CN108463727A - 用于得到细胞间空间接近度的计算机方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明部分涉及用于对包含来自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的系统和方法。所述得分代表至少一对细胞之间的接近程度，所述至少一对细胞的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞的第二成员表达与第一种生物标志物不同的第二生物标志物。从这些方法获得的得分可以指示患者可能对免疫疗法有积极响应的可能性。

Description

用于得到细胞间空间接近度的计算机方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月23日提交的申请号为62/245,933的美国临时申请，以及于2015年11月24日提交的申请号为62/259,326的美国临时申请的权益和优先权，两者全部内容均在此通过引用并入。
背景技术
本发明一般涉及癌症治疗领域。
发明内容
一方面，本文公开了用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的成像系统，所述成像系统包括成像装置和控制器，成像装置包括用于将样本定位在成像场中的台，用于在样本处引导电磁辐射的电磁辐射源，以及配置成检测来自样本的电磁辐射的检测器。控制器包括用于在操作员和控制器之间交换信息的用户界面；以及配置成执行存储在计算机可读介质上的指令的处理电路。将所述指令配置为使控制器：(i)从成像装置接收与检测到的电磁辐射有关的信息；(ii)基于检测到的电磁辐射生成图像数据；(iii)分析图像数据以确定代表至少一对细胞之间的接近程度(nearness)的得分，所述至少一对细胞的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞的第二成员表达与第一种生物标志物不同的第二生物标志物；和(iv)记录得分，当与阈值比较时，该得分表示癌症患者对免疫疗法会有积极响应的可能性。
在一些实施方式中，得分代表至少一对细胞之间的接近程度，该接近程度表示该细胞对彼此之间在预定接近度(proximity)内的程度。在一些实施方式中，在像素级上评估接近程度。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约1个像素到约100个像素。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约5个像素到约40个像素。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约0.5μm至约50μm。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约2.5μm至约20μm。
在一些实施方式中，通过获得该细胞对的边界之间的接近度来计算得分。在一些实施方式中，通过获得该细胞对的质量中心之间的接近度来计算得分。在一些实施方式中，使用基于该细胞对中所选的第一细胞周围的周界的边界逻辑来计算得分。在一些实施方式中，通过确定该细胞对的边界中的交点来计算得分。在一些实施方式中，通过确定该细胞对的重叠区域来计算得分。
在一些实施方式中，生成图像数据包括：(i)将与检测到的电磁辐射有关的信息分离成未混合的图像数据；(ii)通过多个数据通道提供数据，其中第一数据通道中的未混合图像数据描述可归属于第一生物标志物的荧光信号，第二数据通道中的未混合图像数据描述可归属于第二生物标志物的荧光信号。
在一些实施方式中，分析数据包括：(i)使用处理电路的扩张器，使来自第一数据通道的可归属于第一生物标志物的荧光信号扩展预定余量，将该预定余量选择为涵盖位于近侧的表达第二生物标志物的细胞以产生扩张的第一生物标志物掩膜；(ii)确定交互面积，其中交互面积是下述所有细胞的第一总面积，所述细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张的荧光信号内；和(iii)使用处理电路的交互计算器，将交互面积除以归一化因子，并且将得到的商乘以预定因子以得到空间接近度得分。
在一些实施方式中，归一化因子是具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。在一些实施方式中，归一化因子是视场中所有细胞的总面积。在一些实施方式中，交互面积通过组合扩张的第一生物标志物掩膜与代表表达第二生物标志物的细胞的掩膜而确定，第二生物标志物从第二数据通道的信号确定。在一些实施方式中，第三数据通道描述可归属于细胞核的荧光信号，第四数据通道描述归属于样本中的肿瘤区域的荧光信号。在一些实施方式中，通过组合基于来自第三数据通道的信号的、代表样本中的所有细胞的细胞掩膜，和基于来自第四数据通道的信号的、表达样本上的肿瘤区域的肿瘤区域掩膜，来确定具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总区域。在一些实施方式中，细胞掩膜和肿瘤区域掩膜的组合包括从细胞掩膜移除肿瘤区域掩膜。
在一些实施方式中，将处理电路进一步配置成使控制器：(i)以低放大率获得表示图像中的第一或第二生物标志物浓度的图像数据；(ii)识别包含第一或第二生物标志物最高浓度的区域；(iii)选择包括第一或第二生物标志物的最高浓度的预定数量的区域；(iv)向成像装置发送指令以获得预定数量的区域的高倍率图像数据；其中将高倍率图像数据提供给控制器以分析并用于确定得分。
在一些实施方式中，低倍率是小于或等于10倍的放大率，并且其中高倍率大于10倍。在一些实施方式中，低倍率是10倍放大率，并且其中高倍率是40倍。在一些实施方式中，低倍率是10倍放大率，并且其中高倍率是20倍。在一些实施方式中，低倍率是4倍放大率，并且其中高倍率是40倍。在一些实施方式中，低倍率是4倍放大率，并且其中高倍率是20倍。
在一些实施方式中，控制器将得分和与样本图像相关联的元数据相关联。在一些实施方式中，控制器生成包括得分的报告。在一些实施方式中，控制器将得分提供给操作者以确定免疫疗法策略。在一些实施方式中，控制器将得分记录在数据库中。在一些实施方式中，控制器将得分与患者的医疗记录相关联。
在一些实施方式中，电磁辐射源是从由白炽灯、荧光灯或二极管组成的组中选择的非相干电磁辐射源。在一些实施方式中，电磁辐射源是相干电磁辐射源。在一些实施方式中，系统还包括电磁辐射调节光学器件，其被定位成将来自电磁辐射源的电磁辐射引导至样本。在一些实施方式中，电磁辐射调节光学器件包括可调滤光器元件，所述可调滤光器元件被配置为使用不同的电磁辐射波段为样本提供照射。
在一些实施方式中，系统还包括电磁辐射会聚光学器件，所述电磁辐射会聚光学器件被配置为从样本接收发射的电磁辐射并且将所发射的电磁辐射作为输出电磁辐射引导至检测器。在一些实施方式中，电磁辐射会聚光学器件包括可调滤光器元件，所述可调滤光器元件被配置为从来自样本的电磁辐射中选择特定的电磁辐射波段。
在一些实施方式中，检测器包括至少一个CCD传感器。在一些实施方式中，检测器包括光电倍增管。在一些实施方式中，将检测器配置为生成与来自样本的电磁辐射对应的电信号，并将电信号传送至控制器。
在一些实施方式中，还将控制器配置为将电信号发送到上述台、电磁辐射源和检测器中的一个或多个以调节上述台、电磁辐射源和/或检测器的至少一个特性。在一些实施方式中，系统还包括用于向操作员显示信息的显示装置。在一些实施方式中，所显示的信息是系统的参数、系统的特性以及所捕获的样本图像中的一个。在一些实施方式中，控制器在显示装置上显示得分。
在一些实施方式中，与来自成像装置的所检测到的电磁辐射有关的信息是多个光谱图像。在一些实施方式中，多个光谱图像各自对应于由样本发射并由检测器检测到的电磁辐射的不同波长。在一些实施方式中，由样本发射的电磁辐射的每个波长对应于添加到样本的不同荧光团以识别样本中的特定特征。
在一些实施方式中，与定量第一生物标志物的表达或定量第二生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。在一些实施方式中，将预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方式中，阳性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是70％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是75％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是80％或更高。
另一方面，本文公开了对组织样本进行评分的方法，其包括：(i)使用成像系统来获取从癌症患者获取的组织样本的图像数据。成像系统包括外壳，外壳包括用于将样本定位在成像场中的台，用于将电磁辐射引导到样本处的电磁辐射源以及用于收集电磁辐射输出的检测器；和包括存储器和具有图像处理模块的处理电路的控制器；(ii)使用图像处理模块分析图像数据以确定表示一对细胞之间的接近程度的得分，所述细胞对的第一成员表达第一生物标志物，所述细胞对的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；和(iii)将得分记录在存储器中，当与阈值比较时，该得分指示癌症患者将对免疫疗法积极响应的可能性。
在一些实施方式中，得分代表该细胞对之间的接近程度，该接近程度表示该细胞对彼此之间在预定接近度内的程度。在一些实施方式中，图像数据的分析包括在像素尺度上评估接近程度。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约1个像素到约100个像素。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约5个像素到约40个像素。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约0.5μm至约50μm。在一些实施方式中，该细胞对之间的预定接近度从约2.5μm至约20μm。在一些实施方式中，通过获得该细胞对的边界之间的接近度来计算得分。在一些实施方式中，通过获得该细胞对的质量中心之间的接近度来计算得分。在一些实施方式中，使用基于该细胞对中所选的第一细胞周围的周界的边界逻辑来计算得分。在一些实施方式中，通过确定该细胞对的边界中的交点来计算得分。在一些实施方式中，通过确定该细胞对的重叠区域来计算得分。
在一些实施方式中，生成图像数据包括：(i)将与检测到的电磁辐射有关的信息分离成未混合的图像数据；(ii)通过多个数据通道提供数据，其中第一数据通道中的未混合图像数据描述可归属于第一生物标志物的荧光信号，第二数据通道中的未混合图像数据描述可归属于第二生物标志物的荧光信号。
在一些实施方式中，分析图像数据包括：(i)使用处理电路的扩张器，使来自第一数据通道的可归属于第一生物标志物的荧光信号扩张预定余量，将该预定余量选择为涵盖位于近侧的表达第二生物标志物的细胞以产生扩张的第一生物标志物掩膜；(ii)确定交互面积，其中交互面积是下述所有细胞的第一总面积，所述细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张的荧光信号内；和(iii)使用处理电路的交互计算器，将交互面积除以归一化因子，并且将得到的商乘以预定因子以得到空间接近度得分。
在一些实施方式中，归一化因子是具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。在一些实施方式中，归一化因子是视场中所有细胞的总面积。在一些实施方式中，确定交互面积包括将扩张的第一生物标志物掩膜与代表表达第二生物标志物的细胞的掩膜组合，其中第二生物标志物从第二数据通道的信号确定。在一些实施方式中，第三数据通道描述可归属于细胞核的荧光信号，第四数据通道描述归属于样本中的肿瘤区域的荧光信号。
