CN108474000A - 用于表达蛋白质的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和转运体囊泡)中的电穿孔介导的基因递送。

Description

用于表达蛋白质的系统和方法
本申请根据35U.S.C.§119要求于2015年11月25日提交的系列号为62/259,788的美国临时申请的优先权权益，本申请以该申请的内容为基础，并其通过引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和药物转运体囊泡、微粒体或细胞级分)中的电穿孔介导的基因递送。
发明背景
重组蛋白的表达在研究、工业和制药生物技术行业的许多方面都很重要。例如，药物代谢酶和转运蛋白的表达在药物发现和开发中经常是至关重要的。对于许多这些蛋白质来说，由于需要正确的翻译后修饰(例如糖基化或硅烷化(silation))，哺乳动物细胞中的表达优于原核细胞中的表达。
已知几种用于产生表达重组蛋白的宿主细胞的方法。在最基本的方法中，将含有编码异源蛋白质的基因和适当调节区的核酸构建体引入宿主细胞中并使之整合。引入方法包括磷酸钙沉淀、显微注射和脂质转染。在其他方法中，使用选择性方案来扩增引入的核酸构建体。在这些方法中，细胞用编码可扩增选择性标记物的基因和编码异源蛋白的基因共转染(参见例如Schroder和Friedl,Biotech.Bioeng.53(6):547-59(1997))。选择初始转化体后，通过逐渐增加培养基中的选择剂(例如二氢叶酸还原酶)来被扩增转染的基因。在某些情况下，通过这些程序可将外源基因扩增数百倍。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的其他方法利用使用附加型载体(例如质粒)的转染。
目前制备用于表达重组蛋白的哺乳动物细胞系的方法存在几个缺点。这些问题包括细胞毒性、不能递送较大的基因或遗传构建体、批次间表达水平的显著不一致、不稳定的表达、和所表达蛋白质的不适当定位、翻译后修饰和/或折叠。因此，本领域需要制备表达重组蛋白的宿主细胞的改良方法。
发明内容
本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和药物转运体囊泡、微粒体或细胞级分)中的电穿孔介导的基因递送。
例如，在一些实施方式中，本公开提供了产生膜结合蛋白的方法，所述膜结合蛋白包括囊泡或微粒体中的那些。在一些实施方式中，该方法包括：a)使哺乳动物细胞(例如HEK293，CHO，Hela，S2，MDCK-1，MDCK-II，LLC-PK1，Caco-2，Huh7和V79细胞)与编码膜结合蛋白(例如转运蛋白(例如ABCB1，ABCB4，ABCB11，ABCC1，ABCC2，ABCC3，ABCC4，ABCC5，ABCC6，ABCG2或其同源物)的核酸接触；b)电穿孔该哺乳动物细胞使得所述核酸进入所述哺乳动物细胞；和c)分离包含感兴趣的膜结合蛋白的细胞膜。
在一些实施方式中，哺乳细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞是非人灵长类动物细胞，大鼠细胞，小鼠细胞，仓鼠细胞，狗细胞或猪细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是杂交瘤。
在一些实施方式中，该方法还包括在电穿孔步骤后培养细胞的步骤(例如，在丁酸钠存在下)。在一些实施方式中，分离步骤包括均质化。在一些实施方式中，感兴趣的膜结合蛋白包含与天然膜结合蛋白相似的翻译后修饰。在一些实施方式中，该方法还包括使膜结合蛋白与测试化合物(例如药物)接触的步骤。
进一步的实施方式提供了通过任何上述方法产生的分离的囊泡或微粒体。
在一些实施方式中，本公开提供了产生包含感兴趣蛋白质的细胞级分(例如膜或胞质级分)的方法。在一些实施方式中，感兴趣的蛋白质是药物代谢酶(DME)。在一些实施方式中，DME是细胞色素P450(例如CYP1A1，CYP1B1，CYP2A6，CYP2B6，CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C18，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A5，CYP3A7，CYP3A4，CYP4F2或CYP2J2)，醛氧化酶(AO)，黄素单加氧酶(FMO)，单胺氧化酶A和B(MAO A和B)，N-乙酰转移酶(NAT1和NAT2)，磺基转移酶(SULT1A，SULT1B，SULT1C，SULT1E，SULT2A，SULT2B，SULT4A)，酯酶(例如羧酸酯酶1(CES1)，羧酸酯酶2(CES2)，对氧磷酶1(PON1)，羧基亚甲基丁烯酸内酯酶(CMBL)，丁酰胆碱酯酶(BChE)，芳基乙酰胺脱乙酰酶(AADAC)，或碱性磷酸酶(AP)，或尿苷5'-二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)(例如，UGT1A1，UGT1A3，UGT1A4，UGT1A5，UGT1A6，UGT1A7，UGT1A8，UGT1A9，UGT1A10，UGT2A1，UGT2A2，UGT2A3，UGT2B4，UGT2B7，UGT2B10，UGT2B11，UGT2B15，UGT2B17，或UGT2B28)。
其他实施方式提供筛选测试化合物的方法，其包括：a)获得如上文或本文所述的蛋白质；和b)使该蛋白质与测试化合物接触。在一些实施方式中，该方法还包括测定由转运蛋白转运测试化合物的步骤。在一些实施方式中，所述测定包括测定转运动力学。在一些实施方式中，该方法还包括评估由所述蛋白质(例如DME)对测试化合物的修饰的步骤。
在一些实施方式中，该方法还包括使所述蛋白质与抑制剂接触并测定抑制剂对底物的活性、转运或修饰的抑制作用的步骤。
本文描述了另外的实施方式。
附图说明
图1A和B显示(1A)在使用不同量的人MDR1/P-gp DNA对粘附的HEK293细胞进行电穿孔后活细胞的百分比。图1B显示电穿孔和回收后获得的活细胞的总量。
图2A和B显示了在EP后的T＝0、24小时和48小时处的总活细胞数(图2A)和活细胞百分比(图2B)。
图3显示了用增加量的DNA转染的细胞单层在T＝24小时和T＝48小时处的显微照片(图3A)。图中记录活细胞的百分比(图3B)。
