CN108473529B - 检测和治疗肺高压的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容描述了一种使用同位素富集的肽作为内标物来对磷酸肽的量进行定量的方法。包含至少一种同位素富集的磷酸化肽的试剂盒可用于使用平行反应监测质谱技术来对磷酸肽的量的变化进行定量。本发明可用于指示病理学机制、疾病的严重程度和受试者的治疗反应。本发明还可用于鉴定需要更积极的治疗性干预或替代治疗的受试者。
Description
交叉引用
本申请要求2015年11月10日提交的美国临时申请号62/253,184的权益，其内容通过引用以其全文并入本文。
政府权利
本发明在由国家心肺血液研究所(NHLBI)授予的R03HL110821下由政府支持完成。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
肺高压(PH)是伴随有高发病率和死亡率的肺血管的罕见病症。该疾病的病理学包括无组织的血管生成的丛状病变和异常的新生内膜细胞增殖，所述丛状病变和异常的新生内膜细胞增殖阻碍血流通过肺小动脉。蛋白质的磷酸化模式在PH的不同阶段发生。
援引并入
本申请中引用的每个专利、出版物和非专利文献均通过引用以其全文并入本文，如同每一个单独地通过引用而并入。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括：a)向从血沉棕黄层中提取的蛋白质样品中添加一定量的定量标准物以提供测试样品；以及b)测定所述测试样品以对该测试样品中从血沉棕黄层中提取的所述蛋白质的野生型磷酸肽进行定量，其中所述定量基于所述定量标准物的量，其中所述定量标准物是同位素富集至非天然同位素丰度的磷酸肽的形式。
在一些实施方案中，本发明提供了包含磷酸肽样品的化学等分试样，其中至少1％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成，其中所述样品含有至少1pg所述磷酸肽，其中所述磷酸肽与表2或表3任一个中的任何化合物具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含：a)包含磷酸肽样品的化学等分试样，其中至少1％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成，其中所述样品含有至少1pg所述磷酸肽，其中所述磷酸肽与表2或表3任一个中的任何化合物具有至少90％的序列同一性；以及b)包含具有天然同位素丰度的核的磷酸肽样品的附加等分试样。
附图说明
图1示出了使用磷酸特异性抗体和总IKZF3抗体的Western印迹。
图2示出了使用pIKZF3抗体的免疫组织化学结果。
图3示出了iPAH肺组织的免疫组织化学，并描绘了炎性血管周浸润物。
图4示出了iPAH肺切片的血管周浸润物。
图5示出了SSC-APAH肺样品中血管周浸润物中的HMHA1。
具体实施方式
肺高压(PH)或肺动脉高压(PAH)是影响肺和心脏右侧的动脉的慢性疾病。如果不进行治疗，PAH可导致心力衰竭；因此，PAH是伴随有高发病率和死亡率的病症。世界卫生组织(WHO)根据潜在的相关疾病将PH分为五类：第1类：PAH，第2类：由左心疾病引起的PH，第3类：由肺部疾病或缺氧引起的PH，第4类：慢性血栓栓塞性PH(CTEPH)，以及第5类：由不明的多因素机制导致的PH。
患有PAH的受试者包括这样的受试者，其患有与骨形态发生2型受体(BMPR2)、激活素样激酶1型(ALK-1)、内皮糖蛋白(ENG)、SMAD家族成员9(SMAD9)、窖蛋白1(CAV1)或钾双孔结构域通道亚家族K成员3(KCNK3)中的基因突变相关的特发性(iPAH)或遗传性PAH。PAH也可与结缔组织病(例如，系统性硬化(硬皮病)、混合性结缔组织病或其他自身免疫病)、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、门静脉高压、先天性心脏病、血吸虫病、肺静脉闭塞性疾病、肺毛细血管多发性血管瘤或新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)相关。患有PAH的受试者对治疗的反应是可变的。
PAH的病理学包括由阻碍血流通过肺小动脉的被称为丛状病变(PL)的肺动脉重塑和异常的新生内膜细胞增殖导致的复杂血管形成。激酶在细胞生长和增殖中发挥关键作用，并可以针对性地解决PAH的潜在病理学。通过检测参与PAH病理学的蛋白质的磷酸化，激酶抑制剂可用于治疗PAH。
指示病理学机制、疾病的严重程度和治疗反应的生物标志物可鉴定需要更积极的治疗性干预或替代治疗的受试者。生物标志物还可用于鉴定更有可能对用于治疗PAH的激酶抑制剂有反应的受试者。
用于检测和治疗肺动脉高压的生物标志物
所公开的发明描述了通过对蛋白质亚组的磷酸化的增加或减少(即，磷酸化谱)进行定量来确定受试者中PAH的诊断和预后状态的方法。本发明描述了使用患有PAH的受试者的组织样品来确定一种或多种蛋白质的磷酸化水平的方法。在一些实施方案中，本发明使用患有特发性PAH(iPAH)的受试者的组织样品来确定一种或多种蛋白质的磷酸化水平。所公开的发明将样品中蛋白质的磷酸化水平与至少一个对照中相应蛋白质的磷酸化水平进行比较。在一些实施方案中，所述对照是从诊断患有PAH的受试者获得的样品。在一些实施方案中，所述对照是从诊断患有iPAH的受试者获得的样品。在一些实施方案中，所述对照是从没有病理学的受试者获得的样品。
所公开的发明可以使用分析方法来确定PAH受试者中磷酸化蛋白质的相对丰度。蛋白质的磷酸化(即，磷蛋白)与对照样品的磷酸化水平相比的增加或减少可提示疾病状态。
所公开的发明可通过检测表2中至少一种蛋白质的磷酸化的增加来鉴定PAH。例如，该方法可检测以下至少一项的磷酸化增加：Ikaros家族锌指蛋白3(IKZF3)、组织相容性(次要)抗原HA-1(HMHA1)、乳腺癌扩增序列3(BCAS3)、rho-GTP酶活化蛋白25(RHG25)、核有丝分裂器蛋白1(NUMA1)、增白细胞蛋白(LEUK)、粘蛋白1-细胞表面相关蛋白(MUC1)、核孔复合蛋白Nup214(NU214)、含WD重复的蛋白质24(WDR24)、aquarius内含子结合剪接体因子(AQR)、1A69、p53凋亡刺激蛋白1(ASPP1)、丝裂原活化蛋白激酶(MK14)、锌指蛋白404(ZN404)、氧固醇结合蛋白(OSB11)和肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)。在一些实施方案中，该方法可检测IKZF3、HMHA1、BCAS3、RHG25、NUMA1、ZN404和HDGF的磷酸化增加。
IKZF3作为转移性上皮癌中淋巴细胞模拟的表观遗传驱动因子而起作用，并在包括多发性骨髓瘤(MM)在内的B细胞恶性肿瘤中发挥关键作用。Ikaros家族锌指蛋白1(IKZF1)和IKZF3是MM生长所必需的转录因子。用于治疗MM的沙利度胺和其他药物与cereblon(它是泛素连接酶复合物的组分)结合，并改变该复合物的特异性以诱导IKZF1和IKZF3的泛素化和降解。IKZF3敲除小鼠的表型与可引起PH的系统性红斑狼疮(SLE)的表型类似。
RHG25是Rho-型GTP酶的GTP酶激活剂，并通过将Rho-型GTP酶转化为非活性GDP结合状态而起作用。Rho-GTP酶影响肌动蛋白组织化、细胞形状和细胞伸展，从而调节细胞骨架并维持内皮屏障功能。在多个BMPR2突变的存在下细胞骨架缺陷是常见的，并与Rho-GTP酶RAC1的活化有关。可在从血管扩张剂反应性PAH受试者与非血管扩张剂反应性PAH受试者获得的样品之间，在培养的淋巴细胞中观察到Rho-GTP酶基因表达的差异。
HMHA1是Rho-型GTP酶的GTP酶激活剂。HMHA1与Rho-GTP酶Rac1共定位。HMHA1在造血细胞、上皮肿瘤细胞和内皮细胞中表达。
NUMA1是核基质的组分并起到非有丝分裂结构作用。NUMA1与微管相互作用，并在细胞分裂过程中在有丝分裂纺锤体的形成和组织化中发挥作用。NUMA1还充当连接纺锤体的大量微管与中心体的系链，并且它是不对称细胞分裂期间有丝分裂纺锤体的正确对齐所需的。