在一些实施方式中，该方法还包括通过组合基于来自第三数据通道的信号的、代表样本中的所有细胞的细胞掩膜，和基于来自第四数据通道的信号的、代表样本上的肿瘤区域的肿瘤区域掩膜，来确定具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。在一些实施方式中，细胞掩膜和肿瘤区域掩膜的组合包括从细胞掩膜移除肿瘤区域掩膜。
在一些实施方式中，该方法还包括(i)使用成像系统以低倍率对代表图像中第一或第二生物标志物浓度的数据进行成像；(ii)识别包含第一或第二生物标志物最高浓度的区域；(iii)选择包括第一或第二生物标志物的最高浓度的预定数量的区域；(iv)向成像装置发送指令以获得预定数量的区域的高放大率图像数据；和(iv)其中将高放大率图像数据提供给控制器以进行分析并用于确定得分。
在一些实施方式中，低倍率是小于或等于10倍的放大率，并且其中高倍率大于10倍。在一些实施方式中，低倍率是4倍放大率，并且其中高倍率是20倍。
在一些实施方式中，该方法还包括将得分和与样本图像相关联的元数据相关联。在一些实施方式中，该方法还包括生成包含得分的报告。在一些实施方式中，该方法还包括将得分提供给专业人员以确定免疫疗法策略。在一些实施方式中，该方法还包括将得分记录在数据库中。在一些实施方式中，该方法还包括将得分与患者的医疗记录相关联。在一些实施方式中，该方法还包括在显示装置上显示得分。
在一些实施方式中，与定量第一生物标志物的表达或定量第二生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。在一些实施方式中，将预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方式中，阳性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是70％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是75％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是80％或更高。
在另一方面，本文公开了组织样本评分系统，其包括：(i)成像装置，其获得从癌症患者获取的组织样本的图像数据；(ii)控制器，控制器从成像装置接收图像数据并分析数据以确定表示一对细胞之间的接近程度的得分，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；(iii)其中当与阈值比较时，得分指示癌症患者将对免疫疗法有积极响应的可能性。
在一些实施方式中，成像装置包括用于将样本定位在成像场中的台，用于将电磁辐射引导到样本处的电磁辐射源，以及配置成检测来自样本的电磁辐射的检测器。
在一些实施方式中，电磁辐射选自由可见光和不可见光组成的组。在一些实施方式中，可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。在一些实施方式中，可见光包括波长落入大约400nm至大约700nm范围的可见光波段。在一些实施方式中，可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
在一些实施方式中，发射的或输出的电磁辐射包括来自由包括波长落在约440nm至约480nm，约490nm至约550nm，约505nm至约535nm，约550nm至约595nm，约585nm至约630nm，约600nm至约640nm和约650nm至约710nm的范围内的波段组成的组的一个或多个可见光波段。在一些实施方式中，电磁辐射选自由可见光和不可见光组成的组。在一些实施方式中，可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。在一些实施方式中，可见光包括波长落入大约400nm至大约700nm范围的可见光波段。在一些实施方式中，可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
在一些实施方式中，与定量第一生物标志物的表达或定量第二生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。在一些实施方式中，将预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方式中，阳性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是70％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是75％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是80％或更高。
附图说明
图1是用于获得样本的图像数据的成像装置的框图。
图2是根据示例性实施方式的被配置为对包含从癌症患者采集的肿瘤组织的样本进行评分的控制器的框图。
图3是根据示例性实施方式的用于对包括肿瘤组织的样本进行评分的过程的流程图。
图4是根据第二示例性实施方式的用于对包含肿瘤组织的样本进行评分的过程的流程图。
图5是根据示例性实施例的用于对包含肿瘤组织的样本的进行评分的图像处理步骤的流程图。
图6显示了在制备用于成像和分析的组织样本中使用的抗体和检测试剂的概况的非限制性实例。
图7a示出了图像内用DAPI检测到的所有细胞核的非限制性实例。
图7b示出了图7a内的所有细胞的扩张的二元掩膜的非限制性实例。
图8a示出了用488染料检测到的S100的图像的非限制性实例。
图8b示出了图8a内的所有肿瘤区域的二元掩膜的非限制性实例。
图8c示出了图8a中所有肿瘤细胞的掩膜的非限制性实例。
图8d示出了图8a内的所有非肿瘤细胞的掩膜的非限制性实例。
图9a示出了用5检测到的PD-L1图像的非限制性实例。
图9b示出了图9a内的所有PD-L1阳性细胞的二元掩膜的非限制性实例。
图10a示出了使用3.5检测到的PD-1的图像的非限制性实例。
图10b示出了图10a中所有PD-1阳性非肿瘤细胞的二元掩膜的非限制性实例。
图11a示出了所有PD-L1阳性细胞和最近的相邻细胞的交互掩膜的非限制性实例。
图11b示出了非常接近PD-L1阳性细胞的PD-1阳性细胞的交互隔室的非限制性实例。
图12a示出了来自26名黑素瘤患者的交互得分的非限制性实例。
图12b示出了来自图12a的26名患者的最大交互得分的非限制性实例。
图13示出了基于全载玻片图像的代替富集算法的分析结果。
图14示出了26名患者的交互得分与无进展存活率的比较。注意：*表示未更正的对数秩检验。
图15示出了患者的PD-L1表达与无进展存活率的比较。
图16示出了对于对免疫疗法呈阳性的响应者而言，与PD-L1阳性细胞(红色)，PD-1-阳性细胞(黄色)，所有肿瘤细胞(绿色)和所有细胞(蓝色)相对应的荧光信号的掩膜的非限制性实例。
图17示出了对于对免疫疗法呈阴性的响应者而言，与PD-L1阳性细胞(红色)，PD-1-阳性细胞(黄色)，所有肿瘤细胞(绿色)和的所有细胞(蓝色)相对应的荧光信号的掩膜的非限制性实例。
图18示出了来自38名非小细胞肺癌患者的代表性PD-1/PD-Ll交互得分。
图19示出了患者的使用22C3FDA-批准的IHC测定法确定的PD-L1表达与无进展存活率的比较。注：*表示使用未校正的时序检验确定p值。
图20a示出了来自34名另外的黑素瘤患者的交互得分的非限制性实例。
图20b示出了图20a的患者的交互得分与无进展存活率的比较。
图20c示出了来自图12a和12b的患者与图20a的患者的交互得分。
图20d示出了图20c的患者的交互得分与无进展存活率的比较。注：*表示使用未校正的时序检验确定p值。
图20e示出了图20c的患者的交互得分与总存活率(OS)的比较。注：*表示使用未校正的时序检验计算p值。
图21示出了来自29名转移性黑素瘤患者的CTLA-4/CD80交互得分的非限制性实施例。
图22示出了29名患有睾丸癌的患者的PD-1/PD-L1交互得分的非限制性实施例。
发明详述
以下描述各种实施方式。应该注意的是，这些具体实施方式并非旨在作为详尽的描述或作为对这里讨论的更广泛方面的限制。结合特定实施方式描述的一个方面不一定限于该实施方式，并且可以用任何其他实施方式来实践。
如本文所使用的，本领域普通技术人员可理解“约”，并且将根据其使用的上下文而在一定程度上变化。如果对于本领域普通技术人员来说不清楚的术语的使用，考虑到其使用的上下文，“约”将意指最多为特定术语的正负10％。
在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，除非在此另有指出或与上下文有明显矛盾之外，认为定冠词、不定冠词和词语“所述”以及类似对象涵盖单数和复数。除非另有指出，否则数值的叙述范围仅倾向于起到单独叙述落入该范围中的单个值的简化方法的作用，并且如同在此处单独叙述的一样，每个单个数值都合并到说明书中。在此描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非在此另有指示或者与上下文明显矛盾。此处所提供的任何及所有实例或示范性语言(如“例如”)都只是倾向于更好地描述本发明，除非另有说明，否则不对本发明的范围进行限制。不应当将说明书中的任何语言理解为表示任何未经明确指出的因素对实施本发明而言是必不可少。
术语“治疗”是指以在统计上显著的程度或所属领域的技术人员可检测的程度上改善与病症相关的状况、症状或参数，或阻止疾病的发展的量、方式和/或模式来施用疗法。有效量、方式或模式可视受试者而不同且可根据受试者进行调整。
一方面，本文提供了用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的方法的系统。
图1是示出了用于获取样本的多个光谱解析图像的成像装置100的示意图。电磁辐射(EMR)源102向调节光学器件104提供电磁辐射。在一些实施方式中，电磁辐射是可见光。EMR源102可以是非相干光源，例如白炽灯、荧光灯或二极管。EMR源102也可以是相干源，例如激光源，并且相干源可以提供连续波(CW)或脉冲光。EMR源102可以包含用于产生具有一定波长范围的光的多个光源元件(例如，多个二极管)。光可以是连续波(CW)或时间门控(即脉冲)光。此外，可以在电磁波谱的选定部分中提供光。例如，光可以具有中心波长和/或落在紫外线、可见光、红外线或光谱中其他区域内的波长的分布。在一些实施方式中，光具有落入大约380nm至大约720nm范围内的波长。EMR源102还可以包括各种光学元件，例如透镜、反射镜、波片和非线性晶体，所有这些都可以用于产生具有选定特性的光。通常，EMR源102包括被配置为提供具有期望的光谱、空间、以及在一些实施方式中的具有时间特性的光的光学元件和装置。
0001例如，调节光学器件104可以光谱过滤光以提供在光谱的选定波长区域中的输出光。可替代的或另外，调节光学器件可以调节光的空间分布和光的时间特性。入射电磁辐射或入射光通过EMR上的调节光学器件104的元件的作用而产生。
引导入射光以便入射到安装在照明台106上的样本108上。台106可以提供用于固定样本108的装置，例如安装夹或其他紧固装置。或者，台106可以包括其上固定有多个样本108的可移动轨道或带。可以将驱动器机构配置为移动轨道以便一次一个地使多个样本平移通过台106上的照明区域，其中入射光照射在样本上。台106可以进一步包括用于相对于照明台106的固定位置平移样本108的平移轴线和机构。平移机构可以手动操作(例如，螺纹杆)或可以通过电致动(electrical actuation)(例如，机动驱动器、压电致动器)自动移动。