图4显示与用MDR1/P-gp囊泡孵育5分钟后的N-甲基奎尼丁(NMQ)摄取活性，所述MDR1/P-gp囊泡由用不同量DNA(100μg/ml，200μg/ml，300μg/mL和400μg/ml MDR1)转染且在电穿孔后以悬浮或粘附形式培养的HEK293细胞所制备。
图5显示了hBCRP囊泡中的雌酮-3-硫酸酯(E3S)摄取活性。
图6显示了hMRP2囊泡中的CDCF摄取活性。
图7显示用MDR1/P-gp囊泡孵育5分钟后的NMQ摄取活性，所述MDR1/P-gp囊泡通过使用小规模EP装置(OC-400)或大规模EP装置(CL-2袋)用300ug/mL MDR1cDNA转染并在电穿孔后以悬浮形式培养的HEK293细胞来制备。
图8A是显示AO活性对比浓度的图，图8B显示市售系统与HEK293细胞中就rAO的V最大的比较。图8A和B显示，当使用探针底物酞嗪时，用转染的HEK293细胞制备的重组I相药物代谢酶醛氧化酶(AO)显示出标准的米氏动力学曲线。
图9A和B显示通过电穿孔递送到HEK293细胞中(然后在收获前悬浮培养24-72小时)的II相药物代谢酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)cDNA的微粒体活性(9A)和微粒体产率(9B)。
图10显示HEK293微粒体中UGT1A1的活性。
定义
为了便于理解本公开，下面定义了许多术语。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核细胞(例如，哺乳动物细胞，禽类细胞，两栖类细胞，植物细胞，鱼细胞和昆虫细胞)，无论其位于体外还是体内。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如人细胞)，包括培养的细胞，原代细胞培养物和永生化细胞培养物。
如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。在该术语中包括连续细胞系(例如具有永生表型)，原代细胞培养物，有限细胞系(例如未转化的细胞)和体外维持的任何其他细胞群，包括卵母细胞和胚胎。
如本文所用，术语“载体”是指当与适当的控制元件关联时能够复制并在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如质粒，噬菌体，转座子，粘粒，染色体，病毒，病毒粒子等。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
如本文所用，术语“基因组”是指生物体的遗传物质(例如，染色体)。
如本文所用，术语“感兴趣的蛋白质”或“感兴趣的膜结合蛋白”是指由感兴趣的核酸编码的蛋白质。
如本文所用，术语“感兴趣的膜结合蛋白”是指以其天然或非天然状态跨越(span)细胞膜、结合细胞膜或与细胞膜关联的蛋白质。
如本文所用，术语“外源基因”是指不是天然存在于宿主生物体或细胞中的基因，或是人工引入到宿主生物体或细胞中的基因。
术语“基因”是指包含产生多肽或其前体(如胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(如DNA或RNA)序列。只要全长或片段的所需活性或功能特性(例如，酶促活性，配体结合，信号转导等)得以保留，多肽可由全长编码序列编码或由编码序列的任何部分编码。该术语还包括结构基因的编码区，并且包括位于5'和3'末端的编码区附近的序列，其在各端有约1kb或更大的距离，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'并存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于编码区3'或下游并存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包括被称为“内含子”或“间插区域”或“间插序列”的非编码序列隔开的编码区域。内含子是被转录为核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可包括调控元件，如增强子。内含子被从核或初级转录物中去除或“剪切掉”；因而内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。翻译期间mRNA的功能是确定初生多肽中的氨基酸顺序或序列。
如本文所用，术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(即通RNA聚合酶的酶促反应)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA，rRNA，tRNA或snRNA)的过程，和，对于编码蛋白质的基因而言，通过mRNA的“翻译”将所述遗传信息转化为蛋白质的过程。可以在该过程的许多阶段对基因表达进行调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)生产的调节，而“下调”或“抑制”是指减少生产的调节。参与上调或下调的分子(例如转录因子)通常分别被称为“激活剂”和“阻遏物”。
当本文述及“氨基酸序列”用于表示天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”等术语如“多肽”或“蛋白质”并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整、天然氨基酸序列。
如本文所用，术语“编码核酸分子”，“编码DNA序列”，“编码DNA”，“编码RNA序列”和“编码RNA”是指沿着脱氧核糖核酸链或核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序决定了沿多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此DNA或RNA序列编码氨基酸序列。
本文所用术语“可操作组合”、“可操作的顺序”和“可操作地连接”表示核酸序列的连接，以此方式核酸分子能够指导给定基因的转录和/或生成所需蛋白质分子的合成。该术语还表示以生成功能性蛋白的方式存在的氨基酸序列的连接。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由但不限于试管和细胞培养物组成。术语“体内”是指自然环境(例如动物或细胞)和在自然环境中发生的过程或反应。
