CN108478876A - 一种促血管化骨组织工程支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促血管化骨组织工程支架的制备方法，其包括如下步骤：采用化学沉淀法，将含水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐及表面活性剂的水溶液与磷酸盐的水溶液反应，制备缺钙磷灰石浆料，进行干燥后，得到粉体；其中，所述水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐的摩尔比为15～168:1:1；将所得粉体与液相溶液混合配成浆料，然后注入模具，进行干燥成型、高温烧结，得到多孔磷酸钙陶瓷支架；将载GDF‑5的微球负载在所得多孔磷酸钙陶瓷支架表面，真空干燥后得到所述促血管化骨组织工程支架。本发明所得组织工程支架具有优良的骨传导性、骨诱导性、生物降解性能和促血管化性能，解决了骨缺损快速修复的难题，具有良好的实际应用前景。

Description

一种促血管化骨组织工程支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及适用于人体硬组织修复的生物医学支架材料技术领域，具体涉及一种促血管化骨组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
随着社会经济发展以及车辆的爆炸式增长，创伤、感染、肿瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺损，使人们对骨缺损修复的需求呈现快速增长。骨组织本身具有再生能力，但当缺失尺寸过大，即发生大段骨缺损时，骨组织不能进行自身修复重建，这就要求采用骨替代物进行修复。
目前，针对大段骨缺损修复临床常用的方法有：(1)自体骨移植：自体骨移植作为骨缺损修复的金标准，是临床常用且成功率较高的传统骨缺损修复方法，但由于其来源有限，且手术造成二次创伤等问题限制其大规模应用；(2)异体骨移植：临床上广泛使用的大段骨缺损修复方法，其使用的异体骨主要是同种异体骨，受伦理学限制，来源有限。此外，异体骨的使用会引起强烈的免疫排斥反应，人们采取不同方法降低移植骨抗原性的同时也使其成骨功能部分丧失，导致移植后骨缺损修复缓慢。另外，异体骨的使用也增加了潜在疾病传播的风险；(3)组织工程骨：利用组织工程学原理与方法，将体外培养的种子细胞种植于支架材料上，并复合相关生长因子，移植于体内，从而达到修复骨缺损的目的。组织工程骨植入体内无免疫原性，且可按需要形状大量制备，来源充足，是目前公认用于大段骨缺损修复的理想材料。
在体外构建组织工程骨过程中，支架材料作为细胞外基质替代物，不仅是支撑细胞生长形成立体组织的关键所在，也为细胞粘附、迁移及成骨分化提供了必要的微环境。但是，传统的支架材料在临床应用中，主要以机械填充的方式替换缺损骨组织，而缺乏对细胞/组织的调控能力。此外，临床中经常面对复杂、困难的病情，如：植入部位发生微生物感染、血管再生能力差及新生骨组织形成速度过慢等问题，使得现有的支架材料性能不能满足临床需求。尤其就大段组织工程骨而言，血管化问题仍是制约其应用于临床的重要原因。尤其当组织工程骨植入体内血供不佳的受区时，因不能及时与机体建立血供连接，常发生骨中心坏死和移植失败。因此，为使支架材料在体内能有效成骨，有必要在其构建过程中采取促血管化策略。
随着药物控释技术的发展，使得在支架表面进行生物功能化修饰成为可能。因此，本项目拟结合局部药物释放技术，对支架材料表面进行生物功能化修饰，赋予支架材料促血管化及成骨的生物功能，从而解决植入支架材料在临床面临的血管化及新骨形成过慢的问题。
作为骨组织工程的三大要素之一，生长因子通过信号传导调节细胞增殖、分化及基因表达，从而促进骨组织再生。目前，在骨组织工程中研究较多的生长因子是骨形态发生蛋白(BMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)。BMP-2能诱导间充质干细胞向骨或软骨细胞分化，促进新骨形成。但应用过程中发现BMP-2的使用会造成异位成骨需要二次手术取出。另一方面，生物活性因子VEGF使用的潜在并发症也会造成非缺血部位的附带血管化，这种非特异性血管化可能导致肿瘤细胞或组织的生长。因此，考虑到BMP-2、VEGF的生物安全性及成本昂贵问题，有必要探索其他的生长因子或生长因子替代物应用于骨组织工程达到促进成骨的目的。
生长分化因子-5(GDF-5)属于骨形态发生蛋白家族成员，也是TGF-β超家族一员。研究发现，GDF-5能募集间充质干细胞并促进其向骨和软骨分化，同时促进血管发生，在肢体骨骼发育和关节形成中起着重要调控作用。研究发现，GDF-5加入不仅有利于矿化组织形成，且与BMP-2相比，植入体周围无异位成骨和浆液肿形成等副反应发生。因此，GDF-5作为BMP-2替代物应用于组织工程显得更为安全、有效。此外，金属离子在骨组织形成、生长和修复过程中的作用也不容忽视。研究表明，金属微量元素的加入能增强生物活性因子如BMP-2、VEGF等的表达。
