本缓冲液混合均匀。
③取3张检测卡，平放于桌面上。按照阴性对照培养管(N管)、测试培养管(T管)、阳性对照培养管(P管)的顺序，分别取100微升混匀后的样本加入到检测卡的加样孔中。
④将各检测卡静置15分钟，反应结束后按照阴性对照培养管(N管)、测试培养管(T管)、阳性对照培养管(P管)的顺序，分别插入荧光检测仪中进行检测并判定阴阳性，其判定标准如表1所示。
表1阴阳性判定标准
实施例2
定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的荧光定量检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)荧光微球标记物的制备
①结核分枝杆菌γ干扰素量子点荧光微球标记物的制备
取量子点荧光微球100μL，先后加入30μL 0.5mg/mL的碳二亚胺(EDC)和60μL0.5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温置于旋转摇床上活化15min，然后18000rpm离心10分钟，去除上清溶液。随后用硼酸缓冲液复溶，超声处理20-40s，加入50μg的结核分枝杆菌γ干扰素标记抗体，室温置于旋转摇床上偶联1小时，加入10％的BSA溶液50μL封闭过夜，最后18000rpm离心10分钟，用pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2-3次，然后超声处理20-40s，保存于储存液中，置于4℃冰箱中保存备用。其中，储存液的成分为PB、BSA、Tween-20、葡萄糖、甘氨酸、PEG4000和Proclin300。
②兔IgG量子点荧光微球标记物的制备
取量子点荧光微球100μL，先后加入30μL 0.5mg/mL的碳二亚胺(EDC)和60μL0.5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温置于旋转摇床上活化15min，然后18000rpm离心10分钟，去除上清溶液。随后用硼酸缓冲液复溶，超声处理20-40s，加入100μg的兔IgG，室温置于旋转摇床上偶联1小时，加入10％的BSA溶液50μL封闭过夜，最后18000rpm离心10分钟，用pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2-3次，然后超声处理20-40s，置于4℃冰箱中保存备用。
(2)样品垫的处理
①样品垫的处理：用含有蔗糖和RBC的Tris缓冲液浸泡玻璃纤维素膜2-4h，然后置于37℃鼓风干燥箱中烘烤16-24小时至完全干燥，置于干燥环境中保存备用。
②荧光标记物样品垫的制备：将γ干扰素抗体量子点荧光微球标记物和兔IgG量子点荧光微球标记物用复溶液分别稀释后，用喷金仪喷于处理烘干后的样品垫上，置于37℃鼓风干燥箱中烘干16-24小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用。所用的复溶液为：10mM Tris、3％BSA、20％蔗糖。
(3)制备检测线和质控线
将针对结核分枝杆菌γ干扰素的二抗(羊抗兔IgG多克隆抗体)和结核分枝杆菌γ干扰素包被抗体分别用包被液稀释至1mg/mL，用喷金划膜仪分别喷涂于硝酸纤维素膜表面作为质控线(C线)和检测线(T线)，将喷涂好的硝酸纤维素膜放入37℃鼓风干燥箱中烘干16-24小时，置于干燥环境中保存备用。其中，所用的包被液为：10mM PB、2％蔗糖、0.9％NaCl、0.03％Proclin300。
(4)荧光定量检测试纸条的组装。
在PVC底板上依次搭接地粘贴：喷有荧光微球标记物的样品垫、喷涂有检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜以及吸水纸，组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，装入卡壳中，然后装入有干燥剂的铝箔袋中。铝箔袋密封置于4-8℃、湿度约30％的条件下存放备用。
实施例3
结核分枝杆菌γ干扰素免疫荧光定量试纸条的性能评估，包括如下步骤：
(1)标准曲线的确定及精密度的验证
图1是本发明的荧光定量检测试纸条的标准工作曲线图。
如图1所示，用抗原稀释液对结核分枝杆菌γ干扰素重组抗原进行稀释，浓度分别为400pg/mL、300pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.125pg/mL九个浓度(作为理论值)，抗原稀释液为含有1％BSA的PB缓冲液。以T/C峰面积为X轴，理论值为Y轴绘制标准工作曲线，得到回归方程为：Y＝478.04X-13.552，拟合的系数为R2＝0.995，各浓度的检测变异系数均＜10％。
