CN108486204A - 一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法，所述制备方法包括步骤：在双蒸水沸水中烹煮去毛和去脂后的袋鼠皮，采用蛋白酶对袋鼠皮进行酶解，得到酶解液；将酶解液离心分离，取上清液进行冷冻干燥，得到平均分子量为1KDa以下的袋鼠皮胶原蛋白肽。本发明制备袋鼠皮胶原蛋白肽的方法不仅可以提高袋鼠生产加工的附加值，同时可减少环境污染，获得良好的社会效益和经济效益。本发明的方法制备得到的袋鼠皮胶原蛋白肽在抗氧化、体外保湿、美白这三方面有显著效果，可以作为化妆品中的抗氧化剂、保湿剂和美白剂。

Description

一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法
技术领域
本申请涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的一类蛋白质，占体内总蛋白含量的25-33％。胶原蛋白作为动物结缔组织的主要组成成分，主要存在于动物皮、骨、肌腱等组织中，发挥支架作用和保护作用。胶原蛋白质结构和功能特点的多样性和复杂性，决定了其在许多领域的重要地位，以及良好的应用前景。
胶原蛋白肽是一种新型胶原蛋白类产品，是以胶原蛋白或富含胶原蛋白的物质为原料进行生产的。它是胶原蛋白在一定的外部条件下发生“水解”反应后得到的产物。所谓外部条件就是：“胶原蛋白”这一稳定的三元螺旋体在化学作用或在细菌、酶的作用下，发生分子链解体、断裂、在经过加工所得到的一种产物。它既具有胶原蛋白的特有氨基酸组成，又具有分子量小的特点。因此，它更容易透过表皮被真皮吸收，也容易通过消化道被消化，在日化、食品保健领域有很好的用途。
关于胶原蛋白肽的制备，目前多见于以鱼的皮、鳞、骨或猪、牛的皮和骨来源酶解处理获得胶原蛋白肽的研究。此外，在现有技术中，从原料中提取胶原蛋白时，通常需要对先通过酸解或酶解的方法提取胶原蛋白，然后再选择合适的蛋白酶将胶原蛋白酶解成小分子肽，最终得到胶原蛋白肽。胶原蛋白的分子量大，难溶于水，只溶于酸，胶原蛋白的溶解方式受到了很大的限制。因此，胶原蛋白的酶解需要在酸性条件下，这很大程度上影响了酶种类的选择，其酶解对pH的要求高，只有少数的酶(例如胃蛋白酶等酸性蛋白酶)可供选择。酶解的时间长，效果差，得率低，在提取工艺上较为繁琐。而以袋鼠皮为原料的胶原蛋白肽还少见报道。袋鼠皮的胶原纤维束与一般哺乳类动物皮的胶原纤维束相比，编织形式不同，大部分胶原纤维束平行于皮面呈波浪式层状编织，不同层次间相互交错连接，层与层之间的交错角小于90°，各部位胶原纤维的编织形式基本相同，袋鼠皮的弹性纤维较小，但分布比较均匀。由于其独特的纤维结构，不仅是很好的皮革用品，也是美容产品潜在的资源。目前，对袋鼠皮的研究还处于袋鼠皮胶和皮革品制作水平，对其开发尚不完全。因此对袋鼠皮的开发和应用将成为焦点和热点，同时会产生巨大的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明公开了一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在沸水中烹煮去毛和去脂后的袋鼠皮；
(2)采用蛋白酶对步骤(1)得到的袋鼠皮进行酶解处理，得到酶解液；
(3)将所述酶解液离心分离，取上清液进行干燥，得到袋鼠皮胶原蛋白肽。
在上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法的步骤(1)中，袋鼠皮在沸水中烹煮的时间为20-40分钟，所述沸水的用量为去毛和去脂后的袋鼠皮重量的10-30倍体积。水为以双蒸水为佳，因双蒸水杂质较少。当然，也可以使用其他洁净的水。
在上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法的步骤(1)中，沸水的用量优选为去毛和去脂后的袋鼠皮重量的15-25倍体积。
在上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法的步骤(2)中，所述蛋白酶可以为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的任一种。优选地，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰酶中的一种或多种，优选木瓜蛋白酶。更优选地，所述木瓜蛋白酶与所述袋鼠皮的重量比为1％-5％，更优选为2％。
发明尝试过将两种酶混合使用，以ABTS自由基清除率为指标，通过正交实验，得出最佳的混合酶的条件。但是由于混合酶酶解需要的时间长，过程繁琐，得出的效果与单用木瓜蛋白酶不相上下，因此最终只选用木瓜蛋白酶。最佳的酶解条件根据酶的种类各有不同。
在上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法的步骤(2)中，采用木瓜蛋白酶进行酶解时，酶解的条件为：木瓜蛋白酶与所述袋鼠皮的重量比为1-2％，pH为5.4-9.4，温度为40-55℃，酶解时间为2-5小时。酶解时间不能太短，太短则酶解不彻底。太长则不仅没必要，且对自由基的清除也会造成一定的负面影响。
在上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法的步骤(3)中，所述离心的条件为在室温环境下以4000-5000rpm的转速离心20-40分钟。
在上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法的步骤(3)中，所述干燥包括冷冻干燥和喷雾干燥，优选冷冻干燥。
本发明还公开了一种袋鼠皮胶原蛋白肽，所述袋鼠皮胶原蛋白肽由上述袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法制备。
如以上所述的袋鼠皮胶原蛋白肽，所述袋鼠皮胶原蛋白肽的平均分子量在1KDa以下。
本发明还公开了以上所述的袋鼠皮胶原蛋白肽作为化妆品中的抗氧化剂、美白添加剂和保湿剂的应用。