响应于入射的电磁辐射，例如可见光，发射的电磁辐射从样本108出现。发射的光可以通过多种方式产生。例如，在一些实施方式中，发射的光对应于透过样本108的入射光的一部分。在其他实施方式中，发射光对应于一部分从样本反射的入射光。在又一些实施方式中，入射光可以被样本108吸收，并且发射的光对应于来自样本108的响应于入射光的荧光发射。在又一些实施方式中，样本108可以是发光的，并且即使在没有入射光的情况下也可以产生发射的光。在一些实施方式中，发射的光可以包括经由两个或更多个前述机制产生的光。
将会聚光学器件110定位成从样本108接收发射的电磁辐射，例如发射的光。例如，可以将会聚光学器件110配置为当光发散时使发射的光准直。也可以将会聚光学器件110配置成对发射的光进行光谱滤波。例如，滤波操作可能是有用的，以便将通过前述机制之一产生的部分发射光与经由其他处理产生的光隔离。此外，在实施方式中，可以将会聚光学器件110配置为修改用于特定目的的发射光的空间和/或时间特性。光会聚光学器件110将发射的光转换为入射到检测器112上的输出光。
调节光学器件104和会聚光学器件110可以包括各种光学元件，用于操纵入射到感兴趣样本上和从感兴趣样本发射的光的属性。例如，调节光学器件104和会聚光学器件110可各自包括用于从入射光和发射光中选择特定波段的滤光器元件。滤光器元件可以包括例如安装在滤光器上的干涉滤光器。在一些实施方式中，可以使用基于液晶掩膜的可调滤光器元件来改变入射光或发射光的光谱特性。基于液晶的装置可以通过通信接口152由控制器150控制。
调节光学器件104和会聚光学器件110还可以包括诸如空间光掩膜，空间光调制器和光学脉冲成形器的元件，以便操纵入射到样本上或从样本发射的光的空间分布。空间光调制器和其他自适应装置也可以由控制器150经由通信接口152进行控制。
最后，调节光学器件104和会聚光学器件110可以包括其他常见的光学元件，例如反射镜、透镜、分束器、波片等，将其配置为赋予入射光或发射光选定的特性。
0002在实施方式中，可以将检测器112配置为测量光的空间和/或时间和/或光谱特性。检测器112可以包括诸如CCD阵列和光电倍增管的装置以及它们各自的控制系统，用于采集图像。检测器112产生对应于输出光的电信号，并与控制器150进行通讯。检测器112中的自适应光学装置通常可以由控制器150经由通信接口152来控制。
控制器150包括通信接口152和处理电路156。除了接收对应于由检测器112检测到的输出光的信号之外，控制器150还通过通信接口152向检测器112发送电信号以调节检测器112的各种性质。例如，如果检测器112包括CCD传感器，则控制器150可以将电信号发送到检测器112以控制CCD传感器的曝光时间、有效区域、增益设置和其他属性。
控制器150还经由通信接口152与EMR源102、调节光学器件104、台106和会聚光学器件110通信。控制系统114向系统100的这些元件中的每一个提供电信号以调整元件的各种属性。例如，提供给光源102的电信号可以用于调整光122的强度、波长、重复频率或其他性质。将由EMR源102产生的光脉冲化(即，时间门控)时，可以根据经由通信接口152从控制器150提供给EMR源102的控制信号来操纵光脉冲的各种属性。例如，提供给光调节光学器件104和光会聚光学器件110的信号可以包括下述信号，所述信号用于配置调节光的空间特性的器件(例如，空间光调制器)的性质，和用于配置光谱滤波装置的信号。例如，提供给照明台106的信号可以提供样本108相对于台106的定位和/或用于将样本移动到台106上的照明位置。
通信接口152可以包括用于与各种系统、装置或网络进行数据通信的有线或无线接口(例如，插孔、天线、发射器、接收器、收发器、导线端子等)。例如，通信接口152可以包括以太网卡和端口(用于经由基于以太网的通信网络发送和接收数据)，和/或WiFi收发器(用于经由无线通信网络进行通信)。可以将通信接口152配置为经由局域网或广域网(例如因特网、建筑WAN等)进行通信并且可以使用各种通信协议(例如，BACnet、IP、LON等)。
控制器150还可以经由通信接口152与用户界面154进行通信。用户界面154可以是用于显示系统属性和参数以及用于显示样本108的捕获图像的显示装置。提供用户界面154以便于操作员与成像装置100交互，并且控制成像装置100。处理电路156包括用于存储使用检测器112捕获的图像数据的存储装置，例如存储器160，并且还包括体现对处理器158的指令的计算机软件，指令使得处理器158执行控制功能，例如上面和下面进一步讨论的那些控制功能。此外，软件指令使处理器158在数学上操纵由检测器112捕获的图像。在本文中更详细地描述图像的处理和计算，其由成像装置100的处理器116或与成像装置100相关联的外部计算系统(诸如图2中所描绘的控制器200)执行，并在下面描述。
在许多实施方式中，将系统100配置为获取样本108的多个光谱图像。多个光谱图像可对应于样本108在多种选定波长的光下的照明，并且检测透射通过样本108或被样本108反射的光的强度。或者，多个光谱图像可对应于用具有相似光谱特性的光对样本108的照射，并且收集样本108的多个图像，每个图像对应于发射光的不同波长。调节光学器件104和会聚光学器件110中的光谱滤波元件通常用于获得光谱解析数据。
在一些实施方式中，可以顺序收集样本108的图像，同时调整连续捕获的图像之间的光学部件(例如光学滤波器)的配置。在其他实施方式中，可以使用配置成检测多个样本视图的检测系统同时捕获多个图像。例如，可以将检测系统配置成将对应于不同照明或发射波长的样本的不同视图投影到诸如CCD照相机的检测器上，并且可以同时捕获多个视图。
在一些实施方式中，调节光学器件104包括可调滤光器元件，例如滤光轮或液晶光谱滤波器。可以将滤光器元件配置为使用不同的光波段提供样本108的照明。EMR源102可以提供具有光谱波长分量宽分布的光。允许该宽波长分布的选定区域作为入射光通过调节光学器件104中的滤光元件，并且被引导入射到样本108上。检测器112记录透过样本108的光的图像。随后，改变调节光学器件104中的滤波器通带的波长以提供具有不同波长的入射光，并且记录透过样本108(并且对应于入射光的新波长)的光的图像。还可以通过采用具有产生不同波长的光的多个源元件的EMR源102以及交替地打开和关闭不同的源元件以提供具有不同波长的入射光来记录类似的一组光谱解析图像。
如之前所讨论的，来自样本108的发射光也可以对应于从样本108反射的入射光。此外，如果样本包括荧光化学结构，则发射的光可以对应于来自样本108的荧光发射。对于一些样本，发射的光可以包括来自多个源的贡献(即，透射和荧光)，并且光调节光学器件110中的光谱滤波元件可以用于分离这些信号贡献。
通常，调节光学器件104和会聚光学器件110都包括可配置的滤光器元件。因此，可以在样本108的激发侧(例如经由调节光学器件104)或在样本108的发射侧(例如经由会聚光学器件110)或在两侧提供光谱解析。在任何情况下，收集样本108的多个光谱解析图像的结果是“图像堆叠”，其中堆叠中的每个图像是对应于特定波长的样本的二维图像。从概念上讲，可以将这组图像可视化为形成三维矩阵，其中两个矩阵维度是每个图像的空间长度和宽度，并且第三矩阵维度是图像对应的光谱波长(发射或激发)。由于这个原因，光谱解析图像组可以被称为图像的“光谱立方体”。如这里所使用的，这样的一组图像(或图像堆栈或光谱立方体)中的“像素”是指每个图像的公共空间位置。因此，一组图像中的像素包括与对应于该像素的空间位置处的每个图像相关联的值。
根据手头样本的需求，可以采用本领域已知的获得光谱图像的其他配置。
尽管上面描述的每个光谱图像通常是指特定波长或波长范围(例如，光谱带)，但是更一般地，每个光谱图像可以对应于可以包括一个或多个波段或一些更复杂的光谱分布的光谱指数。例如，可以通过使用梳状滤光器来生成这样的图像。通常，图像立方体将包含多个光谱图像，例如10个或更多。然而，在一些实施方式中，图像立方体可以包括更少的图像，例如仅有两个或三个光谱图像。一个这样的例子是红-绿-蓝(RGB)彩色图像，其中每个像素包括与红色、绿色和蓝色中的每一个的强度相关联的值。可以将这样的信息显示为单个彩色图像，而不是一组单独的图像；然而，信息内容与该组图像中的信息内容相同，因此我们使用表述“光谱图像”来表示这两种情况。
在此描述的成像装置100可以包括多种光学元件和装置，用于捕获图像并且生成在后续样本分析算法中使用的样本的图像数据130，诸如用于对包含从癌症患者获取的肿瘤组织的样本进行评分的方法和算法。这样的成像装置在标题为“分类图像特征”的美国专利7,555,150中有所描述，其全部内容通过引用并入本文。
在将样本成像之前，可以使用多个对特定生物标志物具有亲和力的荧光标签对组织样本进行染色。可以获得染色样本的数字图像，并且基于荧光标签的位置进一步分析图像。成像装置100的处理电路156可以包括用于使控制器150执行视场选择的软件，而不是全图像分析。其中，基于表达感兴趣的第一生物标志物的细胞的数量，可以优先考虑视场。然后可以针对荧光信号进一步分析预定数量的视场。在一些实施方式中，使用四种不同类型的荧光标签产生对应于感兴趣的第一生物标志物的荧光信号的图像和对应于感兴趣的第二生物标志物的荧光信号的图像，以及对应于由全部细胞表达的生物标志物的荧光信号的图像和对应于由肿瘤细胞表达的生物标志物的荧光信号的图像。
可以由控制器200执行来自成像装置100的图像数据的操纵，用于如本文所述的对组织样本评分，如图2所示。示出了控制器200包括通信接口202和处理电路204。将处理电路204配置为实施用于对组织样本进行评分的步骤。可以想到的是，控制器200的元件和功能可以包括在成像装置100的控制器150中，或者可以存在于与成像装置100分开的计算系统中。
在一些实施方式中，操纵荧光信号的图像以产生与图像内的细胞相对应的荧光信号的一个或多个掩膜。在一些实施方式中，荧光信号的一个或多个掩膜包括选自下组的一个或多个，所述组由在图像内所有细胞的掩膜、图像内的所有肿瘤细胞的掩膜、图像内所有非肿瘤细胞的掩膜、图像内表达感兴趣的第一生物标志物的所有细胞的掩膜、图像内表达感兴趣的第二生物标志物的所有细胞的掩膜，和代表图像内表达感兴趣的第一生物标志物的所有细胞以及位于近端的表达感兴趣的第二生物标志物的细胞的交互掩膜组成。在更进一步的实施方式中，使用交互掩膜来产生下述细胞的交互隔室，所述细胞来自表达感兴趣的第二生物标志物的所有选定视场，位于表达第一感兴趣生物标志物的细胞的近端。交互隔室的总面积可以用于生成表示至少一对细胞之间的空间接近度的得分，所述至少一对细胞的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物。在一些实施方式中，得分表明癌症患者将对免疫疗法有积极响应的可能性。在一些实施方式中，与定量感兴趣的第一生物标志物的表达或定量感兴趣的第二生物标志物的表达相比，该系统提供优越的预测能力。
图3是描绘一个实施方式中的用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的方法的步骤的流程图。在步骤301中，获得图像数据，例如图像数据130。图像数据可以通过诸如成像装置100的成像装置获得。在步骤302中，图像数据被解混，使得特定于各种类型的荧光信号的数据被分成不同的通道。在步骤303中，使用来自第一通道的数据来生成对于第一生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第一生物标志物掩膜)。然后扩张所有细胞的掩膜(步骤304)以产生代表预定接近度的扩张掩膜，在预定接近度内可以找到相互作用的细胞(对于第二生物标志物呈阳性)。在一些实施方式中，第一生物标志物掩膜在1和100个像素之间扩张。在步骤305中，使用来自第二通道的数据来生成对于第二生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第二生物标志物掩膜)。在步骤306中，组合第一生物标志物掩膜和第二生物标志物掩膜以产生交互掩膜，所述交互掩膜识别对第二生物标志物呈阳性的在对第一生物标志物阳性的细胞的预定接近度范围内的细胞。在步骤307中，基于交互掩膜的面积来计算空间接近度得分。