如本文所用，术语“纯化”是指从其自然环境中移出的分子(核酸或氨基酸序列)被分离或分开。因此“分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％不含，优选至少75％不含，并且更优选至少90％不含与其天然关联的其他组分。
术语“测试化合物”是指预期可用于研究、诊断或治疗应用的任何化学实体、药物、药品等。测试化合物包括具有已知和未知性质和活性的化合物。通过使用本公开内容的筛选方法进行筛选，可以就任何数量的性质对与重组蛋白(例如转运蛋白或药物代谢酶)相互作用的测试化合物进行评估。
发明详述
本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和转运体)中的电穿孔介导的基因递送。
使用与用重组蛋白或细胞进行药物ADME研究相关的几种模型。例如，SupersomesTM药物代谢酶，ABC(ATP结合盒)转运体囊泡和TransportoCells TM SLC转运体细胞(纽约康宁公司(Corning，NY))是含有用于体外测定的过表达重组药物代谢酶的昆虫细胞膜或胞质级分。ABC转运体囊泡从内部翻转出膜囊(例如，最初面向细胞内部的官能团被翻转到外部以使其可接近药物)。ABC囊泡被认为是研究ABC转运体参与药物处置(drug disposition)的“黄金标准”。目前，大多数囊泡是通过病毒递送方法使用昆虫细胞/杆状病毒表达系统(BEV)制备的。由于BEV表达系统的性质，产品会受到低活性和批次间性能不一致的影响。
因此，本公开的实施方式提供了通过电穿孔在哺乳动物细胞(例如HEK293或CHO细胞)中产生重组蛋白(例如药物代谢酶膜/胞质级分和ABC转运体囊泡)的改进系统和方法。电穿孔后，培养细胞(例如2-3天)。当感兴趣的蛋白质被表达时，表达的蛋白质得到正确的翻译后修饰，并靶向细胞或细胞膜中的正确位置。培养后，收获细胞并制备细胞级分(例如膜级分，胞质级分)。
在一些实施方式中，在电穿孔后向培养物补充丁酸钠以增强蛋白质表达以获得更高的活性。在一些实施方式中，不使用丁酸钠。
本文所述的系统和方法可用于表达多种药物代谢酶(DME)和药物转运体囊泡、微粒体或细胞级分。在一些实施方式中，本文所述的方法可用于表达在其他表达系统(例如大肠杆菌(E.coli)或昆虫细胞)中产生低活性的“难以表达”的复杂膜蛋白。通过本文描述的方法制备的囊泡或膜级分直接解决了现有囊泡产品的缺点：活性低，不太“类似于人”和批次间变化大。
本公开内容不限于使用本文描述的系统和方法进行表达的特定蛋白质。示例包括但不限于DME(例如，在胞质或膜细胞级分中)和转运蛋白(例如在囊泡中)。
DME的示例包括但不限于：细胞色素P450(CYP)(例如CYP1A1，CYP1B1，CYP2A6，CYP2B6，CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C18，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A5，CYP3A7，CYP3A4，CYP4F2或CYP2J2)，源自任何数量的物种，醛氧化酶(AO)，黄素单加氧酶(FMO)，单胺氧化酶A和B(MAO A和B)，N-乙酰转移酶(NAT1和NAT2)，磺基转移酶(SULT1A，SULT1B，SULT1C，SULT1E，SULT2A，SULT2B，SULT4A)，酯酶(例如羧酸酯酶1(CES1)，羧酸酯酶2(CES2)，对氧磷酶1(PON1)，羧基亚甲基丁烯酸内酯酶(CMBL)，丁酰胆碱酯酶(BChE)，芳基乙酰胺脱乙酰酶(AADAC)，或碱性磷酸酶(AP)，或尿苷5'-二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)，如表1所示。显示了示例性的UGT同源物(例如大鼠，小鼠，狗和猴)。人类基因名称首先列出。提供了该基因的OMIM登录号，提供了野生型基因和蛋白质以及常见等位基因变体的核酸和肽序列的链接。
表1
基因名称 全名 OMIM登录号
UGT1A1 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A1 191740
UGT1A3 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A3 606428
UGT1A4 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A4 606429
UGT1A5 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A5 606430
UGT1A6 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A6 606431
UGT1A7 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A7 606432
UGT1A8 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A8 606433
UGT1A9 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A9 606434
UGT1A10 UDP-糖基转移酶1家族，多肽A10 606435
UGT2A1 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员A1 604716
UGT2A2 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员A2 604716
UGT2A3 尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶2家族，成员A3 616382
UGT2B4 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B4 600067