本发明还公开了一种用于化妆品的抗氧化剂、美白添加剂和保湿剂，所述抗氧化剂、美白添加剂和保湿剂包含以上所述的袋鼠皮胶原蛋白肽。
袋鼠皮含有胶原蛋白，通过现代酶学的生物技术适当的方法处理后，能获得优质的胶原蛋白肽。本申请公开的袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法，不同于以往处理原材料的复杂工序，而是跳过了从原料中提取胶原蛋白的工艺，直接对原料进行处理，获得了功效良好的优质胶原蛋白肽，达到了简化制备工艺的目的。本申请制备的袋鼠皮胶原蛋白肽不仅可以提高袋鼠生产加工的附加值，同时可减少环境污染，获得良好的社会效益和经济效益。实验表明，本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽在抗氧化、体外保湿、美白这三方面有显著效果。在以人HepG2肝癌细胞为过氧化氢建模细胞的实验中，本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对细胞抗氧化能力有所提高，对细胞内活性氧的清除具有很好的效果。本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽，在体外对酪氨酸酶有良好的抑制效果，并且能有效降低B16黑色素细胞中酪氨酸酶的活性，说明具有很好的美白功效。
附图说明
图1显示了以ABTS自由基清除率为指标，中性蛋白酶不同酶解条件下对ABTS清除能力的影响；
图2显示了以ABTS自由基清除率为指标，酸性蛋白酶不同酶解条件下对ABTS清除能力的影响；
图3显示了以ABTS自由基清除率为指标，碱性蛋白酶不同酶解条件下对ABTS清除能力的影响；
图4显示了以ABTS自由基清除率为指标，木瓜蛋白酶不同酶解条件下对ABTS清除能力的影响；
图5显示了以ABTS自由基清除率为指标，胃蛋白酶不同酶解条件下对ABTS清除能力的影响；
图6显示了以ABTS自由基清除率为指标，胰蛋白酶不同酶解条件下对ABTS清除能力的影响；
图7显示了不同蛋白酶最优酶解条件下对得率和ABTS清除率的影响；其中，横坐标为蛋白酶的种类(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶)，左右纵坐标分别为蛋白多肽得率和ABTS清除率；
图8显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽的MALDI-TOF MS图谱；
图9显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽的紫外吸收峰；
图10显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽的保湿能力，图中ABC所代表的袋鼠皮多肽加入的浓度分别为：A肽(低)10mg/ml；B肽(中)100mg/ml；C肽(高)1g/ml)；
图11至图13显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对体外酪氨酸酶的抑制作用；由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白多肽对酪氨酸酶二酚酶和单酚酶起到抑制，对二酚酶的抑制为不可逆抑制；图11显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对体外酪氨酸酶二酚酶的抑制，随着肽浓度的增加，酶的活力逐渐降低。图12显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对体外酪氨酸酶二酚酶的抑制类型，可看出抑制类型为不可逆抑制；图13显示了本申请的袋鼠胶原蛋白肽对体外酪氨酸酶单酚酶的抑制作用，随着肽浓度的升高，反应的时间延迟，反应的产物降低；
图14显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内增殖率影响；横坐标为不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽处理组(袋鼠皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL)，纵坐标为细胞存活率；
图15显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸活性的影响；横坐标为不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽处理组(袋鼠皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL)，纵坐标为细胞内酪氨酸活性的相对活力；
图16显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽的超氧阴离子自由基清除能力；每条曲线代表的袋鼠皮胶原蛋白肽浓度分别为(0、0.5、1、1.5μg/μL)；
图17显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对人肝癌HepG2细胞增殖率的影响；横坐标为不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽处理组(袋鼠皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL)，纵坐标为细胞相对增殖率；
图18显示了过氧化氢对人肝癌HepG2细胞形态的影响。图中A、B、C、D、E、F分别为A：正常值(不加任何药剂)；B：100μmol过氧化氢；C：200μmol/L过氧化氢；D：300μmol/L过氧化氢；E：400μmol/L过氧化氢；F：500μmol/L过氧化氢；