图4是描绘第二实施方式中用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的方法的步骤的第二流程图。在步骤401中，获得图像数据，并且在步骤402中，图像数据被解混合，使得特定于各种类型的荧光信号的数据被分离成不同的通道。在步骤403中，使用来自第一通道的数据生成视场中的所有细胞的掩膜，并且在步骤404中，使用来自第二通道的数据生成亚群区域(诸如视场中的肿瘤区域)的掩膜。在步骤405中，将所有细胞的掩膜与亚群区域掩膜组合以生成亚群细胞的掩膜和非亚群细胞的掩膜。在一些实施方式中，亚群细胞是肿瘤细胞，非亚群细胞是非肿瘤细胞。在步骤406中，使用来自第三通道的数据来生成对于第一生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第一生物标志物掩膜)。然后扩张所有阳性细胞的掩膜(步骤407)以产生表示预定接近度的扩张掩膜，在该预定接近度内可以找到相互作用的细胞(即，对于第二生物标志物为阳性的细胞)。在一些实施方式中，第一生物标志物掩膜在1和100个像素之间扩张。在步骤408中，使用来自第四通道的数据来生成对于第二生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第二生物标志物掩膜)。在步骤409中，组合扩张的第一生物标志物掩膜和第二生物标志物掩膜以产生识别下述细胞的交互掩膜，所述细胞对第二生物标志物呈阳性并在第一生物标志物阳性的细胞的预定接近度内。在步骤410中，通过将交互掩膜的面积除以所有亚群细胞的面积或所有细胞的面积(如由图15的流程图中的虚线所示，表示使用任一输入)来计算空间接近度得分。在一些实施方式中，亚群细胞是能够对第二生物标志物呈阳性的细胞。在一些实施方式中，能够对第二生物标志物呈阳性的细胞是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。
在一些实施方式中，亚群细胞和非亚群细胞分别对应于肿瘤细胞和非肿瘤细胞，反之亦然。在一些实施方式中，亚群细胞和非亚群细胞分别对应于活细胞和非活细胞，反之亦然。在一些实施方式中，亚群细胞是活细胞的亚群，而非亚群细胞由不包含在活细胞亚群中的活细胞组成。在一些实施方式中，亚群细胞和非亚群细胞分别对应于T细胞和非T细胞，反之亦然。在一些实施方式中，亚群细胞和非亚群细胞分别对应于骨髓细胞和非骨髓细胞，反之亦然。
在一些实施方式中，空间接近度得分表示一对细胞的接近程度。在一些实施方式中，可以使用基于围绕该细胞对的所选第一细胞的周界的边界逻辑，确定该细胞对的边界中的交集，通过细胞对的边界之间的接近度，细胞对的质量中心之间的接近度，和/或通过确定该细胞对的重叠区域，来确定该细胞对的接近度。
在一些实施方式中，空间接近度得分与包括在生成的报告中的与样本的图像相关联的元数据相关联，被提供给操作员以确定免疫疗法策略，记录在数据库中，与患者的医疗记录相关联，和/或显示在显示装置上。
在一些实施方式中，与定量感兴趣的第一生物标志物的表达或定量感兴趣的第二生物标志物的表达相比，该系统提供优越的预测能力。
在本文公开的方法中，根据示例性实施方式，数字图像的操纵可以由包括控制器(诸如图2的框图中所示的控制器)的计算系统来执行。示出了控制器200包括通信接口202和处理电路204。通信接口202可以包括用于与各种系统、装置或网络进行数据通信的有线或无线接口(例如，插孔、天线、发射器、接收器、收发器、导线端子等)。例如，通信接口202可以包括以太网卡和端口(用于经由基于以太网的通信网络发送和接收数据)，和/或WiFi收发器(用于经由无线通信网络进行通信)。可以将通信接口202配置为经由局域网或广域网(例如因特网、建筑WAN等)进行通信并且可以使用各种通信协议(例如，BACnet、IP、LON等)。
通信接口202可以是被配置为促进控制器200与各种外部系统或设备(例如，成像装置100)之间的电子数据通信的网络接口。例如，控制器200可以从成像装置100接收用于所选择的视场的成像数据，以分析数据并计算空间接近度得分(SPS)。
仍然参考图2，将处理电路204示出为包括处理器206和存储器208。处理器206可以是通用或专用处理器、专用集成电路(ASIC)、一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)、一组处理组件或其他合适的处理组件。可以将处理器506配置为执行存储在存储器508中或从其他计算机可读介质(例如，CDROM、网络存储器、远程服务器等)接收的计算机代码或指令。
存储器208可以包括用于存储用于完成和/或促进本公开中所描述的各种过程的数据和/或计算机代码的一个或多个装置(例如，存储器单元、存储器装置、存储装置等)。存储器208可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬盘驱动器存储器、临时存储器、非易失性存储器、闪存、光学存储器或用于存储软件对象和/或计算机指令的任何其他合适的存储器。存储器208可以包括数据库组件、目标代码组件、脚本组件、或用于支持本公开中描述的各种活动和信息结构的任何其他类型的信息结构。存储器508可以经由处理电路204可通信地连接到处理器206，并且可以包括用于执行(例如，通过处理器206)本公开描述的一个或多个处理的计算机代码。
仍然参考图2，将控制器200示出为接收来自成像装置100的输入。成像装置获取所有的成像数据，以及描述它的所有元数据，并将其记录下来。成像装置然后将数据串行化成可由控制器200读取的流。数据流可以适应任何二进制数据流类型，例如文件系统、RDBM或直接TCP/IP通信。为了使用数据流，将控制器200示出为包括光谱解混器210。光谱解混器210可以接收来自成像装置100的图像数据，在该装置上，其执行光谱解混以将呈现各种波长的图像解混成每个波段的单独的离散信道。例如，对于用于鉴定组织样本中感兴趣的细胞或蛋白质的各种荧光团中的每一种，可以将图像数据“解混”成单独的通道。仅举例来说，荧光团可以是由DAPI、2、3、3.5、5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料和德克萨斯红组成的组中的一个或多个。在一个实施方式中，通道之一可以包括落在围绕461nm的波长(DAPI的最大发射波长)的预定波段内的图像数据，以识别图像中的细胞核。其他通道可以包括不同波长的图像数据，以使用不同的荧光团来识别组织样本的不同部分。
还示出控制器200包括各种掩膜器，诸如细胞掩膜器212、亚群区域掩膜器216、第一生物标志物掩膜器22和第二生物标志物掩膜器224。在其他实施方式中，可包括在控制器200中的这些或其他掩膜器用于接收来自光谱解混器210的解混信号，并且根据用于识别组织样本中感兴趣的某些特征的荧光团，为特定细胞或感兴趣区域创建掩膜。为了创建掩膜，掩膜器(诸如细胞掩膜器212、亚群区域掩膜器216、第一生物标志物掩膜器22和第二生物标志物掩膜器224)接收与视场中的每个像素的强度相关的图像数据。像素强度与样本发射的荧光量成正比，而样本发射的荧光量与样本中蛋白质生物标志物的量成正比(当使用荧光团来鉴定特定生物标志物时)。可以基于图像像素中存在的值来设置绝对阈值。所有大于或等于阈值的像素将被映射为1.0或“开”，而所有其他像素将被映射为0.0或“关”。以这种方式，创建二元掩膜以识别视场中感兴趣的细胞或组织部分。在其他实施方式中，使用下限创建掩膜，其中接受具有处于或高于下限的强度的所有像素，并且将其用作掩膜的像素值。如果强度低于下限，则将像素值设置为0.0或“关”。
在图5所示的用于掩蔽的示例性流程图中，示出了用于识别细胞核和肿瘤区域的荧光信号的通道(例如分别为DAPI和染料488通道)使用下限协议(步骤510、512、520、522)，而用于识别生物标志物的通道(诸如Cy5和Cy3.5通道)使用阈值协议(步骤530、540)，以提供掩膜输出。与下限协议相关联，还有一个直方图步骤来确定下限。具体而言，直方图阈值(步骤512、522)产生输入图像的阈值，但使用滑动比例来确定阈值出现的点。输入是当前图像和用户定义的阈值百分比。后者用于确定总强度在何种百分比下，应设置阈值级别。首先，将每个像素的强度加和成总强度。阈值百分比乘以该总强度以获得截止总和。最后，所有像素按照强度分组(在直方图中)，将它们的强度从最低到最高(按箱)相加，直到达到截止总和。该过程中访问的最后一个最高像素强度是当前图像的阈值。所有强度大于该值的像素都将其强度设置为最大，而其他所有像素都设置为最小。
被标识为图5中的步骤514、516、524、526、528、532、534、536、542、544的步骤表示在初始掩膜器中发生的中间步骤，例如细胞掩膜器212、亚群区域掩膜器216、第一生物标志物掩膜器222和第二生物标志物掩膜器224。将这些步骤定义如下：
扩张增加了图像中最亮区域的区域。扩张需要两个输入。第一个是隐含的当前图像，第二是扩张的迭代次数。假定只有二进制图像用于第一个输入。该程序将对连续图像进行操作，但输出不会是有效的扩张。扩张过程首先要找到图像中的最大像素强度。随后，图像中的每个像素都被检查一次。如果调查中的像素的强度等于最大强度，则该像素将在输出图像中以原始像素为中心以迭代(iterations)为半径绘制为圆形。该圆圈中的所有像素的强度都等于最大强度。所有其他像素都将被复制到输出图像中而不进行修改。
填充孔过程将用最大强度的像素填充图像的“空白”区域。这些空白区域是那些具有最小强度并且其像素区域(大小)是由用户指定的区域。当前图像和大小是所需的两个输入。像扩张这个程序只适用于二进制图像。
腐蚀过程以与扩张相同的方式处理图像。除了确定图像中的最小强度的第一步骤之外，所有功能与扩张相同，只有与最低强度相匹配的像素被更改，并且用于放大找到的最小强度像素的圆圈充满最低强度值。像扩张这个程序只适用于二进制图像。
移除对象。预计有两个输入：当前图像和对象大小。移除对象与填充孔过程相反。任何仅包含填充小于输入对象大小的区域的最大强度的像素的区域将被设置为最小强度并因此被“移除”。该程序只适用于二进制图像；应用于连续图像可能产生意想不到的结果。
最终步骤518、529、538和546处的输出分别是得到的细胞掩膜、亚群区域掩膜(或者，在该特定示例中，肿瘤区域掩膜)、生物标志物1细胞掩膜和生物标志物2细胞掩膜。图5进一步描绘了这些合成掩膜的组合以计算空间接近度得分。下面参考图2中描绘的控制器200的组合掩膜器来描述这些组合。
示出控制器200包括组合掩膜器，诸如亚群细胞掩膜器218，非亚群细胞掩膜器220和交互掩膜器230。如图5中的步骤552所示，亚群细胞掩膜器执行And操作以将细胞掩膜器212的输出(代表图像中的所有细胞)与亚群区域掩膜器216的输出进行组合。因此，亚群细胞掩膜器生成图像中所有亚群细胞的掩膜器。在一些实施方式中，亚群细胞是肿瘤细胞。如图5的步骤554所示，使用由非亚群细胞掩膜器220执行的输出操作的该相同组合生成样本图像中的所有非亚群细胞的掩膜。在一些实施方式中，非亚群细胞是非肿瘤细胞。
在与另一个掩膜组合之前，第一生物标志物掩膜(来自第一生物标志物掩膜器222)由扩张器226扩张。扩张掩膜代表围绕那些表达第一生物标志物的细胞的区域，以便识别下述空间，所述空间中表达第二生物标志物的细胞将处于适当接近度以与表达第一生物标志物的细胞相互作用。这由图5的步骤556和558表示。图5的流程图示出了扩张发生在两个步骤556和558中。当每个步骤中的最大迭代次数有限时，这可能是必需的。例如，可能最多有10次迭代(对应于10个像素的增加)，所以当需要增加20个像素时，扩张必须分成两个后续步骤。