UGT2B7 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B7 600068
UGT2B10 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B10 600070
UGT2B11 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B11 603064
UGT2B15 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B15 600069
UGT2B17 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B17 601903
UGT2B28 尿苷二磷酸糖基转移酶2家族，成员B28 606497
药物转运体的例子包括但不限于下表2中的那些。人类基因名称首先列出。示例性同源物(例如，大鼠，小鼠，狗和猴)显示为小写字母，首字母大写。提供了该基因的OMIM登录号，提供了野生型基因和蛋白质以及常见等位基因变体的核酸和肽序列的链接。
表2
通过使用电穿孔，基因递送方法受到更多控制(与使用BEV系统的病毒递送方法相比)，从而提供更好的批次间一致性。此外，使用哺乳动物细胞时，重组蛋白更“类似于人”且预期每mg蛋白质具有更多活性(例如，相对于经由BEV或大肠杆菌的表达，由于不恰当的翻译后修饰，所述表达中大部分表达的蛋白质是非功能性的)。例如，在本公开的开发期间进行的实验显示，使用本文所述的电穿孔方法表达的UGT1A1比用BEV系统表达的UGT1A1活跃5倍。另外，使用现有的BEV方法，需要6-8个月才能开发出新的囊泡或新的DME微粒体/胞质级分；通过使用本文所述的电穿孔方法，开发时间可显著减少至2-3个月。
本公开的宿主细胞培养物在适合被培养的特定细胞的培养基中制备。市售培养基例如Ham's F10(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO))，极限必需培养基(MEM，西格玛公司)，RPMI-1640(西格玛公司)和达氏修正依氏培养基(DMEM，西格玛公司)是示例性的营养物溶液。合适的培养基还描述于美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469；4,560,655；和WO 90/03430和WO 87/00195中，其公开内容通过引入纳入本文。任何这些培养基可根据需要补充有血清、激素和/或其他生长因子(如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(gentamycin，gentamicin))、痕量元素(定义为无机化合物，通常以微摩尔范围内的终浓度存在)、脂质(如亚油酸或其他脂肪酸)和其合适的载体、和葡萄糖或等效能量源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含。对于哺乳动物细胞培养，培养基的渗透压一般约为290-330mOsm。
本公开还考虑了针对转染的宿主细胞的各种培养系统(例如，培养皿，T-烧瓶，多烧瓶，多孔板，滚瓶和生物反应器)的使用。例如，转染的宿主细胞可以在灌注系统中培养。灌注培养是指提供通过保持高细胞密度的培养物的连续培养基流。细胞被悬浮，不需要在固体支持物上生长。一般而言，新鲜营养物质连续供应，同时去除有毒代谢物，并且理想地选择性去除死细胞。过滤、包封和微囊化方法都适用于以足够的速率更新培养环境。
作为另一个例子，在一些实施方式中可以采用补料分批培养程序。在优选的补料分批培养中，首先将哺乳动物宿主、细胞和培养基供应至培养容器，并且在培养期间连续或以不连续的增量将补充的培养营养物补料至培养物中，在培养终止之前进行或不进行周期性细胞和/或产物收获。补料分批培养可以包括例如半连续补料分批培养，其中定期除去全部培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。补料分批培养不同于简单分批培养，简单分批培养中在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养容器。补充分批培养可以与灌注培养进一步区分：在补充分批培养过程中上清液不从培养容器中除去(在灌注培养中，通过例如过滤、包封、锚定到微载体等将细胞限制在培养物中，并且将培养基连续或间歇地导入和移出培养容器)。
此外，可以根据适用于特定宿主细胞和预期的特定生产计划的任何方案或常规方法来繁殖培养细胞。因此，本公开考虑单步或多步培养程序。在单步培养中，将宿主细胞接种到培养环境中，并且在细胞培养物的单一生产阶段使用本公开内容的方法。或者，可以考虑多阶段培养。在多阶段培养中，细胞可以在许多步骤或阶段中培养。例如，细胞可以在第一步或生长期培养物中生长，其中可能从储存中除去的细胞被接种到适于促进生长和高活力的培养基中。通过向宿主细胞培养物中加入新鲜培养基，可以将细胞维持在生长期持续合适的时间段。
设计补料分批或连续细胞培养条件以增强细胞培养物生长期中哺乳动物细胞的生长。在生长期中，细胞在一定条件下培养一段时间，使其生长最大化。例如温度、pH、溶解氧(dO2)等的培养条件是与特定宿主一起使用的条件，并且对普通技术人员而言是显而易见的。通常，使用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH调节至约6.5至7.5之间的水平。培养哺乳动物细胞(如CHO细胞)的合适温度范围为约30℃至38℃，合适的dO2为5-90％的空气饱和度。
在多肽生产阶段之后，采用本领域已建立的技术从培养基中回收包含感兴趣蛋白质的多肽或膜(例如囊泡或微粒体)。
本公开不限于分离脂质囊泡的具体方法。示例性方法描述于例如美国专利号8,747,869；美国专利申请号20120093885,US20150141634,和US20140080131中，其各自通过整体引用纳入本文。
在一些实施方式中，采用本文所述方法表达的蛋白质和包含所述蛋白质的膜囊泡可用于药物和药物候选物的药物筛选应用(例如筛选毒性，活性，转运入细胞，动力学测定，抑制剂测定或代谢物鉴定)。
实验部分
以下实施例用于说明本公开的某些优选的实施方式和方面，并不构成对其范围的限制。