虽然目前研究携载单一金属离子或GDF-5的生物材料已经得到初步研究，但是所得效果仍然不尽人意，无法满足人们对于骨缺损快速修复的需求。这方面已取得的研究报道有“Tricalcium Phosphate Ceramics Doped with Silver,Copper,Zinc,and Iron(III)Ions in Concentrations of Less Than 0.5wt.％for Bone TissueRegeneration”、“Periodontal wound healing_regeneration following applicationof rhGDF-5in aβ-TCP_PLGA carrier in critical-size supraalveolar periodontaldefects in dogs”、“Effects ofreleasing recombinant human growth anddifferentiation factor-5from poly(lactic-co-glycolic acid)microspheresforrepair ofthe rat degenerated intervertebral disc”和“An EngineeredMultiphase Three-Dimensional Microenvironment to Ensure the ControlledDelivery of Cyclic Strain and Human Growth DifferentiationFactor 5”等。
造成目前研究困境可能的原因在于：虽然单个因子或者单种金属离子对于骨组织再生和血管化而言，有一定促进作用，但所产生的作用仍不尽人意，而对各种因子或金属离子之间联用所产生作用及其作用机制研究较少。正如天然骨组织中微量元素的多样性，理论上开发两种及两种以上微量元素掺杂磷酸钙材料更有利于骨组织缺损修复。但相比于金属离子单一掺杂，要开发多元素掺杂的磷酸钙材料用于骨组织修复仍面临重要挑战：(1)金属离子共掺杂对磷酸钙物理化学性能的影响；(2)不同金属离子在共掺杂磷酸钙材料中的释放动力学及释放浓度是否分别达到有效治疗浓度；(3)金属离子间对生物活性因子表达及细胞行为是否存在协同效应及具体机理仍有待探讨。鉴于现有研究仍无法解决上述问题，人们目前还很难通过制备负载相关因子或者金属离子的生物材料的途径来真正获得可以快速促进骨修复的材料。
为了取得相应的突破，需解决如下几个问题中的至少一个：
(1)研究金属离子共掺杂对磷酸钙物理化学性能的影响；
(2)获得不同金属离子在共掺杂磷酸钙材料中的释放动力学及释放浓度是否分别达到有效治疗浓度；
(3)研究金属离子间对生物活性因子表达及细胞行为是否存在协同作用。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种促血管化骨组织工程支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)采用化学沉淀法，将含水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐及表面活性剂的水溶液与磷酸盐的水溶液反应，制备缺钙磷灰石浆料，进行干燥后，得到粉体；其中，所述水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐的摩尔比为15～168:1:1；
(2)将步骤(1)所得粉体与液相溶液混合至形成浆料；
(3)将步骤(2)所得浆料注入模具，进行干燥成型、高温烧结，得到多孔磷酸钙陶瓷支架；
(4)将载GDF-5的微球负载在所得多孔磷酸钙陶瓷支架表面，真空干燥后得到所述促血管化骨组织工程支架；
所述促血管化骨组织工程支架中携载Cu(II)和Zn(II)，其各自的掺杂率分别为0.7～1.5wt％和0.9～2.0wt％；所述载GDF-5的微球与所述促血管化骨组织工程支架的重量百分比为0.001～0.02。
作为本发明的优选方案，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
作为本发明的优选方案，所述水溶性钙盐为硝酸钙；和/或，所述水溶性铜盐为硝酸铜；和/或，所述水溶性锌盐为硝酸锌；和/或，所述磷酸盐为磷酸氢二胺。
所述液相溶液为2wt％海藻酸钠溶液；和/或，所述载GDF-5的PLGA微球的载药量为0.005％；和/或，所述载GDF-5的微球与所述促血管化骨组织工程支架的重量百分比为0.005。
作为本发明的优选方案，步骤(1)中，所述水溶性钙盐、水溶性铜盐和水溶性锌盐的摩尔量的总和与所述磷酸盐的摩尔量之比为1.55。
作为本发明的优选方案，步骤(1)中，所述水溶性钙盐的摩尔浓度为0.75～0.85mol/L，最好为0.81mol/L。
作为本发明的优选方案，进行步骤(1)中的具体方法为：
1)将水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐及表面活性剂溶于去离子水中，形成溶液一；
2)将磷酸盐溶于去离子水中，形成溶液二；
3)将溶液二逐滴加入溶液一中，并控制溶液体系的pH值为8～9，室温下搅拌均匀，老化24小时；
4)进行干燥后，得到粉体。
步骤(3)中，所述高温烧结指在1200℃条件下烧结2小时。
步骤(4)中，所述的载GDF-5的微球指携载GDF-5的PLGA微球；进行所述负载时，是通过真空负压的方式将所述载GDF-5的微球进行载入。
本发明的另外一个目的在于提供由上述制备方法制备得到的促血管化骨组织工程支架。
如本发明的对比例所示，当采用金属离子的其他配比时，所得效果将出现大幅下降。同时，当缺少GDF-5时，所得效果也不如人意。虽然“Tricalcium Phosphate CeramicsDoped with Silver,Copper,Zinc,and Iron(III)Ions in Concentrations of LessThan 0.5wt.％for Bone Tissue Regeneration”等文章均提示了利用金属离子负载的β-TCP材料可以用于骨组织修复方面，但如本领域其他研究者面临的问题一样，本发明的发明人在进行研究时，很难对相应的金属离子和相应因子进行组合以获得可以实现骨缺损进行快速修复的目的，通过大量的摸索之后，发明人发现铜离子、锌离子和GDF-5在本发明的磷酸钙材料上具有显著的协同效应，一举突破了现有技术在骨修复方面，尤其是血管化效果差的技术难题，可以用于骨缺损的快速修复。