图19显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对过氧化氢损伤模型细胞形态的影响；图中A、B、C、D、E、F分别为：A：模型组(600μmol/L过氧化氢)；B：正常组；C：600μmol/L过氧化氢+0.1μg/μL肽；D：600μmol/L过氧化氢+0.2μg/μL肽；E：600μmol/L过氧化氢+0.3μg/μL肽；F:600μmol/L过氧化氢+0.4μg/μL肽)；
图20至图22显示了由本发明方法制备的袋鼠皮胶原蛋白肽对过氧化氢损伤人肝癌HepG2细胞活性氧簇含量(ROS)的影响；试验包括给药剂量分别为0μg/μL的对照组(图20)，600μmol/L H2O2+0.50μg/μL袋鼠皮多肽图21)，600μmol/L H2O2(图22)。G-MEAN值分别为105.6(图20)、118.94(图21)、221.3(图22)。
具体实施方式
中性蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究
将袋鼠皮剃毛后，用剪刀剪去肉眼可见的白色脂肪，洗净，沥干，然后取10g袋鼠皮，加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g中性蛋白酶(安徽合肥博美生产的酶活为100u/mg)，酶解温度50℃，酶解时间2h。酶解的pH值分别为4.4、5.4、6.4、7.4、8.4。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图1所示，说明对中性蛋白酶而言，pH值7.4时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
将袋鼠皮剃毛后，用剪刀剪去肉眼可见的白色脂肪，洗净，沥干，然后取10g袋鼠皮，加入15倍体积双蒸水(150mL)，电饭煲煲40min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g中性蛋白酶，酶解的pH为7.4，酶解时间2h。酶解温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图1所示，说明对中性蛋白酶而言，温度为50℃时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
将袋鼠皮剃毛后，用剪刀剪去肉眼可见的白色脂肪，洗净，沥干，然后取10g袋鼠皮，加入25倍体积双蒸水(250mL)，电饭煲煲30min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份调完最适pH7.4，加入0.1g蛋白酶，50℃中酶解。酶解时间为2h、3h、4h、5h、6h。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图1所示，说明对中性蛋白酶而言，时间为5h时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
将袋鼠皮剃毛后，用剪刀剪去肉眼可见的白色脂肪，洗净，沥干，然后取10g袋鼠皮，分别加入10、15、20、25、30倍体积双蒸水，电饭煲煲30min。待其冷却室温，搅碎。每份调pH7.4，每份加入0.1g蛋白酶，在50℃酶解5h，以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图1所示，说明对中性蛋白酶而言，料液比为1:10时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
酸性蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.2g酸性蛋白酶(安徽合肥博美生产的酶活为50u/mg)，酶解温度45℃，酶解时间2h。酶解的pH值分别为2.4、3.4、4.4、5.4、6.4。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图2所示，说明对酸性蛋白酶而言，pH值3.4-4.4时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.2g酸性蛋白酶，酶解的pH为3.4，酶解时间2h。酶解温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图2所示，说明对酸性蛋白酶而言，温度为35℃时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份调完最适pH3.4，加入0.2g蛋白酶，在35℃中酶解。酶解时间为2h、3h、4h、5h、6h。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图2所示，说明对酸性蛋白酶而言，酶解时间为6h时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)分别加入10、15、20、25、30倍体积双蒸水，电饭煲煲40min。。待其冷却室温，搅碎。每份调完最适pH3.4，加入0.2g蛋白酶(与袋鼠皮的重量皮为2％)，在35℃中酶解6h，以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图2所示，说明对酸性蛋白酶而言，料液比为1:20时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