实施例1
细胞培养-用于电穿孔的细胞制备
简而言之，在第1天，使用补充的CD293培养基(获自吉布可目录号11913-019,生命技术公司(Life Technologies Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)以0.7-1.0×106个细胞/ml的密度将293-F细胞传代至合适大小的摇瓶中，所述培养基补充有4mM L-谷氨酰胺(获自吉布可目录号25030-081，赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。细胞活力和细胞数量使用Cellometer(获自奈克森生物科学公司(Nexcelom Bioscience)，马萨诸塞州劳伦斯)测定。
电穿孔(EP)
在第2天，对细胞进行EP。简而言之，在测定细胞活力和细胞密度之后，通过以100g旋转10分钟使细胞沉淀下来，然后吸出培养基并将细胞重悬于EP缓冲液中(获自迈克赛特目录号B201，迈克赛特公司，马里兰州盖瑟斯堡)。通过在100g下旋转10分钟使细胞悬浮液再次沉淀下来，然后将其重悬于适量的EP缓冲液中以达到100×106个细胞/ml，其用作细胞原液。在无菌水中制备待用于EP的cDNA，终浓度为5mg/ml。对于用于OC-400处理组件的每个样品，将0.4ml细胞原液和DNA置于无菌1.5ml eppendorf管中，得到终浓度为100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml或400μg/ml的DNA，如表中所示，细胞密度为每个样品40×106个细胞。对于用于CL-2处理组件的每个样品，将40ml细胞原液和DNA置于50ml无菌锥形管中，得到终浓度为300μg/ml的DNA。
按照用于HEK细胞的EP的制造商说明将所有样品转移到OC-400处理组件或CL-2处理组件(获自迈克赛特公司，马里兰州盖瑟斯堡)中。EP后，小心吸出细胞并转移到适当大小的摇瓶的底部，并在37℃和8％CO2下孵育20分钟，之后将适量预热的培养基加入摇瓶中以达到1×106个细胞/ml的细胞密度。将细胞在37℃和8％CO2下孵育0.5至1小时。孵育后测定细胞活力和细胞密度。
细胞回收
对于小规模实验，从培养物中取出部分细胞(例如5×106个细胞)并以100g旋转10分钟沉淀并平铺(plated)于康宁BiocoatTM聚-D-赖氨酸包被的T-烧瓶上或TC处理的T-烧瓶上(获自纽约州康宁公司)的平铺培养基(补充有1X MEM非必需氨基酸和10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM，购自密迪亚泰克公司(Mediatech,Inc.)，弗吉尼亚州马纳萨斯)中，并在37℃和8％CO2下培养；将剩余的细胞以100g离心10分钟沉淀，然后重悬于25mL预热的经补充的CD293培养基中并在37℃和8％CO2下培养。每24小时测定悬浮培养细胞的细胞活力和密度。48小时或适当的孵育时间后，将悬浮培养的细胞以100g离心10分钟沉淀；以粘附形式培养的细胞通过PBS收获(对于TC处理的T-烧瓶)或通过用2ml的0.25％胰蛋白酶与EDTA孵育2-3分钟收获，然后用平铺培养基中和(PDL-处理的T-烧瓶)。将细胞悬液以100g离心10分钟沉淀。
对于大规模实验，在EP和回收后，将细胞在2L摇瓶中培养。24小时后，向每个烧瓶中加入补充有或未补充有2mM丁酸钠的100mL新鲜CD293培养基。在48小时通过在100g下离心10分钟沉淀收获细胞。
囊泡制备
如下制备粗制质膜囊泡。简而言之，将细胞回收步骤获得的细胞沉淀物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，并在4℃以1500rpm离心10分钟。用补充有1:500稀释的蛋白酶抑制剂混合物(获自西格玛公司，目录号P8340，密苏里州圣路易斯)的适量(4x沉淀重量)TMEP缓冲液(50mM Tris-碱，50mM甘露醇，2mM EGTA，2mM2-巯基乙醇，pH 7.0)稀释所得沉淀，并转移到Dounce匀浆器中，并以10冲程(stoke)手动均质化。细胞裂解物在4℃以2600rpm离心10分钟。将上清液转移到一套新的离心管中，并在4℃以37,000rpm离心15分钟。将得到的沉淀重悬于适量的TMEP缓冲液中，并用Dounce B匀浆器以10冲程均质化。将膜囊泡等分并在-80℃下储存直至使用。
人重组AO和UGT1A1酶制备
如下制备重组AO和UGT1A1酶。简而言之，将细胞回收步骤获得的细胞沉淀物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，并在4℃以1500rpm离心10分钟。将所得沉淀用适量的0.1M磷酸钾缓冲液稀释，并转移到Dounce匀浆器中接着进行10冲程均质。细胞裂解物在4℃以2600rpm离心10分钟。将上清液转移到一套新的离心管中，并在4℃以37,000rpm离心15分钟。对于重组AO，将上清液(可溶性级分)等分并在-80℃下储存直至使用。对于UGT1A1微粒体，将沉淀重悬于适量的0.1M Tris缓冲液中并用Dounce匀浆器以10冲程均质化。将UGT1A1微粒体等分并在-80℃下储存直至使用。
转运体摄取分析
使用N-甲基-奎尼丁(NMQ)(获自西格玛公司，密苏里州圣路易斯)作为用于MDR1/P-gp囊泡摄取测定的探针底物，终浓度为5μM；使用雌酮-3-硫酸酯(E3S)作为用于BCRP囊泡摄取测定的探针底物，终浓度为1μM，由1％的[3H]雌酮-3-硫酸酯(获自帕金埃尔默公司(Perkin Elmer)，马萨诸塞州沃特汉姆)和99％的冷雌酮3-硫酸酯(获自西格玛公司，密苏里州圣路易斯)组成；5(6)-羧基-2,'7'-二氯荧光素(CDCF)(获自赛默飞世尔科学公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)用作MRP2囊泡的探针底物，终浓度为5μM。将在摄取缓冲液(47mMMOP，65mM KCl和7mM MgCl2，pH 7.4)中包含50μg囊泡和1.25倍终浓度的探针底物和2.5mMGSH(仅用于MRP2)的60μl反应混合物在37℃下预孵育5分钟。