本发明另外一个目的在于提供上述促血管化骨组织工程支架在骨修复方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明所得组织工程支架具有良好的骨传导性、骨诱导性及生物降解性能和促血管化性能，解决了骨缺损快速修复的难题，具有良好的实际应用前景。
附图说明
图1 A为Cu(II)/Zn(II)掺杂量不同的磷酸钙支架及载微球支架的扫描电镜图片；其中，a和a1为纯磷酸钙组，(b和b1为Cu(II)/Zn(II)添加量为0.5％的磷酸钙支架组，c和c1为Cu(II)/Zn(II)添加量为2％的磷酸钙支架组，d和d1为Cu(II)/Zn(II)添加量为5％的磷酸钙支架组，e和e1为Cu(II)/Zn(II)为2％的磷酸钙支架+载GDF-5微球组；B、C分别为Cu(II)/Zn(II)掺杂量不同的磷酸钙支架的XRD图谱及红外图谱，“P0”为纯磷酸钙，“P1”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为0.5％的磷酸钙支架，“P2”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为2％的磷酸钙支架组，“P3”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为5％的磷酸钙支架组；
图2中，A为骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞在支架上的增值情况，B为骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞在支架上的ALP表达情况，C为支架浸提液与血管内皮细胞共培养12h的Matrigel荧光染色结果图，D为支架浸提液与骨髓间充质干细胞共培养21d的茜素红染色图；其中，“P0”为纯磷酸钙组，“P1”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为0.5％的磷酸钙支架组，“P2”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为2％的磷酸钙支架组，“P2/GDF-5”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为2％的磷酸钙支架+载GDF-5微球组；“control”为单纯培养基组，“Zn(II)”为培养基中添加Zn2+组，“Cu(II)”为培养基中添加Cu2+组，“Extraction”为培养基中添加支架浸提液组；
图3为动物术后12周各组标本的HE染色结果：a和a1为空白对照组，b和b1为纯磷酸钙植入组，c和c1为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为0.5％的磷酸钙支架植入组，d和d1为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为2％的磷酸钙支架植入组，e和e1为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为2％的磷酸钙支架+载GDF-5微球植入组；图中的标尺:a～e为200μm，a1～e1为100μm，a1～e1分别为a～e的局部放大图；
图4为不同样品在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中离子释放曲线；其中，a为铜离子的释放曲线，b为锌离子的释放曲线，c为钙离子的释放曲线；“P0”为纯磷酸钙组，“P1”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为0.5％的磷酸钙支架组，“P2”为Cu(II)/Zn(II)掺杂量为2％的磷酸钙支架组；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)采用化学沉淀法，将含硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌及十二烷基硫酸钠的水溶液与磷酸氢二胺的水溶液反应，制备缺钙磷灰石浆料，进行干燥后，得到粉体；其中，所述硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌的摩尔比为168:1:1；
(2)将步骤(1)所得粉体与液相溶液混合至形成浆料；所述液相溶液为2wt％海藻酸钠溶液，固液比为20g：100mL；
(3)将步骤(2)所得浆料注入海藻酸钙球紧密堆积的颗粒模具中，放入氯化钙溶液中成型，干燥后在1200℃条件下烧结2小时，得到多孔磷酸钙陶瓷支架；
(4)将载GDF-5的PLGA微球通过真空负压的方式负载在所得多孔磷酸钙陶瓷支架表面，真空干燥后得到所述促血管化骨组织工程支架；
所述促血管化骨组织工程支架中携载Cu(II)和Zn(II)；其中各自的掺杂率分别为0.7％和0.9％。载GDF-5的微球与支架质量百分比为0.005。
进行步骤(1)中的具体方法为：
