CN108477144A - 胃癌干细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

胃癌干细胞冻存液及冻存方法 Download PDF

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曾铁兵
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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及胃癌干细胞冻存液及冻存方法。本发明提供了一种由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成的胃癌干细胞冻存液及胃癌干细胞的冻存方法，本发明提供规定培养液成分简单，不含有血清，且能够实现对胃癌干细胞的稳定保存。本发明提供的方法简单易行，无需复杂仪器。实验表明，复苏后的GCSCs成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，CD44的表达也一样，说明成功获得用于冻存CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液。与新分选的GCSCs相比，冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β‑actin表达量差异不明显。表明复苏的GCSCs状态好，可用于后续实验。

Description

胃癌干细胞冻存液及冻存方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及胃癌干细胞冻存液及冻存方法。
背景技术
胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于肺癌。肿瘤干细胞(cancer stem cells)是肿瘤基础研究领域的热点和难点问题。现代研究认为，肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新特性和分化为不同肿瘤细胞能力的一种细胞，被认为参与了肿瘤的发生、维持和进展等诸多过程。存在于胃癌中的胃癌干细胞(gastric cancer stem cells，GCSCs)，在胃癌发生发展中发挥重要作用，它们是化疗耐受的基础，并常常导致肿瘤快速生长和转移。因此，目前对GCSCs的研究越来越受到关注，然而在对GCSCs的研究过程中，其保存方法尚未得到解决，GCSCs难以保存，每次实验时都需要分选，对后续实验造成了很大的负担，增加了许多的工作量。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供胃癌干细胞冻存液及冻存方法，该冻存液能够实现对GCSCs的良好冻存，并且复苏后观察细胞形态、肿瘤成球时间及转染后细胞蛋白表达情况的差异。
本发明提供的胃癌干细胞冻存液，由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成；所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。
在本发明实施例中，冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:(6～8)。
在一些实施例中，冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:7。
在一些实施例中，所述冷冻保护剂为DMSO。
所述DMEM/F12培养基为DMEM/F12(1:1)培养基。
本发明提供的冻存液的主要成分为细胞培养液成分，而不采用血清，在保证了营养的前提下，避免了异源血清带来的风险。该冻存液对胃癌干细胞冻存至少可达6个月，且复苏后细胞β-actin的表达表达量无明显差异，成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，可用于后续研究。且，由于避免了血清的使用，该冻存液的成本大大降低。
本发明还提供了胃癌干细胞的冻存方法，将胃癌干细胞以所述的胃癌干细胞冻存液重悬，0～4℃放置15min～60min；再-15℃～-25℃放置30～60min，然后不高于-80℃冻存。
所述重悬后，4℃放置30min；再-20℃放置45min，然后-80℃冻存或置于液氮中冻存。
本发明实施例中，所述重悬至胃癌干细胞的密度为1×106cell/ml。
本发明实施例中，所述胃癌干细胞为对数期的胃癌干细胞。
本发明实施例中，所述胃癌干细胞由胃癌细胞经磁珠分选制得。
一些具体实施例中，所述胃癌干细胞的制备方法包括：
将胃癌细胞以含有10％FBS的RPMI-1640培养基培养至对数期后，制成单个细胞；
将所述单个细胞经CD44抗体磁珠筛选后用SFM培养基，培养至融合度为80％。
本发明实施例中，胃癌细胞为SGC7901细胞。
本发明首先通过免疫磁珠细胞分选(Magnetic cell sorting，MACS)技术分选SGC7901干细胞(即胃癌干细胞，GCSCs)，并对其进行培养，然后用免疫荧光检测SGC7901细胞分选前后CD44的表达情况，证实分选细胞为GCSCs。待细胞培养至一定数量后对其进行冻存、复苏等发现，GCSCs也能像其他干细胞一样进行冻存保种，用于后续实验研究，极大地减少了科研工作量。
本发明提供了一种由冷冻保护剂B和DMEM/F12培养基组成的胃癌干细胞冻存液及胃癌干细胞的冻存方法，本发明提供规定培养液成分简单，不含有血清，且能够实现对胃癌干细胞的稳定保存。本发明提供的方法简单易行，无需复杂仪器。实验表明，复苏后的GCSCs成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，CD44的表达也一样，说明成功获得用于冻存CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液。与新分选的GCSCs相比，冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β-actin表达量差异不明显。表明复苏的GCSCs状态好，可用于后续实验。