碱性蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g碱性蛋白酶(安徽合肥博美生产的酶活为200u/mg)，酶解温度40℃，酶解时间2h。酶解的pH值分别为8.4、9.4、10.4、11.4、12.4。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图3所示，说明对碱性蛋白酶而言，pH值11.4时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g碱性蛋白酶，酶解的pH为11.4，酶解时间2h。酶解温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图3所示，说明对碱性蛋白酶而言，温度为40℃时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g碱性蛋白酶，酶解的pH为11.4，在40℃中酶解。酶解时间为2h、3h、4h、5h、6h。以水解产物清除ABTS自由基为指标。结果如图3所示。说明对碱性蛋白酶而言，酶解时间为4h酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)分别加入10、15、20、25、30倍体积双蒸水，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。每份加入0.1g碱性蛋白酶，酶解的pH为11.4，在40℃中酶解4h，以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图3所示，说明对碱性蛋白酶而言，料液比为1:15时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
木瓜蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g木瓜蛋白酶(生工生产的酶活为3500u/mg)，酶解温度55℃，酶解时间2h。酶解的pH值分别为5.4、、6.4、7.4、8.4、9.4。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图4所示，说明对木瓜蛋白酶而言，pH值7.4时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.3g木瓜蛋白酶，酶解的pH为6.4，酶解时间2h。酶解温度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图4所示，说明对木瓜蛋白酶而言，温度为50℃时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g木瓜蛋白酶，酶解的pH为6.4，50℃中酶解。酶解时间为2h、3h、4h、、5h、6h。以水解产物清除ABTS自由基为指标。结果如图4所示，对木瓜蛋白酶而言，酶解4h袋鼠皮酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)分别加入10、15、20、25、30倍体积双蒸水，电饭煲煲40min。待其冷却室温，搅碎。每份加入0.1g木瓜蛋白酶，酶解的pH为6.4，50℃中酶解，酶解4h，以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图4所示，说明对木瓜蛋白酶而言，料液比为1:20时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
胃蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g胃蛋白酶(生工生产的酶活为3500u/mg)，酶解温度35℃，酶解时间2h。酶解的pH值分别为2.4、3.4、4.4、5.4、6.4。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图5所示，说明对胃蛋白酶而言，pH值2.4时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.4g胃蛋白酶，酶解的pH为2.4，酶解时间2h。酶解温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图5所示，说明对胃蛋白酶而言，温度为35℃时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g胃蛋白酶，酶解的pH为2.4，35℃酶解。酶解时间为2h、3h、4h、5h、6h。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图5所示，说明对胃蛋白酶而言，时间为4h时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)分别加入10、15、20、25、30倍体积双蒸水，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。每份加入0.1g胃蛋白酶，酶解的pH为2.4，35℃酶解酶解4h，以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图5所示，说明对胃蛋白酶而言，料液比为1:20时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
胰蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g胰蛋白酶(生工生产的酶活为250u/mg)，酶解温度35℃，酶解时间2h。酶解的pH值分别为5.4、6.4、7.4、8.4、9.4。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图6所示，说明对胰蛋白酶而言，pH值6.4时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g胰蛋白酶，酶解的pH为6.4，酶解时间2h。酶解温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图6所示，说明对胰蛋白酶而言，温度为35℃时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干)加入20倍体积双蒸水(200mL)，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入0.1g胰蛋白酶，酶解的pH为6.4，35℃中酶解。酶解时间为2h、3h、4h、5h、6h。以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图6所示，说明对胰蛋白酶而言，时间为4h时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