在第二生物标记物掩膜器224内，如图5的步骤560所示，可以使用And操作将生物标志物掩膜与上述非亚群细胞掩膜组合，以生成对第一生物标志物呈阳性的所有非亚群细胞的掩膜。然后将该掩膜在交互掩膜器230处与来自扩张器226的扩张掩膜进行组合(步骤562)以生成交互掩膜。交互掩膜识别对第二生物标志物呈阳性并且也在交互面积内或与扩张掩膜重叠的非肿瘤细胞。然后，这些识别的细胞代表可以与对第一生物标志物呈阳性的细胞相互作用的细胞，从而导致更大的治疗响应。
为了计算空间接近度得分(SPS)，在面积评估器232处以像素确定交互掩膜的面积。在一些实施方式中，在面积评估器234处以像素确定能够表达第二生物标志物的所有细胞的面积。能够表达第二生物标志物的细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。在一些实施方式中，在面积评估器234处以像素确定视场中所有细胞的面积。在交互计算器236处通过将来自面积评估器232的面积除以来自面积评估器234的面积并乘以预定因子来确定交互作用或空间接近度得分。如上所述，在一个实施方式中，由交互计算器236执行的等式是：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被归属于表达第一特异性生物标志物的细胞器的扩张荧光信号所涵盖)，AC是归一化因子。这里，标准化是具有表达第二特异性生物标志物能力的细胞的总面积。在一些实施方式中，归一化因子是所有肿瘤或非肿瘤细胞的总面积。在一些实施方式中，归一化因子是所有细胞的总面积。
And程序是在二进制AND操作之后建模的，但在重要方面有所不同。AND接受当前图像和用户选择的结果。输出是通过执行来自两个输入图像的匹配像素的归一化强度的相乘而产生的图像。在某些应用中，图像强度数据已经标准化。因此，And程序只是两个图像的像素方面的乘法。Out所需的两个输入是当前图像和用户选择的结果。根据公式A*(1-B/Bmax)，Out从第一图像中去除第二图像，其中A是当前图像，B是用户选择的图像以去除，Bmax是B的最大强度。注意，由Bmax除B归一化B。
在一些实施方式中，本文提供了用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的成像系统，该成像系统包括成像装置以及控制器，成像装置包括用于将样本定位在成像场中的台，用于在样本处引导电磁辐射的电磁辐射源，以及配置成检测来自样本的电磁辐射的检测器。控制器包括用于在操作员和电子控制系统之间交换信息的用户界面和被配置为执行存储在计算机可读介质上的指令的处理电路。这些指令使得成像系统的电子控制系统：(i)从成像装置接收与检测到的电磁辐射有关的信息；(ii)基于检测到的电磁辐射生成图像数据；(iii)分析图像数据以确定代表至少一对细胞之间的接近程度的得分，该至少一对细胞的第一成员表达第一生物标志物，该至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；和(iv)记录得分，当与阈值比较时，该得分表示癌症患者将对免疫疗法积极响应的可能性。
在一些实施方式中，得分代表至少一对细胞之间的接近程度，该接近程度表示该细胞对彼此在预定接近度内的程度。
在一些实施方式中，该至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞，而该至少一对细胞的第二成员包含非肿瘤细胞。在一些实施方式中，非肿瘤细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，非肿瘤细胞是基质细胞。
在一些实施方式中，至少一对细胞的第一和第二成员包含免疫细胞。
在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，而至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施方式中，肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞表达PD-L1，而免疫细胞表达PD-1。
在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞，而至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员包含骨髓细胞，而至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员包含基质细胞，而至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1，免疫细胞表达PD-1。
在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR，半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合组成的组的第一生物标志物。在一些实施方式中，至少一对细胞的第二成员表达选自PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合组成的组的第二生物标志物。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合组成的组的第一生物标志物，至少一对细胞的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合组成的组的第二生物标志物。
在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1，至少一对细胞中的第二成员表达PD-1。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1，至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4，至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L2，至少一对细胞中的第二成员表达PD-1。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4，至少一对细胞中的第二成员表达CD86。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达LAG-3，至少一对细胞中的第二成员表达HLA-DR。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员表达TIM-3，至少一对细胞的第二成员表达半乳糖凝集素9。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员表达41BB，至少一对细胞的第二成员表达4.1BBL。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员表达OX40，至少一对细胞的第二成员表达OX40L。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员表达CD40，至少一对细胞的第二成员表达CD40L。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一个成员表达ICOS，至少一对细胞的第二成员表达ICOSL。在一些实施方式中，至少一对细胞的第一成员表达GITR，至少一对细胞的第二成员表达GITRL。在一些实施方式中，至少一对细胞中的第一成员表达HLA-DR，至少一对细胞中的第二成员表达TCR。
在一些实施方式中，由至少一对细胞的第一成员表达的第一生物标志物和由至少一对细胞的第二成员表达的第二生物标志物彼此相互作用。在一些实施方式中，由至少一对细胞的第一成员表达的第一生物标志物和由至少一对细胞的第二成员表达的第二生物标志物彼此不相互作用。
在一些实施方式中，至少一对细胞之间的空间接近度在约0.5μm至约50μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约50μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约45μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约40μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约35μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约30μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约25μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约20μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在2.5μm至约15μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约50μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约45μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约40μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约35μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约30μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约25μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约20μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在5μm至约15μm的范围内。在一些实施方式中，空间接近度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50μm。
在一些实施方式中，至少一对细胞之间的空间接近度从约1个像素到约100个像素。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约100像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约90像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约80像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约70像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约60像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约50像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约40像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约5像素至约30像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约100像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约90像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约80像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约70像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约60像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约50像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约40像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约10像素至约30像素的范围内。在一些实施方式中，空间接近度在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100像素。在一些实施方式中，像素宽度为0.5μm。
