CN108474035B

CN108474035B - 利用猪特异游离dna监测异种移植免疫排斥反应的方法和引物

Info

Publication number: CN108474035B
Application number: CN201680011809.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡志明; 牟丽莎; 周明; 邓阳阳; 陆赢
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: CN108474035A; WO2018082037A1

Abstract

一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法和引物，所述方法用于以猪为供体的受体对象中异种移植免疫排斥反应的监测，所述方法包括使用对猪特异游离DNA具有特异性扩增的引物，对受体血浆DNA样本，进行荧光定量PCR扩增，以定量受体血浆中猪特异游离DNA的量。通过荧光定量PCR扩增以定量血浆中猪特异游离DNA，所述方法具有非侵入性、特异性强、灵敏度高、简便、检测费用低、可连续监测等优点，具有广阔的市场运用前景。

Description

利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法和引物

技术领域

本发明涉及器官移植技术领域，尤其涉及异种器官移植技术领域，特别涉及一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法和引物。

背景技术

细胞、组织及器官移植是治疗器官功能衰竭、癌症等重大疾病的有效治疗策略。然而，我国乃至全世界都面临着供体严重短缺的局面。异种移植是目前解决人类供体短缺最有效的策略之一，可挽救大量因器官功能衰竭而死亡的病人生命。目前，将基因改造猪心脏移植到狒狒体内可存活长达945天；将猪肾脏移植到狒狒体内可存活长达10个月(TTS 2016最新报告数据)；将猪胰岛移植到糖尿病病人体内可维持血糖稳定超过804天。异种器官或组织移植的生存期有望通过多基因修饰得到进一步延长。尽管如此，免疫排斥仍然是异种移植领域中难以攻克的研究难题，因此对宿主免疫排斥反应的实时监测尤为重要。

排斥反应的临床诊断主要依赖于病人症状以及实验室检测数据(如组织活检、血液生化、免疫检测)等指标，其都具有各自的局限性。病人临床症状具有非特异性、主观性以及相对滞后性。其次，尽管组织活检是判断免疫排斥反应的“金标准”，但其具有侵入性、检测费用高等缺点。血液生化如血液肌酐水平、尿液白蛋白等可反映肾脏的功能受损状态，但其具有灵敏度低的缺点。免疫学检测如T/B细胞计数、细胞炎症因子等可反映宿主的免疫状态，但其具有特异性差的缺点。例如，Clinical Trials in Organ Transplantation(CTOT)-05研究显示，免疫相关的生物标记物与免疫排斥金标准-组织活检结果无显著相关性，包括活化T细胞、抗人白细胞抗原(HLA)II类、抗供体特异性抗体等。目前，针对异种移植免疫排斥反应的检测方法尤为缺乏，大多照搬同种异体移植的检测方法。因此，针对异种移植发展具有特异性强、灵敏度高(早期的)、非侵入、快速、费用低等优点的生物标记物及其检测方法具有实际迫切性和广阔的市场运用前景。

人体血液中存在一定量的游离DNA，主要来源于细胞凋亡和细胞坏死。由于机体的免疫稳定、免疫监视等作用，衰老细胞、肿瘤细胞、异体(种)细胞在免疫效应细胞和细胞因子等共同作用下发生凋亡或者坏死，释放DNA片段到血液中，成为游离DNA。

血液中存在癌症相关的DNA片段，通过芯片和高通量测序捕获癌症突变序列和突变DNA含量等信息，从而为癌症的早期诊断与治疗提供个性化方案。近期报道称，在同种异体器官移植中利用性别特异的单拷贝Y染色体SRY位点对男至女(man-to-women)的肾移植进行肾损伤评价，结果发现该位点可作为肾损伤的快速、非侵入性生物标记物，但该生物标记物的应用范围相对有限。利用供体基因组与受体基因组的SNP差异，通过基因芯片和高通量测序对血浆中供体特异的SNP进行定量，可对病人是否发生排斥反应给出判断。然而，该类方法具有检测费用高、耗时长等缺点。

发明内容

本发明提供一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法和引物，具有特异性强、灵敏度高、非侵入、快速、费用低、便于实时监测的优点。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种利用猪特异游离DNA监测猪到人或非人灵长类异种移植免疫排斥反应的方法中所使用的引物，上述引物的序列如下：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)。

根据本发明的第一方面，本发明还提供一种利用猪特异游离DNA监测猪到小鼠异种移植免疫排斥反应的方法中所使用的引物，上述引物的序列如下：

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法，该方法用于以猪为供体的受体对象中异种移植免疫排斥反应的监测，上述方法包括使用对猪特异游离DNA具有特异性扩增的引物，对受体血浆DNA样本，进行荧光定量PCR扩增，以定量受体血浆中猪特异游离DNA的量。