10g袋鼠皮(剃毛后去脂、沥干的袋鼠皮)分别加入10、15、20、25、30倍体积双蒸水，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。每份加入0.5g胰蛋白酶，酶解的pH为6.4，35℃中酶解，酶解4h，以水解产物清除ABTS自由基为指标。如图6所示，说明对胰蛋白酶而言，料液比为1:20时酶解袋鼠皮的活性最高，酶解效果最好。
袋鼠皮胶原蛋白肽提取的条件优化
在中性、酸性、碱性、木瓜、胰蛋白酶的最适条件下，对袋鼠皮蛋白多肽进行提取。以多肽得率和ABTS清除能力为纵坐标，酶种类为横坐标作图。结果如图7显示，木瓜蛋白酶的酶解能力最好。
表1为木瓜蛋白酶酶解袋鼠皮的正交实验。以ABTS清除率为衡量指标，最优的提取条件是料液比为1:20，pH为6.4、加入2％(140000u)酶量，在55±0.5℃的温度下水解3小时±10分钟。
表1
袋鼠皮胶原蛋白肽的平均分子量测定
以50％CAN(乙腈)为溶剂配制0.1％TFA(三氟乙酸)，取1ml超声重溶肽粉。吸取1μL重溶的肽溶液和1μLα-HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质溶液混匀点于质谱仪样品靶上，待样品基质挥发结晶后，用基质辅助激光分析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)进行上机分析。
袋鼠皮胶原蛋白肽的金属元素分析
称取0.2g袋鼠皮胶原蛋白肽粉，加入8mL 65％-68％硝酸静置30min。微波消解3小时后，静置冷却。用双蒸水定容至250mL，使硝酸最终浓度至2％-3％。
ICP-MS(电感耦合等离子体质谱)进行金属元素分析，表2显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽金属元素的含量。
表2
袋鼠皮胶原蛋白肽的氨基酸分析
称取10g袋鼠皮胶原蛋白肽粉，采用GB5009.124-2016的方法，分析氨基酸总量及16种氨基酸的含量。表3显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽氨基酸总量及16种氨基酸的含量。
表3
实施例1
取10g沥干的袋鼠皮，剃毛。剪成1cm*1cm左右的小块，加入20倍体积(200ml)双蒸水，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。调节pH6.4，加入2％木瓜蛋白酶，在55±0.5℃的温度下水解3小时±10分钟。加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温下，5000rpm离心30±5分钟。取上清液，冻干干燥得到袋鼠皮胶原蛋白肽粉。
图8显示了实施例1得到的袋鼠皮胶原蛋白肽的MALDI-TOF MS图谱。实施例1得到的袋鼠皮胶原蛋白肽的分子量在1KDa以下。分子量较小，说明使用木瓜蛋白酶处理时酶解充分。
实施例2
取10g沥干的袋鼠皮，剃毛。剪成1cm*1cm左右的小块，加入20倍体积(200ml)双蒸水，电饭煲煲20min。待其冷却室温，搅碎。调节pH6.4，加入2％木瓜蛋白酶，在55℃±0.5℃的温度下水解3小时±10分钟。加热煮沸10分钟使酶灭活。再在室温下，5000rpm离心30±5分钟。取上清液，冻干干燥得到袋鼠皮胶原蛋白肽粉。
图9显示了实例2得到的袋鼠皮胶原蛋白肽的水溶液经紫外全波长扫描后在220nm左右有最大吸收峰。这是胶原蛋白的特征吸收峰。
实施例3
本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽的体外保湿效果
根据保湿剂保湿性能的差异，不同浓度保湿剂对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同。将含一定水分的样品放在恒温恒湿的干燥器中干燥，定时称量样品质量的减少，通过对比分析，能够比较出不同样品保湿性的大小。为了更好地模拟皮肤的实际情况，给载玻片贴上3M胶布，将各受试物(袋鼠皮肽(低浓度)10mg/ml；肽(中浓度)100mg/ml；肽(高浓度)1g/ml)涂敷其上，放到盛有饱和硫酸铵溶液(相对湿度为85％)的干燥器中，每隔2小时进行称重，计算该时段的失水率，结果见图12。失水率计算公式是：
失水率(％)＝(m1-m2)/m1×100％
其中m1为样品的初始的水分质量，m2为样品放置2小时后的水分质量。
结果显示，本申请的袋鼠皮多肽三个中，肽(低)10mg/ml的肽保湿效果最佳。
实施例4
本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽的美白效果
1、袋鼠皮胶原蛋白肽对体外酪氨酸酶的半抑制率
测定袋鼠皮胶原蛋白肽对酪氨酸酶二酚酶的作用，研究其半抑制率。测定使用3mL体系。效应物溶于水，制成含不同浓度效应物的溶液。以0.5mmol/L L-DOPA为底物，在0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)的3mL测活体系中，先加入0.1mL不同浓度的效应物于比色杯中，再加入2.8mL预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入0.1mL蘑菇酪氨酸酶溶液，立刻混匀，在30℃恒温条件下测定波长为475nm的光密度值随时间的增长直线，从直线的斜率求得酶活力。以酶的相对剩余活力对效应物浓度作图，得到效应物的浓度效应曲线，由酶相对剩余活力为50％时，对应得到的效应物浓度，求得效应物的IC50值。图10显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对酪氨酸酶的IC50为55mg/ml。