ASPP1结合p53并刺激凋亡作用。ASPP在稳定造血干细胞方面发挥作用，并且对于淋巴管形成是必需的。ASPP1还独立于p53诱导凋亡。通过在体内和体外与p63和p73结合，ASPP1刺激p63和p73对Bax、PIG3和PUMA的启动子的反式激活功能，但不刺激MDM2或p21WAF -1/CIP1的反式激活功能。
HDGF是可引起异常细胞增殖、增加血管内皮生长因子(VEGF)的表达以及导致血管生成的DNA结合核因子。HDGF的去磷酸化可导致内皮细胞凋亡。HDGF也可激活PI3K/AKT途径。
在一个实施方案中，样品的样品磷酸化谱包含IKZF3的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品的样品磷酸化谱包含IKZF3的磷酸化水平，其中IKZF3在氨基酸S378处被磷酸化。在一些实施方案中，IKZF3的磷酸化在PAH样品中上调。
在一个实施方案中，样品磷酸化谱包含RHG25的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含RHG25的磷酸化水平，其中RHG25在氨基酸T442处被磷酸化。在一个实施方案中，样品磷酸化谱包含HMHA1的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含HMHA1的磷酸化水平，其中HMHA1在氨基酸S73处被磷酸化。
在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含NUMA1的磷酸化水平，其中NUMA1在氨基酸S2047或S1969处被磷酸化。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含NUMA1的磷酸化水平，其中NUMA1在氨基酸S2047和S1969处被磷酸化。在一个实施方案中，样品磷酸化谱包含ASPP1的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含ASPP1的磷酸化水平，其中ASPP1在氨基酸S710处被磷酸化。
在一个实施方案中，样品磷酸化谱包含HDGF的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含HDGF的磷酸化水平，其中HDGF在氨基酸S107处被磷酸化。
在一个实施方案中，样品磷酸化谱包含NCOR1的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含NCOR1的磷酸化水平，其中NCOR1在氨基酸S999处被磷酸化。在一个实施方案中，样品磷酸化谱包含BCAS3的磷酸化水平。在一些实施方案中，样品磷酸化谱包含BCAS3的磷酸化水平，其中BCAS3在氨基酸S709处被磷酸化。
在一些实施方案中，所公开的发明可通过检测磷酸化的降低来诊断PAH。在一些实施方案中，所述方法可检测表3中至少一种蛋白质的磷酸化降低：蛋白质酪氨酸磷酸酶受体B型(PTPRB)、推定的突触循环蛋白-2样蛋白质(SNGL2)、HIV Tat-特异性因子1(HTSF1)、PC3和SFRS1相互作用蛋白(PSIP)、膜联蛋白A2(ANXA2)、S10A9、RLA2、TM100、富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子2(SRSF2)、磷脂酶D1(PLD1)、脑特异性血管生成抑制剂1相关蛋白2-样蛋白2(BI2L2)、TENS1、微管相关蛋白1B(MAP1B)或联蛋白α-1(CTNA1)。
PTPRB在血管重塑和血管生成中发挥重要作用。PTPRB对于血管的初始形成不是必需的，但对于维持和重塑血管是必需的。在肺动脉中，平滑肌细胞(SMC)的缺氧降低了几种PTP的表达，包括T细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)、密度增加的磷酸酶-1、PTP1B和含SH2结构域的磷酸酶-2，从而降低了PTP活性。由于HIF-1-αsiRNA消除了缺氧诱导的PDGFRβ过度磷酸化和PTP下调，因此缺氧诱导因子(HIF)-1-α参与调节基因表达。PDGFRβ过度磷酸化和PTP下调也存在于患有慢性缺氧诱导的PH的小鼠体内。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)与PAH中的增殖和外膜成纤维细胞有关。HDAC2的磷酸化由酪蛋白激酶2(CK2α)介导。后续的HDAC2乙酰化需要HDAC2的丝氨酸磷酸化，并且HDAC2的丝氨酸磷酸化降低了HDAC2的脱乙酰酶活性。丝氨酸磷酸化增加了与转录协阻抑物如SAP30、RBAp46/48、MDB3和HDAC1的相互作用，以及与p65和p53的相互作用。
在一些实施方案中，例如在表2中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白质中检测到磷酸化增加。在一些实施方案中，例如在表3中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白质中检测到磷酸化降低。
在一些实施方案中，药剂的施用增加了表2中至少1、2、5或10种蛋白质的磷酸化。在一些实施方案中，药剂的施用增加了表2中至少1种蛋白质的磷酸化。在一些实施方案中，药剂的施用增加了表2中至少5种蛋白质的磷酸化。
在一些实施方案中，药剂的施用降低了表3中至少1、2、5或10种蛋白质的磷酸化。在一些实施方案中，药剂的施用降低了表3中至少1种蛋白质的磷酸化。在一些实施方案中，药剂的施用降低了表3中至少5种蛋白质的磷酸化。
在一些实施方案中，所述药剂是CK2、CDK1、MAPK、PRK、AKT1、AurkA、CamK2B、CAMK4、GSK3A、GSK3B、HIPK2、HYRC、PDK、DYRK2或PAK的抑制剂。在一些实施方案中，该药剂是CK2的抑制剂。在一些实施方案中，该药剂是CDK1的抑制剂。在一些实施方案中，该药剂是TBB(4,5,6,7-四溴-1-H-苯并三唑)。
在一些实施方案中，药剂的施用抑制NUMA1在S2047处的磷酸化。在一些实施方案中，药剂的施用抑制NUMA1在S1969处的磷酸化。在一些实施方案中，药剂抑制NCOR1在S999处的磷酸化。在一些实施方案中，药剂的施用抑制HDGF在S107处的磷酸化。在一些实施方案中，药剂降低或抑制HMHA1在S73处的磷酸化。在一些实施方案中，药剂降低或抑制ASPP1在S710处的磷酸化。
在一些实施方案中，所述药剂为下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。可通过将酸添加到本发明的化合物中来产生药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该酸为有机酸。在一些实施方案中，该酸为无机酸。在一些实施方案中，该酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、亚硝酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、异烟酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、龙胆酸、葡糖酸、葡萄糖醛酸、葡糖二酸(saccaric acid)、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、泛酸、乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、草酸或马来酸。在一些实施方案中，所述盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、龙胆酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、葡糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、泛酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐或马来酸盐。