摄取通过加入5mM ATP或AMP开始，然后在37℃下，MDR1囊泡孵育5分钟，BCRP囊泡孵育3分钟，MRP2囊泡孵育15分钟。通过真空歧管(获自EMD-密理博公司，马萨诸塞州比尔里卡)将反应溶液转移到玻璃纤维(G/F)滤板(获自EMD-密理博公司，目录号MSFBN6B10，马萨诸塞州比尔里卡)，然后将滤板用冷洗涤缓冲液(40mM MOP和70mM KCl，pH 7.4)洗涤5次。室温下在黑暗中干燥滤板1-2小时后，对于BCRP囊泡，将50μL闪烁液(获自帕金埃尔默公司，Optiphase Supermix，马萨诸塞州沃特汉姆)加入样品孔。在Microbeta闪烁计数器(获自帕金埃尔默公司，马萨诸塞州沃特汉姆)上直接读板。对于MDR1/P-gp囊泡，将100μL的10％SDS加入样品孔；对于MRP2囊泡，将100μL的0.1N NaOH加入样品孔。在室温下孵育10分钟后，将滤板置于96孔板(获自康宁生命科学公司(Corning Life Sciences)，马萨诸塞州图克斯伯里)上并以2000rpm离心5分钟，将释放的化合物洗脱入96孔接收板中。对于MRP2囊泡中的CDCF摄取，在荧光读数器Safire2(获自替康公司(Tecan))上于Ex 485nm、Em538nm处直接测定荧光。对于在MDR1/P-gp囊泡中的NMQ摄取，将100ul的0.1N H2SO4加入每个孔，然后使用荧光板阅读器Safire2在Ex 355nm、Em448nm处测定荧光。
AO测定
在含有0.1mM EDTA的25mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)中于37℃进行AO测定。将170μL测定缓冲液与20μL的1mM酞嗪混合，并在加热块中预热至37℃。用10μL 5mg/mL AO样品开始反应。为了氧气循环，盖子需要打开。孵育后，通过加入100μl的94％乙腈/6％冰醋酸来终止反应。将反应混合物离心(10,000×g)3分钟，并在HPLC上分析上清液。
UGT1A1测定
在50mM Tris(pH 7.5)中含有1.0mg/ml蛋白质、2mM尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDPGA)、10mM氯化镁、0.025mg/ml丙甲甘肽(alamethicin)和150μMβ-雌二醇的0.2ml反应混合物在37℃孵育30分钟。孵育后，通过加入50μl的94％乙腈/6％冰醋酸来终止反应。将反应混合物离心(10,000×g)3分钟，并在HPLC上分析上清液。
结果
结果如图1-10所示。
图1-3显示细胞在电穿孔后表现出活力和生长。图1A显示在使用不同量的人MDR1/P-gp DNA对粘附的HEK293细胞进行电穿孔后活细胞的百分比。图1B显示电穿孔和回收后获得的活细胞的总量。所有测试浓度下的活力和回收都很强。图2显示电穿孔后T＝0、24和48小时的总活细胞数(A)和活细胞百分比(B)。所有四种剂量的电穿孔后细胞计数随时间增加。随着时间的推移，活细胞百分比保持高水平。图3显示了T＝24小时和T＝48小时处用增加量的DNA转染的细胞单层(图3A)。图中记录活细胞的百分比(图3B)。所有测试样品的活细胞随时间增加。
图4和7显示了由如上所述制备的囊泡对N-甲基奎尼丁(NMQ)的摄取。图4显示与用MDR1/P-gp囊泡孵育5分钟后的NMQ摄取活性，所述MDR1/P-gp囊泡由用不同量DNA(100μg/ml，200μg/ml，300μg/mL和400μg/ml MDR1)转染的、在电穿孔后以悬浮或粘附形式培养的HEK293细胞所制备。定量结果示于下表3。
表3
图7显示用MDR1/P-gp囊泡孵育5分钟后的NMQ摄取活性，所述MDR1/P-gp囊泡通过使用小规模EP装置(OC-400)或大规模EP装置(CL-2袋)用300ug/mL MDR1cDNA转染的、在电穿孔后以悬浮格式培养的HEK293细胞来制备。
图5显示了由如上所述制备的囊泡对雌酮-3-硫酸酯(E3S)的摄取。如供应商样品所示，摄取活性仅在用胆固醇(C)处理后才被观察到(比较“C之前”样品与“C之后”样品)。相反，采用本文所述方法的电穿孔的HEK细胞不需要胆固醇。
图6显示了hMRP2囊泡中的CDCF摄取。定量数据示于下表4。
表4
图8显示了如上所述制备的细胞级分/胞质中AO的活性。图8A是显示AO活性对比浓度的图，图8B显示市售系统与HEK293细胞中就rAO的V最大的比较。图8A和B显示，当使用探针底物酞嗪时，用转染的HEK293细胞制备的重组I相药物代谢酶醛氧化酶(AO)显示出标准的米氏动力学曲线。
图9和10显示了如上所述制备的细胞级分/膜级分(微粒体)中的UGT1A1活性。图9A和B显示通过电穿孔递送到HEK293细胞中(然后在收获前悬浮培养24-72小时)的II相药物代谢酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)cDNA的微粒体活性(9A)和微粒体产率(9B)。图10显示了HEK293微粒体中UGT1A1的活性，显示出与现有金标准方法(SupersomesTM)相比令人惊讶的活性。
上述说明书中提及的所有出版物和专利都通过引用纳入本文。对本公开所述方法和系统的多种改进和变动对本领域技术人员是显而易见的，而不偏离本公开的范围和精神。虽然已结合具体的优选实施方案对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方案。实际上，对本领域一般技术人员显而易见的用于实施本公开的方式的各种改进都落在以下权利要求的范围内。

Claims (28)

1.一种产生表达膜结合蛋白的囊泡的方法，包括：
a)使哺乳动物细胞与编码膜结合蛋白的核酸接触，所述膜结合蛋白选自ABCB1，ABCB4，ABCB11，ABCC1，ABCC2，ABCC3，ABCC4，ABCC5，ABCC6，ABCG2和其同源物；
b)电穿孔所述哺乳动物细胞使得所述核酸进入所述哺乳动物细胞；和
c)分离表达感兴趣的所述膜结合蛋白的囊泡。