2、袋鼠皮胶原蛋白肽对体外酪氨酸酶的抑制类型
根据上述步骤得到的IC50值。改变加入的酶蛋白的量，测定不同浓度效应物对蘑菇酪氨酸酶催化L-DOPA(左旋多巴)氧化活力的影响。以酶经效应物作用后的剩余酶活力对加入的酶量作图，由此判断效应物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用机理。图13显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用机理为不可逆抑制。
3、袋鼠皮胶原蛋白多肽对酪氨酸酶单酚酶活力分析
酪氨酸酶的单酚酶活力测定以L-Tyrosine为底物，测定效应物对蘑菇酪氨酸酶单酚酶催化反应的动力学曲线影响。采用3mL体系，以2mmol/L(终浓度)Tyr(酪氨酸酶单酚酶底物)为底物，在3mL 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)(终浓度)的测活体系中，先加入0.1ml含不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白多肽于比色杯中，再加进2.8ml0.05mol/L磷酸缓冲液，预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入蘑菇酪氨酸酶100μL，立刻混匀，在30℃恒温条件下测定波长为475nm的光密度值随时间的增长直线。结果如图13所示。
4、袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响
图11显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内增殖的影响。采用RPMI-1640培养基(含有10％新生小牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)，在CO2孵箱37℃，CO2＝5％的饱和湿度条件下培养细胞。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，在96孔细胞培养板中，加入小鼠B16黑素瘤细胞单细胞悬液，每孔200μL，过夜，待贴壁后，弃培养液。同时加入含袋鼠皮多肽不同浓度的培养液，继续培养24h后每孔加入20μL的0.5mg/mL MTT(4，5-二甲基噻唑-2)(避光)，在CO2孵箱37℃，CO2＝5％的饱和湿度条件下培养细胞4h后，弃上清液，每孔加入180μL DMSO，在室温条件下，避光震荡10min左右，使甲替结晶完全溶解，立即于酶标仪测定570nm光吸收值。每一浓度设5个复孔，取平均值。每一次实验均取同一传代细胞。
横坐标为不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽处理组(袋鼠皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL)，纵坐标为细胞相对增殖率。图14说明了在0～0.5μg/μL范围内，袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞没有毒害作用。
5、袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸活性的影响
细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，0.25％胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×104接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL的袋鼠皮胶原蛋白肽的培养基2mL。继续培养24小时后弃培养液。用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入体积分数为1％TritonX-100的PBS缓冲液900μL，然后加入100μL1.0mg/mL L-DOPA，超声2分钟，随后在30℃培养30分钟，测定475nm处的吸光度值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。
图12显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸活性的影响。在浓度范围为0～0.5μg/μL袋鼠皮胶原蛋白肽的作用下，小鼠B16黑色素瘤细胞内的酪氨酸活性随着袋鼠皮胶原蛋白肽浓度的升高而呈现出降低的趋势。
实施例5
本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽的抗氧化能力
1、袋鼠皮胶原蛋白肽对超氧阴离子自由基的清除能力
袋鼠皮胶原蛋白肽对超氧阴离子自由基的清除能力通过邻苯三酚自氧化速率来衡量。Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 8.2，4.5mL)与纯水(4.2mL)混合，25℃孵育20min，快速加入0.3mL邻苯三酚溶液(3mmol/L，用10mmol/L盐酸配制，经25℃预热)混匀后记录5min内反应溶液在320nm处的吸光度变化，绘制时间(t)-吸光度(A)曲线，在线性范围内计算反应单位时间内吸光度的改变，得出邻苯三酚的自氧化速率。
待测样品作用下邻苯三酚自氧化速率的测定：Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.2，4.5mL)与纯水(3.3mL)混合，25℃孵育20min，快速加入0.9mL样品及0.3mL邻苯三酚溶液(3mmol/L，用10mmol/L盐酸配制，经25℃预热)混匀后记录5min内反应溶液在320nm处的吸光度变化，绘制时间(t)-吸光度(A)曲线，在线性范围内计算反应单位时间内吸光度的改变，得出受试物作用下邻苯三酚的自氧化速率。