进一步地，上述方法还包括上述引物的设计和筛选，其中上述引物的设计包括：通过比对受体基因组与供体猪基因组，获得供体猪特异的基因组序列；以及通过高通量测序捕获受体和供体血浆中游离DNA的序列和丰度信息，根据游离DNA的断裂模式，避免引物跨片段设计，根据特异性、丰度以及荧光定量PCR引物的设计原则得到候选引物；上述引物的筛选包括：通过PCR验证上述候选引物在受体和供体DNA中的特异性，选取在供体DNA中有特异性扩增而在受体DNA中无特异性扩增的引物。

进一步地，上述引物的序列如下：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)。

进一步地，上述引物的序列如下：

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

进一步地，上述受体对象是人、非人灵长类动物或除猪以外的所有哺乳动物。其中，非人灵长类动物包括但不限于食蟹猴、狒狒、猩猩等，除猪以外的所有哺乳动物包括但不限于小鼠等。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法中所使用的试剂盒，该试剂盒包括引物，上述引物通过如下方法获得：通过比对受体基因组与供体猪基因组，获得供体猪特异的基因组序列；以及通过高通量测序捕获受体和供体血浆中游离DNA的序列和丰度信息，根据游离DNA的断裂模式，避免引物跨片段设计，根据特异性、丰度以及荧光定量PCR引物的设计原则得到候选引物；上述引物的筛选包括：通过PCR验证上述候选引物在受体和供体DNA中的特异性，选取在供体DNA中有特异性扩增而在受体DNA中无特异性扩增的引物。

进一步地，上述引物的序列如下：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)；或者

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

进一步地，上述试剂盒还包括：用于进行荧光定量PCR扩增的试剂成分。

考虑到人类基因组DNA与供体猪基因组DNA序列同源性小于70％，存在较大的序列差异，可区分供体(猪)与受体(人)来源的游离DNA，可通过荧光定量PCR(qPCR)及高通量测序对猪特异游离DNA进行精确定量。本发明利用猪特异游离DNA监测移植物存活与免疫排斥反应，通过qPCR扩增以定量血浆中猪特异游离DNA，本发明的方法具有非侵入性、特异性强、灵敏度高、简便、检测费用低、可连续监测等优点，具有广阔的市场运用前景。

附图说明

图1为梯度PCR确定猪特异扩增引物条件。星号(*)表示在猪DNA中有特异性PCR扩增而无杂带。

图2为引物物种特异性鉴定。普通PCR鉴定引物物种特异性(A)，星号(*)表示在猴或者人基因组DNA中无PCR扩增，井号(#)表示在小鼠基因组DNA中无PCR扩增；qPCR分别针对第4号引物(B)和第11号引物(C)建立标准曲线，Y值为仪器读数Ct值，X为样品拷贝数，图2(B)所示的标准曲线的R＝0.997，图2(C)所示的标准曲线的R＝0.999。

图3为体外评价猪特异游离DNA与补体杀伤的相关性。人血清或猴血清与PIEC细胞共孵育的细胞形态变化(A)，人血清处理细胞(B)或猴血清处理细胞(C)后，cpsDNA与细胞活力丢失的相关性。hrs：小时，CDC：补体依赖的杀伤，cpsDNA：猪特异的游离DNA，r：相关系数，标尺：135μm。

图4为体内(猪-小鼠细胞移植与活体成像)评价猪特异游离DNA与免疫排斥的相关性。细胞注射、活体成像、取血时间点的实验设计(A)，其中一只小鼠注射细胞后不同时间点细胞排斥情况(B)，注射PIEC^luc组(C)或注射无细胞的PBS组(D)相对荧光素酶(Luciferase)活性与cpsDNA的比较分析，cpsDNA与抗猪IgG抗体(E)、抗猪IgM抗体(F)的比较分析。PIEC^luc：稳定表达荧光素酶的猪髋动脉内皮细胞，PBS：磷酸缓冲液，m1/m2/m3：小鼠编号，IgG/IgM：免疫球蛋白G/M。

图5为体内(猪-小鼠细胞移植与活体成像)评价猪特异游离DNA是否能反映雷帕霉素的免疫抑制效果。不同时间点通过活体成像观察细胞荧光素酶(Luciferase)信号强度变化(A)，不同时间点通过qPCR检测cpsDNA水平变化(B)，pAEC^luc：稳定表达荧光素酶的原代猪主动脉内皮细胞，cpsDNA：猪特异的游离DNA，Rapa：雷帕霉素。