2.如权利要求1所述的方法，还包括在所述电穿孔步骤之后培养所述细胞的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述培养包括添加丁酸钠。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括所述细胞的均质化。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述膜结合蛋白包含与天然形式的该膜结合蛋白相似的翻译后修饰。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293，CHO，Hela，S2，MDCK-1，MDCK-II，LLC-PK1，Caco-2，Huh7或V79细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括使所述囊泡与测试化合物接触的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述测试化合物是药物。
9.一种筛选测试化合物的方法，包括：
a)使哺乳动物细胞与编码转运蛋白的核酸接触，所述转运蛋白选自ABCB1，ABCB4，ABCB11，ABCC1，ABCC2，ABCC3，ABCC4，ABCC5，ABCC6，ABCG2和其同源物；
b)电穿孔所述哺乳动物细胞使得所述核酸进入所述哺乳动物细胞；
c)分离表达所述转运蛋白的细胞膜；和
d)使所述细胞膜与所述测试化合物接触。
10.如权利要求9所述的方法，还包括测定由所述转运蛋白对所述测试化合物的转运的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述测定包括测定转运的动力学。
12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，还包括使所述细胞膜与所述药物转运体的抑制剂接触并测定所述抑制剂对所述药物转运体的活性或转运的抑制的步骤。
13.一种通过权利要求1-6中任一项所述方法生产的分离的囊泡。
14.一种产生含有感兴趣蛋白质的细胞级分的方法，包括：
a)使哺乳动物细胞与编码药物代谢酶的核酸接触，所述药物代谢酶选自：细胞色素P450，醛氧化酶(AO)，黄素单加氧酶(FMO)，单胺氧化酶A和B(MAO A和B)，酯酶，N-乙酰转移酶(NAT)，磺基转移酶(SULT)，尿苷5'-二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)，及其同源物；
b)电穿孔所述哺乳动物细胞使得所述核酸进入所述哺乳动物细胞；和
c)分离含有所述药物代谢酶的细胞级分。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞色素P450选自：CYP1A1，CYP1B1，CYP2A6，CYP2B6，CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C18，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A5，CYP3A7，CYP3A4，CYP4F2和CYP2J2。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述酯酶选自羧酸酯酶1(CES1)，羧酸酯酶2(CES2)，对氧磷酶1(PON1)，羧基亚甲基丁烯酸内酯酶(CMBL)，丁酰胆碱酯酶(BChE)，芳基乙酰胺脱乙酰酶(AADAC)和碱性磷酸酶(AP)。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述UGT选自：UGT1A1，UGT1A3，UGT1A4，UGT1A5，UGT1A6，UGT1A7，UGT1A8，UGT1A9，UGT1A10，UGT2A1，UGT2A2，UGT2A3，UGT2B4，UGT2B7，UGT2B10，UGT2B11，UGT2B15，UGT2B17和UGT2B28。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，还包括在所述电穿孔步骤之后培养所述细胞的步骤。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述培养包括添加丁酸钠。
20.如权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括所述细胞的均质化。
21.如权利要求14-20中任一项所述的方法，其中药物代谢酶包含与天然形式的该药物代谢酶相似的翻译后修饰。
22.如权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293，CHO，Hela，S2，MDCK-1，MDCK-II，LLC-PK1，Caco-2，Huh7或V79细胞。
23.如权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述细胞级分是胞质级分。
24.如权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述细胞级分是膜级分。
25.如权利要求14-24中任一项所述的方法，还包括使所述细胞级分与测试化合物接触的步骤。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述测试化合物是药物。
27.如权利要求26所述的方法，还包括评估所述药物的修饰的步骤。
28.一种通过权利要求14至24中任一项所述的方法生产的细胞级分。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023193665A1 (zh) * 2022-04-07 2023-10-12 威海纽兰生物科技有限公司 基于细胞外囊泡酯酶响应药物递送载体及其制备方法和用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111893175A (zh) * 2020-07-31 2020-11-06 武汉明志医学检验实验室有限公司 一种氯吡格雷用药检测试剂盒及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755612A (zh) * 2012-09-11 2015-07-01 康宁有限公司 瞬时过表达编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因的可消耗的低温保存的细胞