超氧阴离子自由基清除率(％)＝(1-V1/V0)*100％
V0：邻苯三酚自氧化速率
V1：为待测样品下邻苯三酚的自氧化速率
由图13可知在袋鼠皮胶原蛋白肽作用下，随着浓度的增大，邻苯三酚的自氧化速率降低，超氧阴离子自由基清除率增高。说明袋鼠皮胶原蛋白肽具有良好的自由基清除能力。
2、袋鼠皮胶原蛋白肽对羟基自由基的清除能力
通过水杨酸竞争捕捉羟基自由基法，来测定袋鼠皮胶原蛋白肽对羟基自由基的清除能力。1mL不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽(0.25、0.5、0.75、1、1.5μg/μL)与1mL硫酸亚铁(FeSO4，9mmol/L)和1mL过氧化氢(10mmol/L)混匀，37℃孵育10min，加入1mL水杨酸(9mmol/L)，混匀后37℃孵育10min，于510nm处测定反应溶液的吸光度，纯水作空白对照。按下式计算待测样品OH-自由基清除率。结果如表4所示。
羟基自由基清除率(％)＝(1-A实验组吸光值/A空白组吸光值)*100％
表4
浓度 0.25μg/μL 0.5μg/μL 0.75μg/μL 1μg/μL 1.5μg/μL
清除率 33％ 44.75％ 58％ 70％ 95％
3、袋鼠皮胶原蛋白肽对DPPH的清除能力
DPPH法根据Brand-Williams等已建立的方法，取0.1ml不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽(0、2.5、5、7.5、10μg/μL)，加入3ml 0.004％DPPH甲醇溶液。混合均匀后，静置30min后在517nm处测定吸光值。空白样采用甲醇。结果如表5所示。
抑制率(％)＝[(A0－A1)/A0]*100％
其中A0(加0.1mL甲醇和3mL DPPH甲醇溶液)为加入样品前的吸光值，A1为加入样品后的吸光值。
表5
浓度 0μg/μL 2.5μg/μL 5μg/μL 7.5μg/μL 10μg/μL
清除率 0 13％ 23％ 28％ 34％
4、袋鼠皮胶原蛋白肽对ABTS自由基的清除能力
前期准备：取ABTS 96mg，加蒸馏水25mL配成A液；取K2S2O3784mg，加蒸馏水10mL配成B液。将5ml A液与88μL B液混匀，静置12-16小时，配制成ABTS工作液。
用PBS溶液稀释ABTS工作液，要求在常温下734nm处吸光值为0.7±0.02。0.2mLABTS工作液与10uL不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽(0、2.5、5、7.5、10μg/μL)混合，常温避光静置6min，在734nm波长处测吸光度。结果如表6所示。
ABTS自由基清除率(100％)＝(A0-Ai/A0)*100％
其中A0为不加样品，，加入ABTS的吸光度；Ai为加入样品和ABTS的吸光度
表6
浓度 0μg/μL 2.5μg/μL 5μg/μL 7.5μg/μL 10μg/μL
清除率 0％ 15％ 32％ 51％ 60％
实施例6
本申请的袋鼠皮胶原蛋白多肽在抗氧化模型中的应用
1、袋鼠皮胶原蛋白肽对人肝癌HepG2细胞增殖率的影响。
图17显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对人肝癌HepG2细胞增殖率的影响。采用DMEM培养基(含有10％新生小牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)，在CO2孵箱37℃，CO2＝5％的饱和湿度条件下培养细胞。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，在96孔细胞培养板中，加入人肝癌HepG2细胞单细胞悬液，每孔200μL，过夜，待贴壁后，弃培养液。同时加入含袋鼠皮多肽不同浓度的培养液，继续培养24h后每孔加入20μL的0.5mg/mL MTT(避光)，在CO2孵箱37℃，CO2＝5％的饱和湿度条件下培养细胞4h后，弃上清液，每孔加入180μL DMSO，在室温条件下，避光震荡10min左右，使甲替结晶完全溶解，立即于酶标仪测定570nm光吸收值。每一浓度设5个复孔，取平均值。每一次实验均取同一传代细胞。
横坐标为不同浓度的袋鼠皮胶原蛋白肽处理组(袋鼠皮胶原蛋白肽的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μL)，纵坐标为细胞相对增殖率。图17说明了在0～0.5μg/μL范围内，袋鼠皮胶原蛋白肽对人肝癌HepG2细胞没有毒害作用，且在这个浓度范围内对人肝癌HepG2细胞增殖没有影响。
2、过氧化氢损伤人肝癌HepG2细胞模型的建立
取处于对数生长期的HepG2细胞，接种于6孔板中，在37℃、5％CO2(v/v)中培养12h，弃去旧培养液，加入不同浓度(0～500μM)的过氧化氢处理HepG2细胞24h后，吉姆萨染色液处理后，将6孔板置于倒置相差显微镜上，观察不同组细胞的形态，并拍照。结果如图18所示，对照组HepG2细胞，胞体饱满，边缘光滑，轮廓清晰，呈现梭形或不规则多边形。过氧化氢处理组中，细胞数量减少，分布稀松，少量细胞变圆。
3、袋鼠皮胶原蛋白肽对过氧化氢损伤模型细胞形态的影响
取对数生长期HepG2细胞，接种于6孔板中，在37℃、5％CO2(v/v)中培养24h，弃去旧培养液，加入不同浓度的药物处理HepG2细胞24h后，弃去培养液。PBS洗涤2次，甲醇固定15min，PBS洗涤2次，每孔加入500μL Hochest染色液，避光孵育10min，弃去染色液，置于荧光倒置显微镜下观察细胞核的形态，并拍照。结果如图19所示，正常组HepG2细胞，胞体饱满，边缘光滑，轮廓清晰，呈现梭形或不规则多边形。过氧化氢处理组中，细胞数量减少，分布稀松，坏死的细胞较多。过氧化氢和袋鼠皮多肽一同处理的细胞，随着多肽浓度的升高，细胞数量逐渐增多，坏死的数量逐渐减少。