图6为体内(猪-食蟹猴动脉补片移植模型)评价猪特异游离DNA与常规免疫学指标(IgG/IgM)的比较。A和B为移植第1例移植，C和D为第2例移植，E和F为第3例移植。cpsDNA：猪特异的游离DNA，IgG/IgM：免疫球蛋白G/M。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

一、实验方法

1.高通量测序与生物信息学分析

利用生物信息学方法分别BLAST比对人类基因组、猴基因组与猪基因组，获得供体猪高度特异的基因组序列，用于qPCR扩增引物设计。抽提人血浆、猴血浆、猪-猴动脉补片移植血浆、猪血浆中DNA，通过Illumina HiSeqX(PE150)高通量测序捕获血浆中游离DNA的序列和丰度信息。一方面，比较人、猴、猪血浆中游离DNA的断裂模式，避免引物设计跨片段设计；另一方面，通过统计分析筛选特异、高丰度、满足qPCR引物设计原则的候选靶序列，共设计了19对候选引物，如表1所示。

表1猪特异DNA定量引物

2.引物特异性验证及定量方法的建立

(1)体外验证引物扩增特异性

利用基因组DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)分别抽提人HepG2、猴Vero及猪PIEC细胞中基因组DNA及培养上清的游离DNA；利用梯度PCR(退火温度梯度升高)对19对候选引物进行特异性验证，筛选特异性高的引物。反应体系如下：

(2)验证引物种属特异性

利用血液基因组DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)抽提人血、猴血、猪-猴(动脉补片移植猴)血及猪血中基因组DNA，利用(1)中筛选得到的特异引物对游离异种DNA进行检测以进一步验证引物特异性。反应体系如2(1)所示。

(3)游离异种DNA绝对定量方法的建立

1)猪特异游离DNA的特异扩增引物用于后续实验验证：

食蟹猴模型或者人中使用第4号引物：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)。

小鼠模型中使用的第11号引物：

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

2)利用Ex Taq(TAKARA，大连，中国)及特异扩增引物通过普通PCR扩增猪特异DNA片段，将其连接到T载体(pMD19-T，TAKARA，大连，中国)中，构建包含游离异种DNA片段的质粒。

3)计算质粒的摩尔分子质量或利用1个碱基对约等于650道尔顿进行计算，通过阿伏伽德罗常数(6.02×10²³/mol)计算质粒拷贝数并配制不同拷贝数的标准品。

4)通过条件摸索，分别配制质粒拷贝数为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸的反应体系如下：

qPCR仪程序如下：预变性95℃，5min；变性95℃，15s；退火60℃，45s。得到溶解曲线(退火温度60℃)。使荧光定量的扩增效率＝100％±5％，在较大浓度梯度范围(浓度梯度数≥5个)内实现R≈1(R越接近1，吻合度越高)。

3.利用CDC体外评价游离异种DNA与补体杀伤力的相关性

(1)复苏猪髋动脉内皮细胞系(PIEC)，37℃、5％CO₂培养24小时。

(2)胰酶消化细胞，接种细胞至96孔板，细胞密度为30％；37℃、5％CO₂培养12小时后细胞密度约为50％～70％。

(3)DMEM培养基(Gibco，格兰德艾兰，美国)中分别加入20％人血清、猴血清及各自的灭活血清(56℃水浴30min灭活)，即分为4个处理组，混匀。

(4)加入含有不同血清的培养液至细胞培养孔中，每组6个重复，标记为“3小时处理”，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(5)向新的细胞培养孔中加入含有不同血清的培养液，每组6个重复，标记为“2小时处理”，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(6)向新的细胞培养孔中加入含有不同血清的培养液，每组6个重复，标记为“1小时处理”，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(7)向新的细胞培养孔中加入含有不同血清的培养液，每组6个重复，标记为“0小时处理”。

(8)分别收集培养上清，加入细胞凋亡与增殖试剂CCK8(YESEN，上海，中国)，37℃、5％CO₂培养1～4小时，利用酶标仪于450nm波长下检测样品OD值变化。

(9)培养上清3000×g离心5min后，利用血清/循环DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)抽提DNA。

4.猪-小鼠细胞移植活体成像模型中评价猪特异游离DNA监测移植物排斥

(1)稳定表达荧光素酶的猪细胞的构建与鉴定

1)将含荧光素酶报告基因的慢病毒(YESEN，上海，中国)加入到猪髋动脉内皮细胞系(PIEC)或猪猪动脉内皮细胞(pAEC)中，加入5μg/ml聚凝胺(polybrane，Sigma，上海，中国)，感染12小时后，换新鲜培养基。