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5672502A (en) 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
US4657886A (en) 1985-07-25 1987-04-14 Phillips Petroleum Company Catalyst for conversion of C3 and C4 hydrocarbons
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US20020082194A1 (en) * 2000-11-17 2002-06-27 Karl Guegler Isolated human drug-metabolizing proteins, nucleic acid molecules encoding human drug-metabolizing proteins, and uses thereof
EP1264880A1 (en) 2001-06-06 2002-12-11 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Double-transfected cell line useful for the identification of transport inhibitors
CA2447824A1 (en) * 2002-08-23 2004-02-23 Kinetana Group Inc. Model epithelial cell cultures
US7445897B2 (en) * 2004-01-26 2008-11-04 University Of Washington Sequence variants of multi-drug resistance genes, MDR1 and MRP1, and methods for assessment of drug penetration and disposition
JP4572320B2 (ja) * 2004-02-23 2010-11-04 財団法人大阪産業振興機構 組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いてヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法
JP2007295929A (ja) 2006-04-05 2007-11-15 Geno Membrane:Kk イヌＢｓｅｐ遺伝子
US7687267B2 (en) 2006-09-30 2010-03-30 Rational Biotechnology Inc. High-throughput cell transfection device and methods of using thereof
EP2547327B1 (en) 2010-03-19 2018-09-05 Massachusetts Institute of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
US20120093885A1 (en) 2010-10-18 2012-04-19 Northwestern University Therapeutic vesicles
JP5823031B2 (ja) 2011-06-10 2015-11-25 日立化成株式会社 小胞捕捉デバイスおよびそれを用いるための方法
JP5991837B2 (ja) * 2012-03-30 2016-09-14 日清食品ホールディングス株式会社 薬物代謝酵素の活性誘導方法及び薬物代謝酵素の活性が誘導されたヒト培養細胞
KR20140037716A (ko) 2012-09-19 2014-03-27 삼성전자주식회사 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법
JP6035343B2 (ja) * 2012-10-18 2016-11-30 株式会社クラレ 毒性スクリーニング方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755612A (zh) * 2012-09-11 2015-07-01 康宁有限公司 瞬时过表达编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因的可消耗的低温保存的细胞

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KARLSSON J.E.等: "High-activity P-glycoprotein,multidrug resistance protein 2,and breast cancer resistance protein membrane vesicles prepared from transiently transfected human embryonic kidney 293-epstein-barr virus nuclear antigen cells", 《DRUG METABOLISM AND DISPOSITION》 *
PARHAM J.H.等: "Optimization of transient gene expression in mammalian cells and potential for scale-up using flow electroporation", 《CYTOTECHNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023193665A1 (zh) * 2022-04-07 2023-10-12 威海纽兰生物科技有限公司 基于细胞外囊泡酯酶响应药物递送载体及其制备方法和用途

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