(2)准确度验证
如表2所示：用浓度为200pg/mL的血清样本作为基础样本，加入相同体积不同浓度的IFN-γ血清，配制成浓度不同的IFN-γ血清样品，再用另一份样本加入相同体积的阴性人血清，加入体积小于原体积的10％，对回收样本和基础样本重复4次检测，并进行计算，结果表明，回收率在90％～110％范围内。
表2准确度验证结果
实施例4
临床样本检测验证结果如表3所示，采集到临床样本306例，其中(1)痰菌培养确认为活动性结核病患者的静脉血，59例；(2)痰菌培养结果为阴性，但通过病理学、PPD等检查确认为活动性结核病患者的静脉血，28例；(3)非结核性疾病患者的静脉血，89例；(4)肺外结核患者的静脉血，23例；(5)结核杆菌低暴露风险人群、均无临床症状、无结核接触史、结核菌素试验结果为阴性的健康查体人群的静脉血，107例。见表4，按照上述实验步骤进行操作，用上述标准判读阴阳性，以临床诊断作为“金标准”，该荧光免疫层析方法在结核病组的阳性符合率为95.4％，非结核病组的阴性符合率为96.4％，符合产品设计要求。
表3 306例临床样本的分布
表4临床样本的符合率情况
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种荧光免疫层析方法，其特征在于，包括：
阴性对照培养管、阳性对照培养管、测试培养管、荧光定量检测试纸条和检测器；其中
阴性对照培养管为含有抗凝血物质的培养管；
阳性对照培养管为含有抗凝血物质和细胞凝集素的培养管；
测试培养管为含有抗凝血物质和结核分枝杆菌特异性刺激抗原的培养管；
荧光标记物为量子点微球；
检测器为荧光检测器。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，
所述荧光免疫层析方法还包括：
在阴性对照培养管、测试培养管、阳性对照培养管中分别加入血样，并使血样与各培养管中的物质充分混合均匀后静置，以吸取相应培养管中的上清液；
将各上清液分别加入相应样本缓冲液混合后，加入到荧光定量检测试纸条的加样孔中，由荧光检测器进行检测。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，
所述结核分枝杆菌特异性刺激抗原为ESAT6和CFP10的独立蛋白混合或ESAT6和CFP10的融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，
所述抗凝血物质为肝素钠和/或肝素锂。
5.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，
所述细胞凝集素为植物凝集素和/或刀豆凝集素。
6.一种荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括：
荧光微球标记物制备；
样品垫的处理；
制备检测线和质控线；以及
荧光定量检测试纸条的组装。
7.根据权利要求6所述的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，
所述荧光微球标记物制备包括：
结核分枝杆菌γ干扰素量子点荧光微球标记物的制备；和
兔IgG量子点荧光微球标记物的制备。
8.根据权利要求7所述的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，
制备检测线和质控线的方法包括：
将结核分枝杆菌γ干扰素包被抗体固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将羊抗兔二抗固定于硝酸纤维素膜上作为质控线。
9.根据权利要求8所述的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，
所述样品垫的处理方法包括：
用含有蔗糖和RBC的Tris缓冲液浸泡玻璃纤维素膜2-4h，然后置于37℃鼓风干燥箱中烘烤16-24小时至完全干燥，置于干燥环境中保存备用；
其中样品垫材质为玻璃纤维素膜。
10.根据权利要求9所述的荧光定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，
所述荧光定量检测试纸条的组装方法包括：
在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，并剪切成4mm宽的试纸条装入卡壳中，即成为结核分枝杆菌γ干扰素免疫荧光定量检测试纸条。
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