用于测定蛋白质的磷酸化水平的样品
所公开的发明可通过从人类受试者获得样品来对磷酸肽的变化进行定量。在一些实施方案中，待测样品可以是肺组织、血液、全血、血浆、血清、循环细胞、外周血单核细胞(PMBC)或肺活检物。在一些实施方案中，样品可从循环细胞，如以Ficoll梯度分离的血沉棕黄层中的细胞、淋巴细胞或淋巴细胞的亚型(即，T细胞、B细胞或T和B细胞的其他亚型)，或循环祖细胞(即，祖内皮细胞、成纤维细胞或干细胞)获得。血沉棕黄层样品包括白细胞(白血球)、血小板、PMBC、淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)和单核细胞。在一些实施方案中，样品可以是从受试者分离并在细胞培养物中生长或经转化或永生化的细胞。在一些实施方案中，样品可以是使用常规细胞培养方法生长的细胞。
可将样品置于含有各种磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的磷酸酶抑制剂混合物中以防止样品处理过程中的去磷酸化。可使用均质化、在放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液中的超声处理或在含有去污剂和抑制剂的变性缓冲液中的超声处理来提取蛋白质，以保持蛋白质的磷酸化状态。
提取的分离的蛋白质可使用蛋白水解酶进行消化。在一些实施方案中，使用LysC或胰蛋白酶消化蛋白质。在一些实施方案中，使用蛋白水解酶消化蛋白质并通过柱色谱法进行纯化。在一些实施方案中，使用蛋白水解酶消化蛋白质并使用Sep-PAK柱或使用高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。在一些实施方案中，使用有机溶剂例如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙腈来提取蛋白质。
用作内标物的同位素富集的肽
在一些实施方案中，样品中磷蛋白的量可与在PAH中上调或下调的磷酸肽的稳定的、同位素富集的内标物的量进行比较。例如，在平行反应监测(PRM)质谱(PRM-MS)测定中可使用一组稳定的、同位素富集的肽来对目标磷蛋白的水平进行定量。
消化的测试样品中可以掺入一定量的同位素富集的标准物以对磷酸肽的量进行定量。本发明可通过比较样品中野生型磷酸肽的量与内标物的量来对野生型磷酸肽的量进行定量。在一些实施方案中，所述内标物是非磷酸化野生型肽的同位素富集的肽。在一些实施方案中，所述内标物是磷酸化野生型肽的同位素富集的肽。
用作内标物的本发明的肽可以用稳定的同位素富集。在一些实施方案中，本发明的肽可用13C、15N、18O、32P或其任何组合标记。在一些实施方案中，本发明的肽用13C标记。在一些实施方案中，本发明的肽用15N标记。在一些实施方案中，本发明的肽用13C和15N标记。
本发明的稳定的、同位素富集的肽包括表2或表3中的稳定的、同位素富集的肽。在一些实施方案中，本发明的稳定的、同位素富集的肽是表6和表7中的肽。本发明的稳定的、同位素富集的肽可以被磷酸化或非磷酸化。在一些实施方案中，本发明的稳定的、同位素富集的肽具有1、2、3、4或5个磷酸化氨基酸。在一些实施方案中，本发明的稳定的、同位素富集的肽具有1个磷酸化氨基酸。在一些实施方案中，本发明的稳定的、同位素富集的肽具有2个磷酸化氨基酸。
本发明的肽可包含同位素富集的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的残基。在一些实施方案中，本发明的肽包含同位素富集的赖氨酸。在一些实施方案中，本发明的肽包含同位素富集的精氨酸。在一些实施方案中，本发明的肽包含同位素富集的赖氨酸和精氨酸。
本发明的同位素富集的肽可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种稳定同位素。在一些实施方案中，本发明的同位素富集的肽具有6种稳定同位素。在一些实施方案中，本发明的同位素富集的肽具有8种稳定同位素。在一些实施方案中，本发明的同位素富集的肽具有10种稳定同位素。在一些实施方案中，本发明的同位素富集的肽具有至少2个13C核。在一些实施方案中，本发明的同位素富集的肽具有至少5个13C核。在一些实施方案中，本发明的同位素富集的肽具有至少2个15N核。
本发明的肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种同位素富集的氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的肽可包含1种同位素富集的氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的肽可包含2种同位素富集的氨基酸残基。
本发明的同位素富集的肽可与野生型肽共有一定程度的同源性。一对野生型肽和同位素富集的肽可具有，例如，至多约20％的成对同源性、至多约25％的成对同源性、至多约30％的成对同源性、至多约35％的成对同源性、至多约40％的成对同源性、至多约45％的成对同源性、至多约50％的成对同源性、至多约55％的成对同源性、至多约60％的成对同源性、至多约65％的成对同源性、至多约70％的成对同源性、至多约75％的成对同源性、至多约80％的成对同源性、至多约85％的成对同源性、至多约90％的成对同源性、至多约95％的成对同源性、至多约96％的成对同源性、至多约97％的成对同源性、至多约98％的成对同源性、至多约99％的成对同源性、至多约99.5％的成对同源性或至多约99.9％的成对同源性。
一对野生型肽和同位素富集的肽可具有，例如，至少约20％的成对同源性、至少约25％的成对同源性、至少约30％的成对同源性、至少约35％的成对同源性、至少约40％的成对同源性、至少约45％的成对同源性、至少约50％的成对同源性、至少约55％的成对同源性、至少约60％的成对同源性、至少约65％的成对同源性、至少约70％的成对同源性、至少约75％的成对同源性、至少约80％的成对同源性、至少约85％的成对同源性、至少约90％的成对同源性、至少约95％的成对同源性、至少约96％的成对同源性、至少约97％的成对同源性、至少约98％的成对同源性、至少约99％的成对同源性、至少约99.5％的成对同源性、至少约99.9％的成对同源性。
可使用各种方法和软件程序如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline或另一种合适的方法或算法来确定两种或更多种肽之间的同源性。
测定蛋白质磷酸化水平的分析方法
所公开的发明可使用各种分析方法来对测试样品的蛋白质的磷酸化水平进行定量。测试样品的蛋白质的磷酸化水平可使用MS，例如PRM-MS来检测。在一些实施方案中，调整质谱仪以检测天然蛋白质与本发明的同位素富集的肽相比是否具有不同的m/z比。
还可使用HPLC/MS/MS方法、磷酸特异性抗体、利用了对磷酸化肽或蛋白质区域为特异性的抗体的Western印迹法或酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光、比色检测法或辣根过氧化物酶(HRP)来测定测试样品的蛋白质的磷酸化水平。可通过将蛋白质排列在阵列中并使用流式细胞术分析该样品或通过将蛋白质接种在载玻片上进行检测，来测定测试样品的蛋白质的磷酸化水平。
用于检测肺高压的试剂盒