附图说明
图1示免疫荧光检测分选前后SGC7901细胞膜CD44的表达情况；其中，图1-a示未分选SGC7901细胞(×20)的细胞膜CD44的表达情况；图1-b示CD44(-)SGC7901细胞(×20)的细胞膜CD44的表达情况；图1-c示CD44(+)SGC7901细胞(×20)的细胞膜CD44的表达情况；
图2示免疫荧光检测冻存1冻存GCSCs细胞CD44的表达情况；其中，图2-a示新分选GCSCs形态(×4)；图2-b示新分选GCSCs的CD44表达(×20)；图2-c示以冻存液1冻存1个月后复苏GCSCs形态(×4)；图2-d示以冻存液1冻存1个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图2-e示以冻存液1冻存3个月后复苏GCSCs形态(×4)；图2-f示以冻存液1冻存3个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图2-g示以冻存液1冻存6个月后复苏GCSCs形态(×4)；图2-h示以冻存液1冻存6个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；
图3示免疫荧光检测冻存2冻存GCSCs细胞CD44的表达情况；图3-a示新分选GCSCs形态(×4)；图3-b示新分选GCSCs的CD44表达(×20)；图3-c示以冻存液2冻存1个月后复苏GCSCs形态(×4)；图3-d示以冻存液2冻存1个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图3-e示以冻存液2冻存3个月后复苏GCSCs形态(×4)；图3-f示以冻存液2冻存3个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图3-g示以冻存液2冻存6个月后复苏GCSCs形态(×4)；图3-h示以冻存液2冻存6个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；
图4示免疫荧光检测冻存液3冻存GCSCs细胞CD44的表达情况；图4-a示新分选GCSCs形态(×4)；图4-b示新分选GCSCs的CD44表达(×20)；图4-c示以冻存液3冻存1个月后复苏GCSCs形态(×4)；图4-d示以冻存液3冻存1个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图4-e示以冻存液3冻存3个月后复苏GCSCs形态(×4)；图4-f示以冻存液3冻存3个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图4-g示以冻存液3冻存6个月后复苏GCSCs形态(×4)；图4-h示以冻存液3冻存6个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；
图5示Western blot检测β-actin蛋白的表达；图5-a、5-b、图5-c分别为冻存液1组、冻存液2组、冻存液3组的western blot检测的β-actin蛋白条带图及β-actin蛋白的表达量扫描灰度值；其中，A示新分选GCSCs；B示冻存1个月后复苏GCSCs；C示冻存3个月后复苏GCSCs；D示冻存6个月后复苏GCSCs。
具体实施方式
本发明提供了胃癌干细胞冻存液及冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中：人胃癌SGC7901细胞与市场购得。RPMI-1640培养基、DMEM/F12(1:1)培养基(Hyclone公司)；胎牛血清、双抗、EGF、bFGF(Gibco公司)；B27培养基添加剂(Invitrogen公司)；人CD44免疫磁珠、MS分选柱、AutoMACS缓冲液(Miltenyi公司)；488anti-mouse/human CD44、488Rat IgG2b，κIsotype Ctrl(Biolegend公司)；胰酶细胞消化液(含酚红)、RIPA细胞裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏型ECL检测试剂盒(碧云天公司)；DMSO(二甲基亚砜)(Sigma公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific)；兔抗人β-actin单克隆抗体(1:1000)、兔二抗等(Abcam公司)；PVDF膜(硝酸纤维素膜)(millipore公司)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1人胃癌干细胞(GCSCs)分选、验证、培养
用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(青霉素、链霉素各100U/mL)，37℃、5％CO2培养箱中常规培养SGC7901细胞，待细胞增殖至80％左右汇合时传代。
选生长对数期的SGC7901制成单个细胞，采用免疫磁珠细胞分选(Magnetic cellsorting，MACS)技术分选GCSCs。阳性细胞用SFM培养基(95％DMEM/F12(1:1)培养基、2％B27、20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF和青霉素、链霉素各100U/mL)，37℃、5％CO2培养箱中常规培养GCSCs，待细胞增殖至80％左右汇合时传代。
CD44是表达于细胞膜表面的分子，经荧光抗体孵育后，在荧光显微镜下呈绿色荧光。用Alexa488anti-mouse/human CD44和Alexa488Rat IgG2bκIsotypeCtrl对筛选获得的GCSCs进行CD44表达验证，结果如图1。结果显示，未分选的SGC7901细胞，CD44阳性率约为10％；分选后CD44(-)SGC7901细胞，CD44阳性率低于3％；而分选后CD44(+)SGC7901细胞，可见大量CD44表达，阳性率在90％以上，说明MACS免疫磁珠分选效率较高，提示分选成功，CD44(+)SGC7901细胞确定为GCSCs。