4、袋鼠皮胶原蛋白肽对过氧化氢损伤人肝癌HepG2细胞内活性氧簇(ROS)含量的影响
取对数生长期的HepG2细胞，接种于6孔板中，在37℃、5％CO2(v/v)中培养24h，弃去旧培养液，加入不同浓度的药物处理HepG2细胞24h后，弃去培养液。用胰蛋白酶消化收集细胞于1.5mL的Ep管中。再用1mL PBS清洗剩余细胞一次，也收集到同一Ep管中，2500rpm离心5分钟，去上清后再用1mL PBS重悬细胞，再次离心去上清。1mL PBS重悬细胞后，加入10mmol/L的探针DCFH-DA(二氯荧光素二乙酸酯)1μL，置于37℃孵育30分钟。然后再离心取上清，用1mL PBS重悬细胞。在流式细胞仪上对细胞进行ROS的分析。
图20显示了本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽对过氧化氢损伤人肝癌细胞HepG2活性氧簇含量的影响。从左到右依次为0μg/μL的对照组，600μmol/LH2O2及0.50μg/μL袋鼠皮胶原蛋白多肽，600μmol/LH202。G-MEAN值从左到右分别为105.6、118.94、221.3。
G-MEAN值越大，说明ROS活性越高。在过氧化氢和袋鼠皮胶原蛋白肽一同存在的情况下，ROS的活性虽然高于对照组，但次于仅有过氧化氢存在的处理组。说明袋鼠皮胶原蛋白肽对活性氧簇具有清除能力，能降低细胞的氧化损伤。
因此，本申请的袋鼠皮胶原蛋白肽具有很好的抗氧化功效。
综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种袋鼠皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在沸水中烹煮去毛和去脂后的袋鼠皮；
(2)采用蛋白酶对去毛和去脂后的袋鼠皮进行酶解处理，得到酶解液；
(3)将所述酶解液离心分离，取上清液冷冻进行干燥，得到袋鼠皮胶原蛋白肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在沸水中烹煮的时间为20-40分钟。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，以ml/g计，沸水的用量为去毛和去脂后的袋鼠皮重量的比例为10-30倍体积。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，以ml/g计，沸水的用量为去毛和去脂后的袋鼠皮重量的15-25倍体积。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶。
6.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述蛋白酶与所述去毛和去脂后的袋鼠皮的重量比为1％-5％。
8.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶解的条件为：木瓜蛋白酶与所述去毛和去脂后的袋鼠皮的重量比为1-2％，pH为5.4-9.4，温度为40-55℃，酶解时间为2-5小时。
9.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，所述离心的条件为在室温环境下以4000-5000rpm的转速离心20-40分钟。
10.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，所述干燥选自冷冻干燥或喷雾干燥。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1653087A (zh) * 2002-05-21 2005-08-10 科尔泰克澳大利亚有限公司 胶原蛋白及其制备方法
US20110020864A1 (en) * 2009-07-27 2011-01-27 National Cheng Kung University Preparation of High Purity Collagen
CN102154420A (zh) * 2010-11-11 2011-08-17 武汉远城科技发展有限公司 一种猪皮胶原蛋白肽的提取方法
CN102559826A (zh) * 2012-02-15 2012-07-11 胡如桂 一种胶原蛋白低聚肽的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1653087A (zh) * 2002-05-21 2005-08-10 科尔泰克澳大利亚有限公司 胶原蛋白及其制备方法
US20110020864A1 (en) * 2009-07-27 2011-01-27 National Cheng Kung University Preparation of High Purity Collagen
CN102154420A (zh) * 2010-11-11 2011-08-17 武汉远城科技发展有限公司 一种猪皮胶原蛋白肽的提取方法
CN102559826A (zh) * 2012-02-15 2012-07-11 胡如桂 一种胶原蛋白低聚肽的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELZBIETA GURDAK,ET AL.: "Factors and mechanisms determining the formation of fibrillar collagen structures in adsorbed phases", 《COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES》 *
涂颖科等: "袋鼠皮加工技术", 《中国皮革》 *

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