2)细胞培养48小时，加入2μg/ml嘌呤霉素(puromycin，Invivogen，圣地亚哥，美国)筛选48小时。

3)通过相差显微镜记录细胞存活情况，并利用荧光素酶底物荧光素(luciferin)(YESEN，上海，中国)确认细胞是否具有荧光素酶活性。

(2)猪-小鼠细胞移植、血清收集及活体成像

1)移植前3天，通过下颌静脉取血法，获得约100μL全血，将C57BL/6小鼠背部和腹部毛发去掉并记录小鼠体重。

2)在移植当天，将细胞以至少5×10⁶/只的细胞量通过皮下移植到C57BL/6小鼠或裸鼠体内；约2小时后，向小鼠腹腔内注射15mg/ml的荧光素(10μl每1g小鼠体重)，通过活体成像仪记录小鼠体内荧光素酶信号强度，最后在麻醉状态下通过下颌静脉取血约100μL。

3)移植后第3天、第6天、第9天、第12天、第15天分别进行血清收集和活体成像。

4)所有收集的全血通过5000×g离心5min，共两次，分离得到小鼠血清。

5)20～40μl小鼠血清，通过血清/循环DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)抽提游离DNA，通过2(3)中的反应体系与方法，检测血清中猪特异游离DNA的拷贝数。

6)猪特异的抗体(IgG/IgM)水平，利用猪红细胞抗体结合实验通过流式细胞仪进行定量检测。

5.猪-小鼠细胞移植活体成像模型中评价猪特异游离DNA是否反应雷帕霉素免疫抑制效果

(1)配置雷帕霉素注射液：雷帕霉素(Selleck，上海，中国)溶解在含5％吐温80和5％聚乙二醇400的磷酸缓冲液(PBS)中。

其中，PBS配置方法为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加入800mL去离子水，调pH 7.4，补去离子水至1000mL。

(2)细胞移植前3天，不同剂量的雷帕霉素(雷帕霉素质量/小鼠体重：0.5mg/kg，0.1mg/kg，0mg/kg)通过腹腔注射到C57/BL6小鼠体内，每天注射一次。

(3)细胞移植、血清收集及活体成像如4(2)所示。

(4)20～40μl小鼠血清，通过血清/循环DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)抽提游离DNA，通过2(3)中的反应体系与方法，检测血清中猪特异游离DNA的拷贝数。

6.猪-猴动脉补片移植模型中猪特异游离DNA与免疫学指标的特异性比较

(1)移植实验共进行3例，即五指山猪颈动脉通过血管缝合术移植到食蟹猴腹主动脉上。

(2)收集移植前、移植后第1周、第2周、第4周、第7周的血样(抗凝管收集)，1700rpm、4℃水平离心5min分离血浆与血细胞。

(3)利用FACS进行T/B细胞计数。

(4)将步骤(2)中血浆转移至新的离心管中，3000×g，4℃离心5min(离心两次以充分去除有核细胞)，分装冻存。

(5)分离猪红细胞，并与各时间点移植猴灭活血浆(56℃水浴30min灭活)进行抗体(IgG/IgM)结合实验，通过流式细胞仪检测移植猴血浆中抗体结合到猪红细胞上的水平。

(6)400μL小鼠血清，通过血清/循环DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)抽提游离DNA，通过2(3)中的反应体系与方法，检测血清中猪特异游离DNA的拷贝数。

二、实验结果

依据上述实验方法，取得以下实验结果：

1.设计的qPCR引物，对猪DNA特异性扩增有11对，如图1所示。进一步，获得了在食蟹猴或人中可特异扩增猪DNA的引物(第4号引物)，在小鼠模型中可特异扩增猪DNA的引物(第11号引物)，结果如图2A所示。分别针对第4号和第11号引物构建了标准曲线，结果如图2B和图2C所示。

2.在补体依赖的杀伤实验中，通过第4号引物对培养上清中猪特异游离DNA水平的定量，结果显示猪特异游离DNA与补体杀伤时间呈正比，二者相关性系数r大于95％。结果如图3所示，说明猪特异游离DNA可体外用于补体杀伤的检测。

3.在猪-小鼠细胞移植和活体成像实验中，荧光素酶信号在第3～6天之间急剧下降，第9天及以后时间点基本上检测不到，而猪特异的游离DNA水平于0～3天开始上升，3～6天急剧升高，第6天或第9天达到峰值，说明猪特异游离DNA水平可准确反映移植物的排斥；相较于抗猪IgG和IgM的水平，猪特异游离DNA上升更早，下降更快，更加拟合荧光素酶信号，说明猪特异游离DNA是更为早期、特异的生物标记物。结果如图4所示。