在一些实施方式中，生成图像数据包括(i)将与检测到的电磁辐射有关的信息分离成解混的图像数据；(ii)通过多个数据通道提供数据，其中第一数据通道中的解混图像数据描述可归属于第一生物标志物的荧光信号，第二数据通道中的解混图像数据描述可归属于第二生物标志物的荧光信号。
在一些实施方式中，分析数据包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩张到足以涵盖位于近侧的表达第二生物标志物的细胞；和(iii)将来自每个选定视场的所有细胞的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张荧光信号内。
在一些实施方式中，分析数据包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜内约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；和(iii)将来自每个选定视场的所有细胞的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张荧光信号内。
在一些实施方式中，分析数据包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩张约1个像素至约100个像素的范围，以涵盖表达第二生物标志物的位于近端的细胞；和(iii)将以像素为单位测量的来自每个选定视场的所有细胞的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得到空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张荧光信号内。
在一些实施方式中，分析数据包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩张约1个像素至约100个像素的余量范围，以涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；和(iii)将以像素为单位测量的来自每个选定视场的所有细胞的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张荧光信号内。
在一些实施方式中，空间接近度得分由以下等式确定：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一特异性生物标志物的细胞的扩张荧光信号内)，AC是具有表达第二特异性生物标志物的能力的细胞的总面积(归一化因子)。
在一些实施方式中，空间接近度得分(SPS)由以下等式确定：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一特异性生物标志物的细胞的扩张荧光信号内)，并且ANT是非肿瘤细胞的总面积。
在一些实施方式中，空间接近度得分由以下等式确定：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一特异性生物标志物的细胞的扩张荧光信号内)，AT是所有细胞的总面积。
在一些实施方式中，在确定步骤中使用四种荧光标签，每种荧光标签特定于不同生物标志物。在进一步的实施方式中，第一荧光标签与第一生物标志物相关联，第二荧光标签与第二生物标志物相关联，第三荧光标签与第三生物标志物相关联，并且第四荧光标签与第四生物标志物相关联。在一些实施方式中，第一生物标志物包含肿瘤和非肿瘤标志物。在一些实施方式中，第二生物标志物包含非肿瘤标志物。在一些实施方式中，第一生物标志物包含肿瘤和非肿瘤标志物，第二生物标志物包含非肿瘤标志物。在一些实施方式中，第三生物标志物由全部细胞表达。在一些实施方式中，第四生物标志物仅在肿瘤细胞中表达。在一些实施方式中，第三生物标志物由全部细胞表达，第四生物标志物仅在肿瘤细胞中表达。在一些实施方式中，一个或多个荧光标签包含缀合至对特异性生物标志物或另一种抗体具有结合亲和力的抗体的荧光团。在一些实施方式中，一个或多个荧光标签是对特异性生物标志物具有亲和力的荧光团。
荧光团的例子包括但不限于荧光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、加利福尼亚红、iFluor594、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6F、羧基罗多明、羧基罗丹明110、级联蓝、级联黄、香豆素， Cy-铬，350，405、488、549、594、633、649、680、750、800、藻红蛋白、PerCP(多甲藻素-叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)、NED，ROX(5-(和6-)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄(LuciferYellow)、海洋蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、50、Fluor430、Fluor488、Fluor532、Fluor546、Fluor568、Fluor594、Fluor633、Fluor647、Fluor660、680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、FL、FL-Br2、530/550、558/568、630/650、650/665、R6G、TMR、TR、OPALTM520、OPALTM540、OPALTM570、OPALTM620、OPALTM650、OPALTM690、及其组合。在一些实施方式中，荧光团选自DAPI、3.5、5、7、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、德克萨斯红和香豆素。488染料的示例包括但不限于Alexa488、488和CFTM488A。555染料的示例包括但不限于Alexa555。594染料的示例包括但不限于Alexa594。
如本文所使用的，“视场”是指组织样本的整个载玻片数字图像的一部分。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有2-200个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有10-200个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有30-200个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有10-150个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有10-100个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有10-50个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有10-40个预定视场。在一些实施方式中，整个载玻片图像具有包括增量的10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个预定视场。
在一些实施方式中，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩张约1至约100个像素的余量。在一些实施方式中，余量是从约5至约100个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约90个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约80个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约70个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约60个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约50个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约40个像素。在一些实施方式中，余量是从约5至约30个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约100个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约90个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约80个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约70个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约60个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约50个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约40个像素。在一些实施方式中，余量是从约10至约30个像素。在一些实施方式中，余量是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100像素。在一些实施方式中，像素宽度为0.5μm。