所公开的发明还描述了包含化学等分试样的试剂盒，该化学等分试样包含可用于对测试样品中蛋白质的磷酸化水平进行定量的同位素富集的磷酸肽样品。该化学等分试样可含有一组磷酸肽的同位素富集的内标物。在一些实施方案中，可使用一组稳定的、同位素富集的肽通过PRM-MS对磷酸肽的量进行定量。在一些实施方案中，该试剂盒包含用来生成MS校准曲线的未标记的野生型肽。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含可用于生成MS校准曲线的未标记的野生型肽。在一些实施方案中，该试剂盒可含有肽A的4种变体：野生型磷酸肽A、野生型非磷酸化肽A、同位素富集的磷酸肽A和同位素富集的非磷酸化肽A。在一些实施方案中，该试剂盒由三种肽(例如，肽B、C和D)的4种变体组成：1)野生型磷酸肽B、野生型非磷酸化肽B、同位素富集的磷酸肽B和同位素富集的非磷酸化肽B；2)野生型磷酸肽C、野生型非磷酸化肽C、同位素富集的磷酸肽C和同位素富集的非磷酸化肽C；以及3)野生型磷酸肽D、野生型非磷酸化肽D、同位素富集的磷酸肽D和同位素富集的非磷酸化肽D。
本发明的试剂盒可包含约0.001至约999pg/mL、ng/mL、ug/mL或mg/mL的野生型肽或同位素富集肽的化学等分试样。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可包含约0.001、约0.005、约0.01、约0.05、约0.1、约0.5、约1、约2.5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100pg/mL、ng/mL、ug/mL或mg/mL的野生型肽或同位素富集肽的化学等分试样。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可包含约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约625、约650、约675、约700、约725、约750、约775、约800、约825、约850、约875、约900、约925、约950或约975pg/mL、ng/mL、ug/mL或mg/mL的野生型肽或同位素富集肽的化学等分试样。在一些实施方案中，野生型肽或同位素富集肽的化学等分试样可以以飞摩尔/微升(fmol/μL)或皮摩尔/微升(pmol/mL)为单位。在一些实施方案中，本发明可包含野生型肽或同位素富集肽的化学等分试样，其为约0.001-1000fmol/μL或1-1000pmol/μL血浆或生物基质。
本发明的试剂盒可包含磷酸肽样品，其中至少0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的样品由具有经同位素富集的氨基酸残基的分子组成。
可使用本发明的试剂盒通过比较测试样品与对照样品来对来自患有PAH的受试者的血沉棕黄层提取物中的磷酸化肽和相应磷酸化蛋白质的量进行定量。在一些实施方案中，该试剂盒可用于在测定中比较患有PAH的受试者在特定时间点的磷酸肽和相应磷酸化蛋白质的水平与不同时间点的水平。在一些实施方案中，肽序列用稳定同位素如15N或13C标记，该稳定同位素被掺入序列的C-末端精氨酸或赖氨酸中。
所公开的试剂盒可包含具有末端或内部标记的肽的稳定的、同位素富集的肽。在一些实施方案中，将同位素富集的L-赖氨酸(H2*N(*CH2)4*CH(*NH2)*COOH·2HCl)掺入到磷酸化肽或非磷酸化肽中。在一些实施方案中，将同位素富集的L-精氨酸(H2*N*C(＝*NH)*NH(*CH2)3*CH(*NH2)*COOH·HCl)掺入到磷酸化肽或非磷酸化肽中。
在一些实施方案中，所公开的试剂盒包含至少一种稳定的、同位素富集的内标物。在一些实施方案中，该试剂盒的肽可在内标物触发的PRM-MS分析中使用。在一些实施方案中，该试剂盒包含表6或表7中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种稳定的、同位素富集的内标物。在一些实施方案中，该试剂盒包含表6或表7中的1、2、3、4或5种同位素富集的内标物。在一些实施方案中，该试剂盒包含表6或表7的3种同位素富集的内标物。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白质中磷酸化的增加。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测1、2、3、4或5种蛋白质中磷酸化的增加。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测至少3种蛋白质中磷酸化的增加。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白质中磷酸化的降低。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测1、2、3、4或5种蛋白质中磷酸化的降低。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测至少3种蛋白质中磷酸化的降低。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白质中磷酸化的增加，以及检测1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白质中磷酸化的降低。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测1、2、3、4或5种蛋白质中磷酸化的增加，以及检测1、2、3、4或5种蛋白质中磷酸化的降低。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测3种蛋白质中磷酸化的增加以及检测3种蛋白质中磷酸化的降低。
本发明的应用
被鉴定为具有增加或降低的磷酸化的蛋白质可以用作诊断受试者中的PAH的生物标志物。在一些实施方案中，可将测试样品的磷蛋白水平与非PAH对照样品的磷蛋白水平进行比较以检测PAH的存在。在一些实施方案中，测试样品的磷蛋白水平可用于通过比较磷蛋白的量与在较早时间获得的样品的磷蛋白的量来确定PAH的进展。在一些实施方案中，可监测磷蛋白水平并将其与在较早时间获得的样品的磷蛋白水平进行比较以监测PAH疗法的效果。
所公开的发明可使用评分系统来确定PAH的存在或监测PAH的进展。在一些实施方案中，测试样品与对照样品的磷蛋白水平的差异被分配一个评分。可以对测试样品中的多于一种蛋白质的磷蛋白水平进行定量并生成总评分。可将样品的评分或总评分与对照样品的评分或总评分进行比较，以诊断或监测PAH的进展。在一些实施方案中，样品的评分或总评分高于对照样品的评分或总评分表明PAH恶化。在一些实施方案中，样品的评分或总评分低于对照样品的评分或总评分表明PAH改善。
所公开的发明可用作PAH治疗的伴随诊断。本发明还可用于检测或治疗由左心疾病引起的PAH，包括由左心室收缩功能障碍、左心室舒张功能障碍、心瓣膜病、先天性或获得性左心流入/流出道阻塞和先天性心肌病导致的PH。
本发明可检测或监测由肺病和/或缺氧引起的PH的治疗，该肺病和/或缺氧包括慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性肺病、具有限制性和阻塞性混合形式的其他肺病、睡眠障碍性呼吸、肺泡通气不足病症、长期暴露于高海拔以及发展性肺病。
本发明可检测或监测由慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)引起的PH的治疗。本发明还可检测或监测由不明的多因素机制导致的PAH的治疗，包括由血液学病症(例如，慢性溶血性贫血、骨髓增生性疾病、脾切除术(spienectomy))、全身性病症(例如，结节病、肺组织细胞增生症、淋巴管平滑肌瘤病)、代谢病(例如，糖原贮积症、戈谢病、甲状腺病)以及其他病症如肿瘤样阻塞、纤维性纵隔炎、慢性肾功能衰竭和节段性PH导致的PAH。
本发明可用于鉴定患有PAH，例如与免疫系统激活失调相关的PAH的受试者。本发明可用于鉴定患有与骨形态发生2型受体(BMPR2)、激活素样激酶1型(ALK-1)、内皮糖蛋白(ENG)、SMAD家族成员9(SMAD9)、窖蛋白1(CAV1)或钾双孔结构域通道亚家族K成员3(KCNK3)中的基因突变相关的遗传性PAH的受试者。本发明可用于鉴定患有与结缔组织病、HIV感染、门静脉高压、先天性心脏病、血吸虫病、肺静脉闭塞性疾病、肺毛细血管多发性血管瘤或PPHN相关的PAH的受试者。
