CN108485983A - 一种用于规模化高密度培育绿藻的培养基及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于规模化高密度培育绿藻的培养基，包括基础培养基和扩培培养基，基础培养基包括无机盐有机物原液、微量元素原液、生长因子元素原液和增效缓冲剂原液；所述扩培培养基是将基础培养基添加至扩培水中搅拌均匀获得。本发明培养基中含有绿藻培育过程中所需活性成分，扩培速度快，绿藻繁育稳定，不容易老化死亡。本发明可实现高密度、低成本扩培绿藻，扩培后的绿藻具有活性，可大量繁育。

Description

一种用于规模化高密度培育绿藻的培养基及其培养方法
技术领域
本发明属于植物培育领域，涉及一种绿藻扩培技术，具体涉及一种用于规模化高密度培育绿藻的培养基及其培养方法。
背景技术
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。小球藻、栅藻、卵囊藻、小桩藻是目前常见的绿藻中的养殖微藻种类，它们富含蛋白质、维生素、矿物质以及一些生物活性物质，在保健食品、生物饵料、污水处理、饲料添加、生物能源等方面都有广泛开发价值。但微藻培养仍然存在一些瓶颈：1、培养密度低，直接影响继续扩繁成功率及使用效果；2、培养过程中容易受到PH值变化影响，出现藻附壁，必需使用酸碱滴定进行中和，需要操作经验且非常麻烦；3、培养过程中非常容易污染，导致培养失败，无法实现长时间连续扩培；4、藻类培养依赖光照和水温等条件，需要专业技术，藻类发生器价格昂贵。在实验室以外的广大生产者难以自行大规模培养。
发明内容
本发明的目的是提供了一种集成化、自养兼异养、海淡水通用、无需培养经验，低成本、高密度地完成绿藻规模化扩培的培养基。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种用于规模化高密度培育绿藻的培养基，其中：包括基础培养基和扩培培养基，所述基础培养基包括无机盐有机物原液、微量元素原液、生长因子元素原液和增效缓冲剂原液；所述无机盐有机物原液为1000ml蒸馏水中含有0.15～0.45g硫酸铵、0.15～0.3g乙酸钠、0.15～0.3g碳酸氢钠、1.5～15g葡萄糖、0.08～0.3g丙酸钾；所述微量元素原液为100ml蒸馏水中含有20～40mg Na2EDTA·2H2O、15～30mg FeCl3·6H2O、0.1ml～0.2ml浓度为17.8g/L MnCl2·4H2O溶液、0.1～0.2g H3BO3、20～200mg海水晶；所述生长因子元素原液为100ml蒸馏水中含有8～20mg维生素B1、8～20mg维生素B12、0.2～0.5mg生物素、10～20mg烟酸；所述增效缓冲剂原液为200ml蒸馏水中含有4～10g磷酸氢二钾、1～3g磷酸二氢钾；所述扩培培养基是将基础培养基添加至扩培水中搅拌均匀获得。
进一步地，将无机盐有机物原液、微量元素原液、生长因子元素原液、增效缓冲剂原液均匀混合后获得基础培养基，于4～10℃密封保存。
进一步地，所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：10～30％无机盐有机物原液、0.05～0.2％微量元素原液、0.1～0.2％生长因子元素原液、1～3％增效缓冲剂原液，其余为扩培水。
进一步地，用于规模化高密度培育绿藻的培养基，该培养基培养绿藻的方法，包括以下步骤：
(1)绿藻培育发生器消毒清洗干净；
(2)按上述配比，添加基础培养基，其余用扩培水补足，搅拌均匀，获得扩培培养基；
(3)绿藻与扩培培养基按照1:1～10倍体积比进行接种扩培；
(4)控制温度在22～28℃、光照强度在2000～6000lx、微流水转速为0.2～0.5转/s。
进一步地，所述扩培用水为自来水、消毒过滤的河水、井水或海水。
进一步地，所述绿藻培育发生器包括筒体，筒体的顶部设置加料口和灯光盘，筒体内设置相通的抽水管和进水管，抽水管和进水管连接处设置调节阀和水泵，筒体的底部设置含有调节阀的出水管；筒体上设置调温加热器。
进一步地，所述筒体顶部设置调节灯光盘、调温加热器以及水泵的控制面板。
进一步地，所述进水管的底部延伸出数条导引管，每个导引管的出水端均设置同向的喷嘴，循环水从喷嘴喷出后，形成顺时针或逆时针旋转，使其水体处于微流动状态。
进一步地，所述加料口设置盖子。