在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜内约0.5μm至约50μm内表达第二生物标志物的近端定位的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约50μm内表达第二生物标志物的近端定位的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约45μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜内约2.5μm至约40μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约35μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约30μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约25μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约20μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约15μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约50μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约45μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜内约5μm至约40μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约35μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约30μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约25μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约20μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约15μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，扩张可归属于第一生物标志物的荧光信号涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方式中，位于近侧的细胞上的第二生物标志物与第一生物标志物直接接触。
在一些实施方式中，来自表达第二生物标志物的每个选定视场的所有细胞的第一总面积以像素为单位测量。
在一些实施方式中，归一化因子是来自每个选定视场的所有非肿瘤细胞的第二总面积。在一些实施方式中，以像素为单位测量第二总面积。在一些实施方式中，以像素为单位测量第一总面积和第二总面积。
在一些实施方式中，归一化因子是来自每个选定视场的所有细胞的第二总面积，其中该所有细胞具有表达第二生物标志物的能力。在一些实施方式中，以像素为单位测量第二总面积。在一些实施方式中，以像素为单位测量第一总面积和第二总面积。
在一些实施方式中，归一化因子是来自每个所选视场的所有细胞的第二总面积。在一些实施方式中，以像素为单位测量第二总面积。在一些实施方式中，以像素为单位测量第一总面积和第二总面积。
在一些实施方式中，阈值得分是大约500至大约5000。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约4500。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约4000。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约3500。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约3000。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约2500。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约2000。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约1500。在一些实施方式中，阈值得分为约500至约1000。在一些实施方式中，阈值得分为包括其中增量的约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、或5000。在一些实施方式中，阈值得分为包括其中增量的、±100的约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、或5000。
在一些实施方式中，预定因子是从约10到约105。在一些实施方式中，预定因子是从约102到约105。在一些实施方式中，预定因子是从约103到约105。在一些实施方式中，预定因子是从约104到约105。在一些实施方式中，预定因子是包括增量的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、或105。
在一些实施方式中，将预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。通过将对阈值得分以上的得分的治疗响应的患者的数量除以对响应治疗的患者总数来计算阳性预测值。通过将对阈值以下的得分的治疗无响应的患者的数量除以对治疗无效应的患者的总数量来计算阴性预测值。
在一些实施方式中，阳性预测值大于60％。在一些实施方式中，阳性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是70％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是75％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是80％或更高。在一些实施方式中，阳性预测值是包括其增值的约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％。
在一些实施方式中，阴性预测值是60％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是65％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是70％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是75％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是80％或更高。在一些实施方式中，阴性预测值是包括其增值的约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％。
在本文所公开的方法中，癌症患者是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，哺乳动物不是人。在又一些实施方式中，哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫或马。
在本文的方法中，肿瘤组织取自癌症患者。癌症的种类包括但不限于：循环系统的癌症，例如心脏癌症(恶性肿瘤[血管肉瘤，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，脂肪肉瘤]，粘液瘤，横纹肌瘤，纤维瘤，脂肪瘤和畸胎瘤)，胸腔纵横膜和胸膜癌症，和其他胸内器官癌症，血管肿瘤和肿瘤相关的血管组织；呼吸道癌症，例如鼻腔和中耳，副鼻窦，喉，气管，支气管癌症，和肺癌如小细胞肺癌(SCLC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，支气管癌(鳞状细胞，未分化的小细胞，未分化的大细胞，腺癌)，肺泡(细支气管)癌，支气管腺瘤，肉瘤，淋巴瘤，软骨瘤性错构瘤，间皮瘤；消化系统癌症，例如食道癌(鳞状细胞癌，腺癌，平滑肌肉瘤，淋巴瘤)，胃部癌症(癌，淋巴瘤，平滑肌肉瘤)，胃癌，胰腺肿瘤(导管腺癌，胰岛瘤，胰高血糖素瘤，胃泌素瘤，类癌瘤，舒血管肠肽瘤)，小肠癌症(腺癌，淋巴瘤，类癌瘤，卡波西肉瘤，平滑肌瘤，血管瘤，脂肪瘤，神经纤维瘤，纤维瘤)，大肠癌症(腺癌，管状腺瘤，绒毛状腺瘤，错构瘤，平滑肌瘤)；泌尿生殖道癌症，例如肾脏肿瘤(腺癌，肾母细胞瘤[肾胚细胞瘤]，淋巴瘤，白血病)，膀胱和/或尿道肿瘤(鳞状细胞癌，移行细胞癌，腺癌)，前列腺癌症(腺癌，肉瘤)，睾丸癌症(精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎性癌，畸胎瘤，绒毛膜癌，肉瘤，间质细胞癌，纤维瘤，纤维腺瘤，腺瘤样瘤，脂肪瘤)；肝脏癌症，例如，肝细胞癌(肝细胞性肝癌)，胆管癌，肝母细胞瘤，血管肉瘤，肝细胞腺瘤，血管瘤，胰腺内分泌癌症(如嗜铬细胞瘤，胰岛瘤，血管活性肠肽肿瘤，胰岛细胞瘤和胰高血糖素瘤)；骨癌症，例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，软骨肉瘤，尤因氏肉瘤，恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)，多发性骨髓瘤，恶性巨细胞瘤脊索瘤，骨间皮瘤(骨软骨性外生骨疣)，良性软骨瘤，成软骨细胞瘤，软骨黏液样纤维瘤，骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统癌症，例如，中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，颅骨癌(骨瘤，血管瘤，肉芽肿瘤，黄色瘤，畸形性骨炎)，脑膜肿瘤(脑膜瘤，脑膜肉瘤，脑胶质瘤)，脑癌(星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经胶质瘤，室管膜瘤，生殖细胞瘤[松果体瘤]，多形性胶质母细胞瘤，少突神经胶质瘤，神经鞘瘤，成视网膜细胞瘤，先天性肿瘤)，脊髓神经纤维瘤，脑膜瘤，神经胶质瘤，肉瘤；生殖系统癌症，例如妇科肿瘤，子宫肿瘤(子宫内膜癌)，子宫颈肿瘤(宫颈癌，肿瘤前宫颈发育异常)，卵巢肿瘤(卵巢癌[浆液性囊腺癌，粘液性囊腺癌，未分类癌]，颗粒细胞瘤，Sertoli-Leydig细胞瘤，无性细胞瘤，恶性畸胎瘤)，外阴肿瘤(鳞状细胞癌，上皮内癌，腺癌，纤维肉瘤，黑素瘤)，阴道肿瘤(透明细胞癌，鳞状细胞癌，葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)，输卵管(癌)和其他与女性生殖器官相关的部位的癌症；胎盘，阴茎，前列腺，睾丸和其他与男性生殖器官相关的部位的癌症；血液系统癌症，例如血液肿瘤(骨髓性白血病[急性和慢性]，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞性白血病，骨髓增生性疾病，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征)，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；口腔癌症，例如嘴唇，舌头，牙龈，口底，上颚和口腔的其他部位，腮腺和其他部位的唾液腺，扁桃体，口咽部，鼻咽部，梨状窦，下咽部和唇的其他部位，口腔和咽部的癌症；皮肤癌症，例如恶性黑色素瘤，皮肤黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，卡波济氏肉瘤，胎块发育不良性痣，脂肪瘤，血管瘤，皮肤纤维瘤和瘢痕瘤；肾上腺癌症：成神经细胞瘤；其他组织癌症包括结缔组织和软组织癌症，腹膜后腔和腹膜癌症，眼部癌症，眼内黑色素瘤和附件癌症，乳房癌症，头部癌症或颈部癌症，肛门区域癌症，甲状腺癌症，甲状旁腺癌症，肾上腺癌症和其他内分泌腺及相关结构的癌症，继发性和非特异性淋巴结恶性肿瘤，呼吸系统和消化系统的继发性恶性肿瘤以及其他部位的继发性恶性肿瘤，或其一种或多种的组合。
免疫疗法的示例包括但不限于单克隆抗体(例如阿仑单抗或曲妥珠单抗)，缀合的单克隆抗体(例如阿伦单抗(alemtuzumab)、本妥昔单抗(brentuximabvendotin)或曲妥珠单抗(ado-trastuzumabemtansine)，双特异性单克隆抗体(博纳吐单抗(blinatumomab))，免疫检查点抑制剂(例如ipilimumab，pembrolizumab，nivolumab，atezolizumab或durvalumab)，沙利度胺，来那度胺，泊马度胺(pomalidomide)和咪喹莫特及其组合。在一些实施方式中，免疫疗法包括免疫检查点疗法。