本发明可用于检测磷蛋白水平的变化。在一些实施方案中，本发明可检测磷蛋白水平的变化并确定这些变化是否与临床上重要的终点，如死亡风险、PAH住院治疗和列入肺移植相关。PMBC中增加和/或降低的磷蛋白的亚组可用于鉴定不太可能对治疗有反应的预后不良的受试者亚组。
实施例
I.磷酸化蛋白质组学分析
实施例1：获得iPAH和对照组织样品。
在肺移植时获得来自患有iPAH的受试者的样品。从无病理学且不用于移植的供体肺获得对照样品。
表1示出了iPAH和对照受试者的临床特征。表1的临床数据包括每名受试者的诊断、年龄和性别。右心导管插入(RHC)数据包括以mm Hg计的受试者的右动脉(RA)压力、以mmHg计的平均肺动脉(PA)压力、以mm Hg计的肺毛细血管楔压(PCWP)和以L/min计的心输出量(CO)。表1还示出了在获得组织样品时受试者接受的药物，其包括磷酸二酯酶5(PDE-V)抑制剂、内皮素受体(ET)拮抗剂和前列腺素类。
表1
缩写：iPAH＝特发性PAH，APAH SSC＝与系统性硬化或硬皮病相关的PAH；RA＝右房压，PA＝肺动脉压；PCWP＝肺毛细血管楔压；CO＝心输出量；PDE-V＝V型磷酸二酯酶
实施例2：用于磷酸化蛋白质组学分析的样品制备。
使用磷酸化蛋白质组学分析来比较从患有iPAH的受试者获得的肺组织与从健康受试者获得的肺组织。使用来自三名iPAH女性受试者、三名男性iPAH受试者、三名健康女性受试者(女性对照)和三名健康男性受试者(男性对照)的冷冻肺组织进行磷酸化蛋白质组学分析。
使用PowergenTM匀浆器(VWR)将每个样品组的肺组织样品在RIPA缓冲液(158mMNaCl、10mM TRIS pH 7.2、0.1％SDS、1％Triton x100、1％脱氧胆酸盐、1mM EGTA、40mMβ-甘油磷酸酯、30mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、1mM咪唑、2mM原钒酸钠、1Roche minitab蛋白酶抑制剂、1Roche minitab phosphostop tab/10mL)中匀浆化。通过离心机以10,000转/分钟(rpm)来旋转样品，并将上清液进行超声处理且再次旋转。
使用二喹啉甲酸(BCA)测定法测定样品的蛋白质浓度。样品在-80℃下储存直至使用。蛋白质用氯仿和甲醇沉淀，重悬于8M尿素/0.4M碳酸氢铵溶液中，并进行Lys C/胰蛋白酶消化。
合并各组的全肺匀浆，使用强阳离子交换色谱法和重复的基于TiO2的柱色谱法(SCX/TiO2)来富集磷蛋白，并进行LCMS/MS分析。
实施例3：对来自患有iPAH的受试者的组织进行的磷酸化蛋白质组学分析
使用无定量标记的磷酸化蛋白质组学策略来鉴定肽，并确定iPAH与对照组织样品的磷酸肽的相对差异。
仪器：使用配备有Waters nanoAcquityTM超高效液相色谱(UPLCTM)系统、Waters
C18 180μm x 20mm捕集柱和1.7μm,75μm x 250mm nanoAcquityTM UPLCTM柱(35℃)的LTQ Orbitrap ELITETM(Thermo ScientificTM)进行肽分离。使用99％的缓冲液A(水中的0.1％甲酸)以5μL/min的流速捕集3分钟。使用缓冲液B(乙腈中的0.1％甲酸)以300nL/min的流速在200分钟内以线性梯度进行肽分离。
数据分析：使用ProgenesisTM LC-MS软件(Nonlinear Dynamics,LLC.)处理特征抽取、色谱/光谱比对、数据过滤、统计分析和LFQ数据。将‘.raw’数据文件导入到该程序中，并选择一个样品运行作为参考。该参考通常位于样品集中所有运行的中间或中间附近。所有其他运行都自动与该样品运行对齐，以使运行之间的保留时间(RT)变化最小化。由于光谱仪的高质量精度——通常<3ppm，因此无需对m/z大小进行调整。选择全部运行以进行具有自动检测限的检测。富集级分和流过级分被分开处理。
然后计算每次运行的归一化因子以解释注射之间样品载荷的差异。每次运行的多次注射被分组在一起。随后算法计算并将数据集中的每个特征的原始和归一化丰度、最大变化倍数和Anova值制成表格。根据特性如MSMS>1和p<0.05对数据集中的这些特征进行标记。其余MS/MS数据作为Mascot通用文件(.mgf)导出以供数据库搜索。Mascot(MatrixScience)搜索后，创建结果的.xml文件并将其导入到ProgenesisTM LCMS软件中，在该软件中将搜索命中分配给相应特征。
数据库搜索：使用Mascot搜索算法搜索并识别由ProgenesisTM LC-MS软件创建的‘.mgf’文件，从而获得未解释的MS/MS光谱。搜索参数如下：
-搜索的数据库：Swissprotein
-分类学：人类
-置信水平：95％落入基于随机性的用于检索命中蛋白质的Mascot搜索引擎内
-搜索类型：MS/MS离子搜索
-酶：胰蛋白酶/Lys C
-可变修饰：脲基甲基(Cys)，氧化(Met)，磷酸(Ser、Thr、Tyr)
-质量值：单同位素
-蛋白质质量：不受限制
-肽质量公差：±5ppm
-片段质量公差：±0.2Da
-电荷：+7
-错配的切割最大值：3
-诱饵：是
95％的置信水平意指如果1500种肽落在关于前体质量的质量公差窗口内并且选择显著性阈值为0.05(95％置信水平)，则蛋白质有1/20的几率被鉴定为假阳性。
使用Mascot数据库搜索算法，当Mascot将该模式列为显著的且超过2种独特的肽匹配相同蛋白质时，蛋白质被认为是阳性命中。Mascot显著性评分匹配基于分子量搜索(MOWSE)评分，并依赖于与来自相同蛋白质的多于一种肽的多重匹配。使用p<0.05的显著性截止值将Mascot搜索结果导出为.xml文件。还计算了Q值。
富集的磷酸肽分析生成了60,428个特征。根据这些特征，鉴定出6622种蛋白质。在所鉴定的蛋白质的亚组中，1480种磷酸肽的q<0.05。测定女性iPAH与女性对照以及男性iPAH与男性对照的q<0.05的磷酸肽的相对富集。
表2示出了具有最高磷酸化比值的10种磷酸肽。结果显示IKZF3、HMHA1、BCAS3、RHG25、NUMA1、LEUK、MUC1、NU214、WDR24、AQR、1A69、ASPP1、MK14、ZN404、OSB11和HDGF的磷酸化增加。
在S378处磷酸化的IKZF3具有最高的磷酸化比值，并且在对照样品中未检测到磷酸化。还发现S73处高相对丰度的磷酸化的HMHA1。与男性对照相比，HMHA1的磷酸化在男性iPAH样品中增加了6倍。在S709处磷酸化的BCAS3显示女性iPAH样品和男性样品相比于其各自的对照分别增加了119倍和10倍。在T442处磷酸化的RHG25的量在iPAH女性样品中增加了18.95倍，而在iPAH男性样品中增加了2.75倍。
在S2047处磷酸化的NUMA1显示在女性iPAH样品中增加了15倍。在男性iPAH样品中，在对照中没有检测到在S2047处磷酸化的NUMA1，并提供了磷酸化的“无穷大(∞)”增加(即，男性对照分母为零)。与相应对照相比，女性iPAH样品中S1969处磷酸化的NUMA1增加了15倍。在S999处磷酸化的NCOR1显示在女性iPAH样品中增加了7.4倍，而与之相比，在男性iPAH样品中增加了3.3倍(数据未示出)。
在S710处磷酸化的ASPP1的量在iPAH女性中相比于女性对照增加了8.8倍，而在男性iPAH肺样品中相比于对照增加了208.7倍。在S107处磷酸化的HDGF显示在女性iPAH样品和男性iPAH样品中相比于其各自的对照分别增加了8.1倍和37.1倍。
表2
表格命名法：方括号，即[3]，是指序列中被磷酸化或脲基甲基化的氨基酸位置；圆括号是指在所述位置上被磷酸化的氨基酸，即(S)，例如，对于SEQ ID NO.1，序列中位置3的丝氨酸被磷酸化。针对氨基酸缩写使用了IUPAC氨基酸密码体系。