本发明用于规模化高密度培育绿藻的培养基及其培养方法具有以下的有益效果：
1、本发明用于规模化高密度培育绿藻的培养基含有绿藻培育过程中所需活性成分，扩培速度快，绿藻繁育稳定，不容易老化死亡；
2、本发明可实现高密度、低成本扩培绿藻，扩培后的绿藻具有活性，可大量繁育；
3、本发明利用乙酸钠和葡萄糖复配一次性提供碳源，可有效提高培养密度(可达到108个/mL)，操作简单，培养小球藻蛋白含量高于60％，培养斜生栅藻蛋白含量高于50％；
4、本发明对提供N元素、C元素的2类营养物质进行了优化和筛选，培养基中的营养物质水解后，产生H+和OH-不断在反应体系中得到平衡，从而维持扩培体系的PH稳定；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾除了提供藻类的生长元素磷，还可以组成磷酸缓冲液，在培养体系中发挥缓冲作用；
5、本发明添加微生物抑制剂丙酸钾，营养物一次配制后可长期保存及使用，方便操作，并降低绿藻培养过程中被菌类污染的风险，提高扩培稳定性；
6、本发明利用海水晶替代多种微量元素，营养更全面。海水晶含有很多天然有益成分及Mg、K、Cu、Zn、Se、Mo等微量元素，操作简化，可在生产中推广；
7、本发明的绿藻培育发生器结构简单、使用方便、可用于室内或室外培育，光照和水温根据微藻生长需求及对应水体积设定，无需培养经验，即可把光照和水温控制在经验范围内，操作简单；采用微流自循环，不引入外源污染，培养密度高，培养稳定，扩繁代数高。
附图说明
图1为本发明中的绿藻培育发生器的结构示意图；
图中：1、加料口；2、水泵；3、灯光盘；4、控制面板；5、进水管；6、导引管；7、调节阀；8、出水管；9、调温加热器；10、抽水管；11、盖子。
具体实施方式
为了详细说明本发明的技术内容、构造特征、以下结合实施方式并配合附图作进一步说明。
如图1所示，本发明中的绿藻培育发生器，包括筒体，筒体的顶部设置加料口1和灯光盘3，筒体内设置可循环运转且相通的抽水管10和进水管5，抽水管10和进水管5连接处设置调节阀和水泵2，调节阀可调整流水转速；筒体的底部设置含有调节阀7的出水管8；筒体上设置调温加热器9。
所述筒体顶部设置调节灯光盘、调温加热器以及水泵的控制面板4。
所述进水管5的底部延伸出数条导引管6，每个导引管6的出水端均设置同向的喷嘴，循环水从喷嘴喷出后，形成顺时针或逆时针旋转，使其水体处于微流动状态。
所述加料口1设置盖子11。
所述绿藻培育发生器扩培绿藻方式方法如下：
实施例1
室内海水培养100L普通小球藻，包括以下步骤：
(1)培育发生器消毒清洗干净。
(2)海水准备：海水使用500目网纱过滤，使用次氯酸钠消毒，2天后抽上层清液使用。
(3)培养基配置方法：
无机盐有机物原液，1000ml蒸馏水中含有以下成分：
微量元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
生长因子元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
增效缓冲剂原液，200ml蒸馏水中含有以下成分：
磷酸氢二钾 8g
磷酸二氢钾 2g
所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：25％无机盐有机物原液、0.05％微量元素原液、0.15％生长因子元素原液、2％增效缓冲剂原液，其余为海水。
按照上述配比混合，加入发生器中，其余用海水补足，搅拌均匀，一共配置70L培养基。
(4)在培育发生器中加入小球藻藻种30L(接种密度约为5×106)，搅拌均匀。
(5)水温高于22℃，调温加热器可关闭，水温低于22℃，打开调温加热器，温度设置在25℃。
(6)打开灯光盘，光盘大小100w，光盘光照强度为5000lx。
(7)打开循环开关，通过调节阀调整流水转速为0.5转/s。
4天可收获普通小球藻藻液。
继续繁殖扩培，可留下50L藻液作为藻种，按照上述配方比例添加基础培养基，温度、光照、循环操作不变。
实施例2
室外河水培养50L蛋白核小球藻，包括以下步骤：
(1)培育发生器消毒清洗干净。
(2)河水准备：河水使用500目网纱过滤，使用次氯酸钠消毒，2天后抽上层清液使用。
(3)培养基配置方法：
无机盐有机物原液，1000ml蒸馏水中含有以下成分：
微量元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