4.在猪-小鼠细胞移植和活体成像实验中，猪特异游离DNA剂量依赖地反映雷帕霉素的免疫抑制效果，说明猪特异游离DNA可用于免疫抑制剂的优化。结果如图5所示。

5.在猪-猴动脉补片移植模型中，相较于抗猪IgG和IgM的水平，猪特异游离DNA更为特异地反映移植物的排斥反映。结果如图6所示。

总而言之，本发明可用于以猪为供体的移植领域，可准确反映移植物的免疫排斥。相较于常规免疫排斥反应的检测方法，本发明通过qPCR扩增以定量血浆中猪特异游离DNA，具有非侵入性、特异性强、灵敏度高、简便、检测费用低、可连续监测等优点，具有广阔的市场运用前景。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民医院

<120> 利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法和引物

<130> 17F24989-C23403

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 21

tgccgtggtt tccgttgctt g 21

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 22

tcacatttga tggtcgtctt gtcgtct 27

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 23

gctacttaca aacctccctc ctcctt 26

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 24

tcagtctcgc tgatgcctta tcc 23

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 25

gggaggtgat ggtggcaggt a 21

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 26

ggagggacag aggtgttgag gaa 23

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 27

tctgggtctc caccgcttct tt 22

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 28

catttgtact gactactcca atcccttgt 29

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 29

agccaggtga aggcggcggc act 23

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 30

ccagacgcac ttgactcttg gccttgaga 29

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 31

aataatgctg cctgccctgc tc 22

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 32

cccacaaccc aaactgcttc cta 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 33

tctgctgagc cacaagggaa tgt 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 34

aaacggacct gaagaagccg aaa 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 35

aaatagatga gcagccaacc aaga 24

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 36

ccattagacc gccagggaac 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 37

tgccgtggtt tccgttgctt g 21

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 38

tcacatttga tggtcgtctt gtcgtct 27

Claims

1.一种利用猪特异游离DNA监测猪到人或非人灵长类异种移植免疫排斥反应的方法中所使用的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)。

2.一种利用猪特异游离DNA监测猪到小鼠异种移植免疫排斥反应的方法中所使用的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

3.一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法，其特征在于，所述方法用于以猪为供体的受体对象中异种移植免疫排斥反应的监测，所述方法包括使用对猪特异游离DNA具有特异性扩增的引物，对受体血浆DNA样本，进行荧光定量PCR扩增，以定量受体血浆中猪特异游离DNA的量，所述方法还包括所述引物的设计和筛选，其中所述引物的设计包括：通过比对受体基因组与供体猪基因组，获得供体猪特异的基因组序列；以及通过高通量测序捕获受体和供体血浆中游离DNA的序列和丰度信息，根据游离DNA的断裂模式，避免引物跨片段设计，根据特异性、丰度以及荧光定量PCR引物的设计原则得到候选引物；所述引物的筛选包括：通过PCR验证所述候选引物在受体和供体DNA中的特异性，选取在供体DNA中有特异性扩增而在受体DNA中无特异性扩增的引物；

当受体对象为食蟹猴或人时，所述引物的序列如下：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)；

当受体对象为小鼠时，所述引物的序列如下：

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

4.一种利用猪特异游离DNA监测异种移植免疫排斥反应的方法中所使用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物，所述引物通过如下方法获得：通过比对受体基因组与供体猪基因组，获得供体猪特异的基因组序列；以及通过高通量测序捕获受体和供体血浆中游离DNA的序列和丰度信息，根据游离DNA的断裂模式，避免引物跨片段设计，根据特异性、丰度以及荧光定量PCR引物的设计原则得到候选引物；所述引物的筛选包括：通过PCR验证所述候选引物在受体和供体DNA中的特异性，选取在供体DNA中有特异性扩增而在受体DNA中无特异性扩增的引物；

当受体为食蟹猴或人时，所述引物的序列如下：

正向引物：5’-TTCAATCCCACTTCTTCCACCTAA-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CTTCATTCCATCTTCATAATAACCCTGT-3’(SEQ ID NO：8)；

当受体为小鼠时，所述引物的序列如下：

正向引物：5’-TGCCGTGGTTTCCGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：21)；

反向引物：5’-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCT-3’(SEQ ID NO：22)。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于进行荧光定量PCR扩增的试剂成分。