分析采用定制的磷酸特异性(S378)抗体的Western印迹以确认iPAH肺提取物中磷酸化的S378IKZF3的量相对于对照增加。制备抗IKZF3的N-末端和C-末端处IKZF3的磷酸特异性位点的兔多克隆IgG抗体。对抗体进行亲和纯化和负吸附。在Western印迹中使用抗IKZF3的磷酸特异性抗体和总抗体来比较iPAH、硬皮病相关PAH(SSC-APAH)和对照样品中的磷酸蛋白质水平。
图1A示出了与对照样品(n＝6)相比，iPAH(n＝5)样品中在S378处磷酸化的IKZF3的信号更高。图1B示出了与对照样品(n＝3)相比，SSC-APAH样品(n＝3)中在S378处磷酸化的IKZF3的信号更高。
免疫组织化学实验证实了表2和表3中的蛋白质的存在，并指示免疫和炎性细胞参与了PAH病理学。使用定制的pIKZF3抗体进行免疫组织化学实验。T细胞标志物和B细胞标志物用于将pIKZF3的表达定位于iPAH、SSC-APAH和对照肺切片中的特定细胞类型。还使用抗-HMHA1抗体进行了免疫组织化学。
免疫组织化学实验表明，iPAH肺样品中血管周浸润物中的pIKZF3主要是T细胞，并存在一些B细胞，这两种细胞在正常对照中均未发现。免疫组织化学实验还表明淋巴细胞中的pIKZF3围绕严重肥大的肺小动脉。图2显示与对照样品(图2A和图2B)相比，iPAH样品(图2C和图2D)在血管周浸润物中具有增加的pIKZF3。对于磷酸化的S378IKZF3染色呈阳性的细胞密集地围绕肥大的肺小动脉。发现血管周浸润物含有CD3+，CD8+T细胞和CD20+B细胞的混合群体。还检测到CD45ra+T细胞，但程度较低。
图3示出了iPAH肺组织的免疫组织化学，并示出了炎性血管周浸润物。CD3：抗T细胞标志物的抗体；CD20：抗B细胞标志物的抗体；pIKZF3：抗S378pIKZF3的抗体。pIKZF3主要存在于血管周细胞中，但也在病变的肺小动脉的内皮样细胞中可见。血管周细胞主要是T细胞，并存在一些B细胞，这两种细胞在正常对照中均未发现。
图3A示出了10X物镜下的pIKZF3。图3B示出了40X物镜下的pIKZF3。箭头指向内皮被染色的肺小动脉小腔。图3C示出了10X物镜下的CD3T细胞标志物。图3D示出了40X物镜下的CD3T细胞标志物。T细胞主要见于血管周围，并且发现T细胞多于B细胞。图3E示出了10X物镜下的CD20B细胞标志物。图3F示出了40X物镜下的CD20B细胞标志物。
图4示出了iPAH肺切片中所见的血管周浸润物对于CD8是高阳性的(图4A：10X物镜；图4B：40X物镜)。在血管周浸润物中分散的细胞对于CD45RA染色呈阳性。CD45RA是一种蛋白质酪氨酸磷酸酶，并且用作细胞溶解性T淋巴细胞的标志物。
HMHA1也被定位于重塑的肺小动脉周围的血管周浸润物中。在SSC-APAH样品中，肺小动脉周围的细胞对于HMHA1呈高阳性。图5A和5B示出了正常对照中的HMHA1。图5C和图5D示出了SSC-APAH肺样品中的血管周浸润物(图5C：10X物镜；图5D：40X物镜)。图5E和5F示出了iPAH肺样品中血管周浸润物中的HMHA1(图5E：10X物镜；图5F：40X物镜)。
表3示出了具有最低磷酸化比值的10种磷酸肽。与对照样品相比，在iPAH女性和男性样品中显示出低相对丰度的磷酸化蛋白质包括磷酸化形式的PTPRB、SNG2L、HTSF1、PSIP1、ANXA2、S10A9、RLA2、TM100、SRSF2、PLD1、BI2L2、TENS1、MAP1B和CTNA1。
与对照相比，HDAC2在S422处的磷酸化在女性和男性iPAH肺样品中降低。PTPRB的磷酸化在S119处完全不存在。
表3
表格命名法：方括号，即[3]，是指序列中被修饰的氨基酸位置；圆括号是指在所述位置上被修饰的氨基酸，即(S)。例如，对于SEQ ID NO.18，序列中位置4的丝氨酸被磷酸化。修饰的缩写：Phospho＝磷酸化；Carbamidomethyl＝脲基甲基，S＝丝氨酸，T＝苏氨酸，Y＝酪氨酸。对于氨基酸缩写使用了IUPAC氨基酸密码体系。
II.使用生物标志物检测和诊断PAH
实施例4：制备用于生物标志物测定的样品。
在RIPA缓冲液(158mM NaCl、10mM TRIS pH 7.2、0.1％SDS、1％Triton x100、1％脱氧胆酸盐、1mM EGTA、40mMβ-甘油磷酸酯、30mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、1mM咪唑、2mM原钒酸钠、1Roche minitab蛋白酶抑制剂、1Roche minitab phosphostop tab/10mL)中裂解PBMC或血沉棕黄层，并通过离心机以14,000rpm旋转10分钟。离心后，收集上清液，并用甲醇-氯仿混合物使蛋白质沉淀。
将所得蛋白质沉淀重悬于0.1M四乙基溴化铵(TEAB)/0.1％RapiGestTM缓冲液中，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)在55℃下还原60分钟，然后在黑暗中室温下用碘乙酰胺烷基化30分钟。通过在37℃下温育样品过夜，用胰蛋白酶消化变性的蛋白质。通过使用Hitachi L-8900氨基酸分析仪TM的氨基酸分析来测定胰蛋白酶消化物中的肽浓度。使用TiO2富集试剂盒(ThermoFisher ScientificTM)富集胰蛋白酶消化物中的磷酸肽，并使用Sep-Pak柱脱盐。
在富集的磷酸肽中掺入稳定的、同位素标记的磷酸肽内标物，并对该混合物进行PRM-MS分析。也可用内标物和未标记的磷酸肽标记血沉棕黄层样品以测定提取率。该分析包括低浓度、中等浓度和高浓度的质量控制样品。测定整个磷酸肽组的精确度、准确度、线性范围、最低检测限(LLOD)和最低定量限(LLOQ)水平。
验收标准：线性度为4至5个数量级，并具有≤10％的变异系数。在三次注射的变异系数(CV)低于20％以及平均准确度在80-120％内的情况下，LLOQ被定义为最低浓度。在LLOQ以上，准确度(测定的-标称)/测定浓度为±15％。精确度(重复测定的SD)/重复测定的平均值为≤15％。灵敏度为飞摩尔/ml的量级，且与一些酶联免疫吸附(ELISA)测定类似。
质谱数据采集：使用在前端与
nanoACQUITY
系统接口联接的Orbitrap-FusionTM TribridTM MS上的PRM来分析样品。首先，通过在Orbitrap-FusionTM中进行依赖于数据的采集(DDA)来生成光谱库。对于DDA，在Orbitrap区域以120,000的分辨率、4×105的自动增益控制(AGC)目标和50ms的最大注射时间采集全扫描质谱(m/z范围为400-1600)。根据全扫描质谱中最强烈的离子并从其开始选择MS/MS的前体离子。MS/MS的前体离子处于四极区域，隔离窗口为1.6m/z，并且在离子阱区域通过更高的碰撞能量解离(HCD)片段化，其中归一化的碰撞能量被设置为28。在轨道阱区域以60,000的分辨率、1×105的AGC目标和120ms的最大注射时间获得片段化谱。离子的选择和片段化包括15s的动态排除设置以使肽的重复测序最小化。
对于PRM-MS，Orbitrap-FusionTM MS以目标-MS2数据采集模式运行。从采集的DDA数据中获取建立用于通过PRM分析目标轻肽和重肽的包含列表所需的信息，如前体m/z、电荷状态和洗脱时间。PRM的数据采集参数与DDA模式下用于MS/MS扫描的参数类似。假设色谱仪的平均宽度约为30s，则MS/MS扫描的循环时间保持在3s或更短，以获得至少10个跨越色谱峰的数据点。
为了增加测定列表的磷酸肽的数目，可以实施预定的PRM方法。如在第一个DDA实验中所确定的，在预定的PRM方法中，在预先选择的LC保留时间内仅靶向目标肽。在Skyline分析软件中使用光谱库来对目标肽进行分配和定量。预定的监测还确保各种肽的最高复合能力被量化。预定意味着运行测试样品以确定与每个目标肽相关的准确保留时间。