实施例2胃癌干细胞的冻存
冻存液配方：
冻存液1：DMSO与DMEM/F12(1:1)培养基体积比3:7混合制得；
冻存液2：甘油与DMEM/F12(1:1)培养基体积比3:7混合制得；
冻存液3：小牛血清、DMEM与DMSO体积比7:2:1混合制得；
将已离心去上清液的胃癌干细胞(实施例1制得，对数期)分别以冻存液1～3重悬(重悬至密度为1×106/ml)，混匀，吹散，分装1ml至冻存管中，封口胶封口，做好标记，置于4℃冰箱30分钟，-20℃冰箱30～60分钟，最后置于-80℃或液氮中长期保存即可。分别于1个月、3个月和6个月后，重新复苏，然后检测细胞状态。检测包括：
1、CD44表达验证
用Alexa488anti-mouse/human CD44和Alexa488Rat IgG2b κIsotype Ctrl对GCSCs进行CD44表达验证，结果如图2～4。结果显示，以冻存液1保存的胃癌干细胞，在复苏后的GCSCs成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，CD44的表达也一样，说明成功获得用于冻存CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液；以冻存液2保存的胃癌干细胞，在复苏后的GCSCs形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，CD44的表达也一样，说明该冻存液是CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液；以冻存液3保存的胃癌干细胞，在复苏后的GCSCs数量与新分选的GCSCs比较显著减少，CD44的阳性表达细胞数也明显下降，说明该冻存液不是CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液。
2、Western blot验证β-actin蛋白的表达
提取三组细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，以40μg总蛋白/孔的量在12％SDS-PAGE进行电泳，转膜，封闭，加一抗(β-actin，1:1000)4℃孵育过夜，洗膜后，加二抗(1:2000)室温下孵育2h，ECL发光剂显影，拍照，ImageJ软件计算各条带的灰度值，对结果进行分析。分析采用SPSS 18.0统计软件分析，实验数据用平均值±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数间的比较采用one-way ANOVA，确定P＜0.05为差异有统计学意义。结果如图5和表1所示。
表1Western blot条带灰度值
组别 冻存液1 冻存液2 冻存液3
新分选GCSCs 1.00±0.11 1.00±0.09 1.00±0.08
1个月后复苏 0.89±0.12 0.98±0.07 0.40±0.01
3个月后复苏 0.88±0.01 0.95±0.09 0.10±0.00
6个月后复苏 0.85±0.06 0.96±0.10 0.00±0.00
结果显示，与新分选的GCSCs相B比，以冻存液1冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β-actin表达量差异不明显，表明复苏的GCSCs状态好，可用于后续实验；以冻存液2冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β-actin表达量差异不明显；以冻存液3冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β-actin表达量明显减少。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种胃癌干细胞冻存液，其特征在于，由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成；所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。
2.根据权利要求1所述的胃癌干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:(6～8)。
3.根据权利要求1所述的胃癌干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:7。
4.根据权利要求1～3任一项所述的胃癌干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂为DMSO。
5.一种胃癌干细胞的冻存方法，其特征在于，将胃癌干细胞以权利要求1～4任一项所述的胃癌干细胞冻存液重悬，0～4℃放置15min～60min；再-15℃～-25℃放置30～60min，然后不高于-80℃冻存。
6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至胃癌干细胞的密度为1×106cell/ml。
7.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述胃癌干细胞由胃癌细胞经磁珠分选制得。
8.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述胃癌干细胞的制备方法包括：
将胃癌细胞以含有10％FBS的RPMI-1640培养基培养至对数期后，制成单个细胞；
将所述单个细胞经CD44抗体磁珠筛选后用SFM培养基，培养至融合度为80％。
9.根据权利要求8所述的冻存方法，其特征在于，所述胃癌细胞为SGC7901细胞。
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