生长因子元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
增效缓冲剂原液，200ml蒸馏水中含有以下成分：
磷酸氢二钾 8g
磷酸二氢钾 2g
所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：30％无机盐有机物原液、0.1％微量元素原液、0.1％生长因子元素原液、1.5％增效缓冲剂原液，其余为河水。按照上述配比进行混合，加入发生器中，其余用河水补足，搅拌均匀，一共配置25L培养基。
(4)在培育发生器中加入蛋白核小球藻25L(接种密度约为4×106)，搅拌均匀。
(5)水温高于22℃，调温加热器可关闭，水温低于22℃，打开调温加热器，温度设置在25℃。
(6)晴天光照开关可关闭。阴天打开光照开关，打开灯光盘，光盘大小50w，光盘光照强度为3000lx。
(7)打开循环开关，通过调节阀调整流水转速为0.4转/s。
3天可收获核蛋白小球藻藻液。
继续繁殖扩培，可留下25L藻液作为藻种，按照上述配方比例添加基础培养基，温度、光照、循环操作不变。
实施例3
室外自来水培养100L斜生栅藻，包括以下步骤：
(1)培育发生器消毒清洗干净。
(2)自来水准备：自来水曝气6个小时以上使用。
(3)培养基配置方法：
无机盐有机物原液，1000ml蒸馏水中含有以下成分：
微量元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
生长因子元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
增效缓冲剂原液，200ml蒸馏水中含有以下成分：
磷酸氢二钾 10g
磷酸二氢钾 3g
所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：25％无机盐有机物原液、0.15％微量元素原液、0.15％生长因子元素原液、2.5％增效缓冲剂原液，其余为自来水。
按照上述配比进行混合，加入发生器中，其余用自来水补足，搅拌均匀，一共配置60L培养基。
(4)在培育发生器中加入斜生栅藻40L(接种密度为3.2×106)，搅拌均匀。
(5)水温高于23℃，调温加热器可关闭，水温低于23℃，打开调温加热器，温度设置在26℃。
(6)打开灯光盘，光盘大小100w，光盘光照强度为5000lx。
(7)打开循环开关，通过调节阀调整流水转速为0.3转/s。
5天可收获斜生栅藻藻液。
继续繁殖扩培，可留下50L藻液作为藻种，按照上述配方比例添加基础培养基，温度、光照、循环操作不变。
实施例4
室内海水培养50L波吉卵囊藻，包括以下步骤：
(1)培育发生器消毒清洗干净。
(2)海水准备：海水使用500目网纱过滤，使用次氯酸钠消毒，2天后抽上层清液使用。
(3)培养基配置方法：
无机盐有机物原液，1000ml蒸馏水中含有以下成分：
微量元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
生长因子元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
增效缓冲剂原液，200ml蒸馏水中含有以下成分：
磷酸氢二钾 8g
磷酸二氢钾 2g
所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：25％无机盐有机物原液、0.05％微量元素原液、0.15％生长因子元素原液、2％增效缓冲剂原液，其余为海水。
按照上述配比进行混合，加入发生器中，其余用海水补足，搅拌均匀，一共配置30L培养基。
(4)在培育发生器中加入波吉卵囊藻20L(接种密度为1.8×106)，搅拌均匀。
(5)水温高于25℃，调温加热器可关闭，水温低于25℃，打开调温加热器，温度设置在25℃。
(6)打开灯光盘，光盘大小50w，光盘光照强度为3000lx。
(7)打开循环开关，通过调节阀调整流水转速为0.2转/s。
6天可收获波吉卵囊藻藻液。
继续繁殖扩培，可留下25L藻液作为藻种，按照上述配方比例添加基础培养基，温度、光照、循环操作不变。
实施例5
室外井水培养50L狭形小桩藻，包括以下步骤：
(1)培育发生器消毒清洗干净。
(2)井水准备：井水使用500目网纱过滤后可使用。
(3)培养基配置方法：