数据分析：使用Proteome DiscovererTM v2.0(Thermo Scientific)软件处理来自DDA分析的MS原始数据。使用Sequest HT和Mascot搜索算法，在人类SwissProt数据库中搜索文件。使用Percolator(Matrix Science)基于设置为1％错误发现率(FDR)的q值来验证肽谱匹配(PSM)。将鉴定的蛋白质和肽列表用作Skyline软件中PRM数据分析的光谱库。靶向肽的定量基于选择的每种前体离子的排名前五位的产物离子。
手动验证经处理的Skyline数据，并且去除具有干扰的产物离子并用下一个排名最高的产物离子将其替代。利用整个样品中轻肽与重肽的片段离子的积分峰面积之比进行样品的相对定量。将感兴趣位点处的磷酸化相对于蛋白质的若干个非磷酸化位点的平均丰度进行归一化，以产生磷酸化程度的相对丰度值。
实施例5：血沉棕黄层提取物的磷酸酶抑制剂处理
进行稳定性研究以确定直接向血液样品添加抑制剂混合物，在分离血沉棕黄层后添加抑制剂混合物，或者在分离之后但在提取之前用含抑制剂混合物的缓冲液洗涤血沉棕黄层细胞的效果。对于使用研究级别的磷酸特异性抗体所选择的磷蛋白，使用PRM-MS测定和Westerb印迹分析来确定血沉棕黄层提取物的稳定性。用于稳定性研究的磷酸特异性抗体包括pIKZF3、pNUMA1和pHDAC2的抗体。
在BD公开的收集程序(REF 362761)之后，将样品收集在具有柠檬酸钠和ficoll的BD
CPTTM细胞制备管中。收集程序通过离心机旋转、分离、洗涤并浓缩PBMC以备进一步使用。通过添加磷酸酶抑制剂混合物或用含该抑制剂混合物的缓冲液洗涤细胞来修改该收集程序，以保持磷蛋白的稳定性。
在血液采集时将磷酸酶抑制剂混合物添加到血液样品中或在从PBMC分离后添加到血沉棕黄层。将非溶解性非变性抑制剂混合物添加到血液样品中。对于血沉棕黄层样品，将样品重悬于裂解缓冲液中并在液氮中快速冷冻以便在测定该样品之前保存。测试非磷酸酶抑制样品和磷酸酶抑制样品以确定是否需要磷酸酶抑制，以及如果需要的话，则确定需要在收集过程的哪个阶段进行。当信号降解低于25％时，样品被认为是可接受的。
蛋白质提取：遵循Thermo FisherTM(Pierce)程序89900并使用RIPA缓冲液从PBMC中提取胞质蛋白质，包括磷蛋白。该程序与磷酸盐抑制剂混合物相容或不相容。通过对总蛋白质含量、总磷蛋白含量进行定量并鉴定由上述蛋白质组学分析产生的每种特定的磷蛋白来测试来自PBMC的蛋白质提取。
实施例6：对照样品和PAH样品的基线筛选
从患有PAH的受试者、未患PAH的SSC受试者和健康受试者收集血沉棕黄层细胞和PBMC。健康保险携带和责任法案(Health Insurance Portability and AccountabilityAct，HIPAA)兼容数据库允许分析临床参数。该数据库限制访问，并且在发布与样品匹配的临床数据之前移除受试者标识符。随着时间的推移跟踪研究受试者的临床过程，随着时间的推移候选生物标志物的变化与临床结果相关。
临床参数包括年龄、性别、PH分类、遗传标志物(即，BMPR2突变、ALK或内皮糖蛋白突变的存在)、药物、功能类别、六分钟步行距离、心肺血液动力学和临床过程(即，住院治疗、列入肺移植、死亡率)。
使用测试数据集和验证数据集进行该研究。测试集选入患有PAH的受试者(n＝30名iPAH，n＝30名SSC-APAH)、患有SSC但未患PAH的受试者(n＝20)和正常对照(n＝20)。验证集使用显示出在PAH受试者与正常对照之间有显著差异的测定(以上描述)来筛选患有PAH的受试者(n＝30名iPAH，n＝30名SSC APAH)、患有SSC但未患PAH的受试者(n＝20)和正常对照(n＝20)的类似的横截面(cross section)受试者。
针对指定的磷蛋白的PRM-MS分析结果与上面列出的临床数据库中的参数相关。入选标准包括：年龄>18岁，诊断为PAH，患有SSC但未患PAH，或正常对照。充当正常对照的受试者没有系统性疾病史，如高血压、DM、甲状腺疾病、出血异常、活动性感染、哮喘、癌症、肾衰竭、吸烟或药物滥用。排除标准包括：年龄<18岁，共病的病况如目前的癌症，或使用免疫抑制剂(包括类固醇)进行治疗。
分析：分析用于诊断PAH(存在/不存在)的生物标志物并分析用于PAH预后(好/坏)的生物标志物。用于PAH预后的生物标志物的分析试图鉴定能预测PAH恶化的一组磷蛋白。恶化的PAH包括死亡率增加、因PAH引起的住院率增加、六分钟步行距离(6MWD)减少、恶化的功能类别、需要肺移植或需要添加前列腺素类。
使用Wilcoxon秩和检验来确定单独的磷蛋白生物标志物与PAH的存在或PAH的恶化之间的关联。使用逻辑回归来分析磷蛋白水平。将回归系数合并以形成“分类器评分”。当线性组合≥或<截止阈值时，诊断测试被确定为阳性或阴性。对于给定的截止阈值，通过绘制灵敏度相对于1-特异性的图生成ROC曲线。检查所有生物标志物亚组以评估每个亚组的预测值。
在鉴定出候选逻辑回归模型之后，使用交叉验证来“调整”该模型。还使用minmax凹罚法(MCP)进行变量选择，其对于ROC曲线具有更大的预测AUC。在确定最佳模型后，将该模型应用于验证集。使用XLSTATTM(Pearson)或类似程序进行逻辑回归的功效计算。样本量为30的参数包括：α设定为0.05，基线概率为0.1，替代概率为0.7：β＝0.057，功效＝0.943。如果替代概率设定为0.6，则功效降至0.85。
实施例7：稳定的、同位素富集的肽序列
制备表2和表3中的肽的稳定的、同位素富集的变体，并将其用作PRM-MS测定中的内标物以检测或监测PAH的进展。在一些实施方案中，将稳定的、同位素富集的精氨酸(R)或赖氨酸(K)引入到表2和表3中的每种肽的C-末端和相应的非磷酸化肽。在一些实施方案中，将稳定的、同位素富集的精氨酸(R)或赖氨酸(K)嵌入到表2和表3中的每种肽的序列中和相应的非磷酸化肽中。
表4示出了用于合成稳定的、同位素富集的肽的同位素标记的L-精氨酸的实例。表5示出了用于合成稳定的、同位素富集的肽的同位素标记的L-赖氨酸的实例。
表4
表5
表6示出了具有最高磷酸化比值的17种磷酸肽的稳定的、同位素标记的磷酸化肽和非磷酸化肽(表2)，并且其可用作PRM-MS测定中的标准物。示出了磷酸化肽序列和非磷酸化肽序列以及可变修饰。在圆括号中(例如，(S)或(T))显示可变的磷酸化氨基酸。在大括号中(例如，{K})显示稳定的、同位素富集的氨基酸。
表7示出了具有最低磷酸化比值的14种磷酸肽的稳定的、同位素标记的磷酸化肽和非磷酸化肽(表3)，并且其可用作PRM-MS测定中的标准物。示出了磷酸化肽序列和非磷酸化肽序列以及可变修饰。在圆括号中(例如，(S))显示可变的磷酸化氨基酸。在大括号中(例如，{K})显示稳定的、同位素富集的氨基酸。
表6
圆括号(例如，(S)或(T))表示氨基酸的磷酸化
大括号(例如，{K})表示稳定的、同位素标记的氨基酸
表7
圆括号(例如，(S)或(T))表示氨基酸的磷酸化
大括号(例如，{K})表示稳定的、同位素标记的氨基酸
实施方案
以下非限制性实施方案提供了本发明的说明性实例，而并非限制本发明的范围。
实施方案1.一种方法，其包括：a)向从血沉棕黄层中提取的蛋白质样品中添加一定量的定量标准物以提供测试样品；以及b)测定所述测试样品以对该测试样品中从血沉棕黄层中提取的蛋白质的野生型磷酸肽进行定量，其中所述定量基于所述定量标准物的量，其中所述定量标准物是同位素富集至非天然同位素丰度的所述磷酸肽的形式。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其进一步包括：a)从人类受试者获得组织样品，其中所述组织样品含有所述血沉棕黄层；以及b)从所述组织样品中分离蛋白质以提供所述蛋白质样品。
实施方案3.根据实施方案1-2中任一项所述的方法，其进一步包括在添加所述一定量的所述定量标准物之前消化所述蛋白质样品。
实施方案4.根据实施方案2-3中任一项所述的方法，其中所述人类受试者患有肺高压。
实施方案5.根据实施方案2-4中任一项所述的方法，其中所述人类受试者患有肺动脉高压。
实施方案6.根据实施方案4-5中任一项所述的方法，其中所述肺高压为特发性肺高压。