1)将硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌及十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，形成溶液一；
2)将磷酸盐溶于去离子水中，形成溶液二；
3)将溶液二逐滴加入溶液一中，并控制溶液体系的pH值为8～9，室温下搅拌均匀，老化24小时；
4)进行干燥后，得到粉体。
实施例2
除了硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌的摩尔比为40:1:1，其余与实施例1一致。
实施例3
除了硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌的摩尔比为15:1:1，其余与实施例1一致。
对比实施例1
除了硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌的摩尔比为40:1:1，GDF-5的微球在多孔磷酸钙陶瓷支架的负载量为0.001之外，其余与实施例1一致。
对比实施例2
除了硝酸钙、硝酸铜、硝酸锌的摩尔比为40:1:1，GDF-5的微球在多孔磷酸钙陶瓷支架的负载量为0.01之外，其余与实施例1一致。
对比实施例3
除了将水溶性铜盐替换为镁盐之外，其余与实施例1一致。
对比实施例4
除了将水溶性锌盐替换为镁盐之外，其余与实施例1一致。
对比实施例5
除了将水溶性铜盐替换为锶盐之外，其余与实施例1一致。
实验例
对实施例1～3所得的组织工程支架进行物理化学性能表征，细胞相容性评价及动物骨缺损修复效果评价，结果如图1～图3所示。
对对比实施例1～5进行细胞增值、ALP活性的测试，结果如表1所示。
进行细胞增值测试实验时，过程为：支架材料置于培养板中，将P3代的骨髓间充质干细胞和内皮细胞1：1混合，接种在支架材料上，加入DMEM完全培养基(10％FBS、1％PS)。7天后采用CCK-8法检测细胞的增殖情况。即去除培养基后，每孔加入400μl新鲜培养基和40μlCCK-8细胞增殖检测液，孵育2h后，用酶标仪在450nm波长处检测其吸光度值。
进行ALP活性测试实验时，过程为：支架与细胞共培养14天后，吸去培养基，用PBS洗涤，每孔中加入200μL细胞裂解液，反复吹打，常温裂解40min，取上清液在520nm处测其吸光度值。
表1
表2动物术后12周各组标本新生骨面积和血管统计学结果(n＝5)

Claims (10)

1.一种促血管化骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)采用化学沉淀法，将含水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐及表面活性剂的水溶液与磷酸盐的水溶液反应，制备缺钙磷灰石浆料，进行干燥后，得到粉体；其中，所述水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐的摩尔比为15～168:1:1；
(2)将步骤(1)所得粉体与液相溶液混合至形成浆料；
(3)将步骤(2)所得浆料注入模具，进行干燥成型、高温烧结，得到多孔磷酸钙陶瓷支架；
(4)将载GDF-5的微球负载在所得多孔磷酸钙陶瓷支架表面，真空干燥后得到所述促血管化骨组织工程支架；
所述促血管化骨组织工程支架中携载Cu(II)和Zn(II)，其各自的掺杂率分别为0.7～1.5wt％和0.9～2.0wt％；所述载GDF-5的微球与所述促血管化骨组织工程支架的重量百分比为0.001～0.02。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性钙盐为硝酸钙；和/或，所述水溶性铜盐为硝酸铜；和/或，所述水溶性锌盐为硝酸锌；和/或，所述磷酸盐为磷酸氢二胺。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液相溶液为2wt％海藻酸钠溶液；和/或，所述载GDF-5的PLGA微球的载药量为0.005％；和/或，所述载GDF-5的微球与所述促血管化骨组织工程支架的重量百分比为0.005。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水溶性钙盐、水溶性铜盐和水溶性锌盐的摩尔量的总和与所述磷酸盐的摩尔量之比为1.55。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水溶性钙盐的摩尔浓度为0.75～0.85mol/L，优选为0.81mol/L。
7.根据权利要求1～6所述的制备方法，其特征在于，进行步骤(1)中的具体方法为：
1)将水溶性钙盐、水溶性铜盐、水溶性锌盐及表面活性剂溶于去离子水中，形成溶液一；
2)将磷酸盐溶于去离子水中，形成溶液二；
3)将溶液二逐滴加入溶液一中，并控制溶液体系的pH值为8～9，室温下搅拌均匀，老化24小时；
4)进行干燥后，得到粉体。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高温烧结指在1200℃条件下烧结2小时；和/或，步骤(4)中，所述的载GDF-5的微球指携载GDF-5的PLGA微球；进行所述负载时，是通过真空负压的方式将所述载GDF-5的微球进行载入。
9.由权利要求1～8所述的制备方法制备得到的促血管化骨组织工程支架。
10.权利要求9所述的促血管化骨组织工程支架在骨组织修复方面的应用。
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