无机盐有机物原液，1000ml蒸馏水中含有以下成分：
微量元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
生长因子元素原液，100ml蒸馏水中含有以下成分：
增效缓冲剂原液，200ml蒸馏水中含有以下成分：
磷酸氢二钾 10g
磷酸二氢钾 3g
所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：25％无机盐有机物原液、0.1％微量元素原液、0.2％生长因子元素原液、2％增效缓冲剂原液，其余为井水。
按照上述配比进行混合，加入发生器中，其余用井水补足，搅拌均匀，一共配置25L培养基。
(4)在培育发生器中加入狭形小桩藻25L(接种密度为4×106)，搅拌均匀。
(5)水温高于25℃，调温加热器可关闭，水温低于25℃，打开调温加热器，温度设置在25℃。
(6)打开灯光盘，光盘大小30w，光盘光照强度为2000lx。
(7)打开循环开关，通过调节阀调整流水转速为0.3转/s。
6天可收获狭形小桩藻藻液。
继续繁殖扩培，可留下25L藻液作为藻种，按照上述配方比例添加基础培养基，温度、光照、循环操作不变。
本发明每个实施例培养绿藻密度及连续扩繁代数情况如下表1所示，从表中可见，通过本发明培养基及其制备方法对绿藻进行扩培，培养密度高，培养稳定，扩繁代数高。
表1本发明每个实施例培养绿藻密度及连续扩繁代数情况
采用血球计数板(25×16)在显微镜下观察计数，计数四个角和中央的五个中方格(80个小方格)的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计算公式：藻细胞个数/1mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种用于规模化高密度培育绿藻的培养基，其特征在于：包括基础培养基和扩培培养基，所述基础培养基包括无机盐有机物原液、微量元素原液、生长因子元素原液和增效缓冲剂原液；所述无机盐有机物原液为1000ml蒸馏水中含有0.15～0.45g硫酸铵、0.15～0.3g乙酸钠、0.15～0.3g碳酸氢钠、1.5～15g葡萄糖、0.08～0.3g丙酸钾；所述微量元素原液为100ml蒸馏水中含有20～40mg Na2EDTA·2H2O、15～30mg FeCl3·6H2O、0.1ml～0.2ml浓度为17.8g/L MnCl2·4H2O溶液、0.1～0.2g H3BO3、20～200mg海水晶；所述生长因子元素原液为100ml蒸馏水中含有8～20mg维生素B1、8～20mg维生素B12、0.2～0.5mg生物素、10～20mg烟酸；所述增效缓冲剂原液为200ml蒸馏水中含有4～10g磷酸氢二钾、1～3g磷酸二氢钾；所述扩培培养基是将基础培养基添加至扩培水中搅拌均匀获得。
2.如权利要求1所述的用于规模化高密度培育绿藻的培养基，其特征在于：将无机盐有机物原液、微量元素原液、生长因子元素原液、增效缓冲剂原液均匀混合后获得基础培养基，于4～10℃密封保存。
3.如权利要求1所述的用于规模化高密度培育绿藻的培养基，其特征在于，所述扩培培养基中包括以下体积百分数的成分：10～30％无机盐有机物原液、0.05～0.2％微量元素原液、0.1～0.2％生长因子元素原液、1～3％增效缓冲剂原液、其余为扩培水。
4.如权利要求1所述的用于规模化高密度培育绿藻的培养基培养绿藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)绿藻培育发生器消毒清洗干净；
(2)按上述配比，添加基础培养基，其余用扩培水补足，搅拌均匀，获得扩培培养基；
(3)绿藻与扩培培养基按照1:1～10倍体积比进行接种扩培；
(4)控制温度在22～28℃、光照强度在2000～6000lx、微流水转速为0.2～0.5转/s。
5.如权利要求3所述的用于规模化高密度培育绿藻的培养基，其特征在于：所述扩培水为自来水、消毒过滤的河水、井水或海水。
6.如权利要求4所述的用于规模化高密度培育绿藻的培养基，其特征在于：所述绿藻培育发生器包括筒体，筒体的顶部设置加料口和灯光盘，筒体内设置相通的抽水管和进水管，抽水管和进水管连接处设置调节阀和水泵，筒体的底部设置含有调节阀的出水管；筒体上设置调温加热器。
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