实施方案7.根据实施方案4-5中任一项所述的方法，其中所述肺高压为与系统性硬化相关的肺高压。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述定量标准物为表2或表3中的同位素富集的肽。
实施方案9.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述定量标准物为表6或表7中的同位素富集的肽。
实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述定量通过质谱法进行。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述定量通过平行反应监测质谱法进行。
实施方案12.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述定量通过使所述测试样品与磷酸特异性抗体接触而进行。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述定量包括检测所述野生型磷酸肽的量与非磷酸化形式的所述野生型肽的量的比值。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述野生型磷酸肽的量与所述非磷酸化形式的野生型肽的量的比值大于从获自患有肺动脉高压的测试受试者的对照样品得到的相应比值。
实施方案15.根据实施方案13所述的方法，其中所述野生型磷酸肽的量与所述非磷酸化形式的野生型肽的量的比值小于从获自患有肺动脉高压的测试受试者的对照样品得到的相应比值。
实施方案16.根据实施方案13所述的方法，其中所述野生型磷酸肽的量与所述非磷酸化形式的野生型肽的量的比值大于从未患肺动脉高压的测试受试者得到的相应比值。
实施方案17.根据实施方案13所述的方法，其中所述野生型磷酸肽的量与所述非磷酸化形式的野生型肽的量的比值小于从未患肺动脉高压的测试受试者得到的相应比值。
实施方案18.一种包含磷酸肽样品的化学等分试样，其中至少1％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成，其中所述样品含有至少1pg所述磷酸肽，其中所述磷酸肽与表2或表3中的任何化合物具有至少90％的序列同一性。
实施方案19.根据实施方案18所述的化学等分试样，其中至少10％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成。
实施方案20.根据实施方案18-19中任一项所述的化学等分试样，其中至少50％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成。
实施方案21.根据实施方案18-20中任一项所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基含有至少三个13C核。
实施方案22.根据实施方案18-20中任一项所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基含有六个13C核。
实施方案23.根据实施方案18-22中任一项所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基含有至少两个15N核。
实施方案24.根据实施方案18-23中任一项所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基为赖氨酸。
实施方案25.根据实施方案18-23中任一项所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基为精氨酸。
实施方案26.一种试剂盒，其包含：a)包含磷酸肽样品的化学等分试样，其中至少1％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成，其中所述样品含有至少1pg所述磷酸肽，其中所述磷酸肽与表2或表3任一个中的任何化合物具有至少90％的序列同一性；以及b)包含具有天然同位素丰度的核的所述磷酸肽样品的附加等分试样。
实施方案27.一种方法，其包括：a)从受试者获得组织的测试样品；b)测定所述测试样品以对该测试样品中肽的磷酸化水平进行定量；c)比较所述肽的磷酸化水平与对照样品中相应肽的磷酸化水平；d)基于所述肽的磷酸化水平与对照样品中相应肽的磷酸化水平的所述比较，确定所述受试者是否患有肺部病况；以及e)基于所述受试者是否患有肺部病况的所述确定，向所述受试者施用药物化合物，以治疗该肺部病况。
实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中所述测试样品中所述肽的磷酸化水平大于所述对照样品中相应肽的磷酸化水平。
实施方案29.根据实施方案27所述的方法，其中所述测试样品中所述肽的磷酸化水平小于所述对照样品中相应肽的磷酸化水平。
实施方案30.根据实施方案27-29中任一项所述的方法，其中所述药物化合物为激酶抑制剂。
实施方案31.根据实施方案27-30中任一项所述的方法，其中所述药物化合物为下式：
或其药学上可接受的盐。
实施方案32.根据实施方案27-31中任一项所述的方法，其中所述肺部病况为肺动脉高压。
实施方案33.根据实施方案27-32中任一项所述的方法，其中从患有肺动脉高压的受试者获得所述对照样品。
实施方案34.根据实施方案27-32中任一项所述的方法，其中从未患肺动脉高压的受试者获得所述对照样品。
实施方案35.根据实施方案27-34中任一项所述的方法，其中将所述测试样品中肽水平的定量保存到计算机系统中，其中所述计算机系统储存所述对照样品中相应肽的磷酸化水平，其中所述计算机系统的处理器执行所述比较。
实施方案36.根据实施方案27-35中任一项所述的方法，其中所述测试样品中的肽和所述对照样品中的相应肽具有相同的氨基酸序列。
Claims (9)
1.一种包含磷酸肽样品的化学等分试样，其中至少1％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成，其中所述样品含有至少1pg所述磷酸肽，其中所述磷酸肽是IKZF3，所述IKZF3序列为SEQ ID NO.1，并且其中第三位氨基酸是磷酸化的，且最后一位氨基酸被同位素标记。
2.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中至少10％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成。
3.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中至少50％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成。
4.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基含有至少三个13C核。
5.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基含有六个13C核。
6.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基含有至少两个15N核。
7.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基为赖氨酸。
8.根据权利要求1所述的化学等分试样，其中所述含有至少两个13C核的氨基酸残基为精氨酸。
9.一种试剂盒，其包含：
a)包含磷酸肽样品的化学等分试样，其中至少1％的所述磷酸肽样品由具有含有至少两个13C核的氨基酸残基的分子组成，其中所述样品含有至少1pg所述磷酸肽，其中所述磷酸肽是IKZF3，所述IKZF3序列为SEQ ID NO.1，并且其中第三位氨基酸是磷酸化的，且最后一位氨基酸被同位素标记；以及
b)包含具有天然同位素丰度的核的所述磷酸肽样品的附加等分试样。
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