在另一方面，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统的方法，用于确定表示选自存在于包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本的预定数量的可用视场中的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的得分，该方法包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一特异性生物标志物的荧光信号扩张到涵盖位于近侧的表达第二特异性生物标志物的细胞；和(iii)将来自每个选定视场的所有细胞的第一总面积除以归一化得分，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物特异性标志物的细胞的扩张荧光信号内。在一些实施方式中，与定量第一特异性生物标志物的表达或定量第二特异性生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。
在另一方面，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统的方法，用于确定表示选自存在于包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本的预定数量的可用视场中的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的得分，该方法包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩张到涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；和(iii)将来自每个选定视场的所有细胞的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物特异标志物的细胞的扩张荧光信号内。在一些实施方式中，与定量第一特异性生物标志物的表达或定量第二特异性生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。
在另一方面，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统的方法，用于确定表示选自存在于包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本的预定数量的可用视场中的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的得分，该方法包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩展约1个像素至约100个像素的余量以涵盖位于近侧的表达第二生物标志物的细胞；和(iii)将来自每个选定视场的所有细胞的以像素为单位测量的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张荧光信号内。在一些实施方式中，与定量第一特异性生物标志物的表达或定量第二特异性生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。
在另一方面，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统的方法，用于确定表示选自存在于包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本的预定数量的可用视场中的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的得分，该方法包括：(i)从包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本中选择可用的预定数量的视场，将样本用多个荧光标签染色，该选择偏向于选择包含相对于其他视场表达第一生物标志物的更多数量的细胞的视场；(ii)对于每个选定的视场，将归属于第一生物标志物的荧光信号扩张约1至约100个像素的余量以涵盖表达在第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内的第二生物标志物的细胞；和(iii)将来自每个选定视场的所有细胞的以像素测量的第一总面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得出空间接近度得分，其中该所有细胞表达第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩张荧光信号内。在一些实施方式中，与定量第一特异性生物标志物的表达或定量第二特异性生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。
在一些实施方式中，空间接近度得分(SPS)由以下等式确定：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一特异性生物标志物的细胞的扩张荧光信号内)，并且ANT是非肿瘤细胞的总面积。
在一些实施方式中，空间接近度得分由以下等式确定：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一特异性生物标志物的细胞的扩张荧光信号内)，AC是具有表达第二特异性生物标志物的能力的细胞的总面积。
在一些实施方式中，空间接近度得分由以下等式确定：
其中AI是总交互面积(下述细胞的总面积，所述细胞表达第二特异性生物标志物并且被涵盖在可归属于表达第一特异性生物标志物的细胞的扩张荧光信号内)，AT是所有细胞的总面积。
在另一方面，公开了利用包含成像装置和用于对包含来自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的控制器的系统的方法，这些方法用于治疗癌症患者的方法中。在一些实施方式中，在给予免疫疗法之前对包含来自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的方法。
在一些实施方式中，本文公开了利用包含成像装置和控制器的系统的方法，用于治疗有需要的癌症患者，该方法包括：(a)对包含取自患者的肿瘤组织的样本进行评分，评分包括(i)使用包含取自患者的肿瘤组织的样本，确定代表至少一对细胞之间的空间接近度的得分，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；(ii)记录得分；(b)将得分与阈值进行比较；(c)当与阈值相比时，如果得分表明患者将对免疫疗法有积极响应的可能性，则对患者施用免疫疗法。在一些实施方式中，确定步骤如本文所述。在一些实施方式中，与定量第一特异性生物标志物的表达或定量第二特异性生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。
在一些实施方式中，本文公开了对组织样本进行评分的方法，其包括：(i)使用成像系统获得从癌症患者获取的组织样本的图像数据，成像系统包括：外壳以及电子控制系统，其中外壳包括用于将样本放置在成像场中的台，用于在样本处引导电磁辐射的电磁辐射源，以及用于收集电磁辐射输出的检测器，而电子控制系统包括存储器和具有图像处理模块的处理电路；(ii)使用图像处理模块分析图像数据以确定代表一对细胞之间接近程度的得分，该对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，该对细胞的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；和(iii)将得分记录在存储器中，当与阈值相比较时，得分表示癌症患者将对免疫疗法呈阳性反应的可能性。在一些实施方式中，与定量第一特异性生物标志物的表达或定量第二特异性生物标志物的表达相比，该方法提供优越的预测能力。
在一些实施方式中，本文公开了组织样本评分系统，其包括：成像装置，其获得从癌症患者获取的组织样本的图像数据；控制器，控制器从成像装置接收图像数据并分析数据以确定表示一对细胞之间的接近程度的得分，该至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，该至少一对细胞中的第二成员表达不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物；当与阈值比较时，得分指示癌症患者将对免疫疗法有积极响应的可能性。
实施例
实施例1、来自人类患者的黑素瘤组织样本的样本制备、成像和成像分析
样本制备：将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡。然后通过一系列二甲苯到乙醇洗涤将载玻片再水化，然后在蒸馏水中温育。然后在升高的压力和温度条件下进行热诱导的抗原修复，使其冷却，并转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，染色包括以下步骤。首先，阻断内源性过氧化物酶，随后与蛋白封闭溶液一起温育以减少非特异性抗体染色。接下来，将载玻片用小鼠抗PD1一级抗体进行染色。然后洗涤载玻片，再用抗小鼠HRP二级抗体温育。洗涤载玻片，然后使用TSA+3.5(PerkinElmer)检测PD-1染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼洗涤两次来淬灭任何残留的HRP。再次洗涤载玻片，然后用兔抗PD-L1一级抗体染色。洗涤载玻片，然后用使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和488染料直接标记的小鼠抗S100和抗兔HRP二级抗体的混合物温育。清洗载玻片，然后使用TSA-5(PerkinElmer)检测PD-L1染色。最后一次洗涤载玻片，然后用安装介质套盖，并在室温下干燥过夜。图6显示了抗体和检测试剂的示意图。或者，用抗CD8一级抗体代替抗PD1一级抗体对载玻片进行染色。
样本成像和分析。然后使用利用Vectra软件2.0.8版(PerkinElmer)的Vectra2智能载玻片分析系统获取荧光图像。首先，使用DAPI以4倍放大率对载玻片进行单色成像。使用自动算法(使用inForm开发)来识别包含组织的载玻片的区域。
确定为含有组织的载玻片区域以4倍放大率成像以获得与DAPI(蓝色)，FITC(绿色)和5(红色)相关联的通道以创建RGB图像。这些4倍图像使用视场选择器101中的自动富集算法(使用inForm开发)来处理，以根据最高5表达式识别和排列可能的20倍放大视场。
前40个视场在DAPI、FITC、德克萨斯红和5波长放大20倍。检查原始图像的可接受性，并且在分析之前排除未聚焦，缺乏任何肿瘤细胞，高度坏死或包含与预期的抗体定位(即背景染色)不相关的高水平荧光信号的图像。使用AQUAduct(PerkinElmer)处理接受的图像，其中每个荧光团通过光谱解混器210在光谱上解混成单个通道并保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或使用AQUAserveTM全自动过程进一步分析处理过的文件。详情如下。
每个DAPI图像由细胞掩膜器212处理以识别该图像内的所有细胞核(图7a)，然后扩张3个像素以表示整个细胞的大致尺寸。该结果掩膜表示该图像内的所有细胞(图7b)。
通过肿瘤掩膜器216处理用488染料(图8a)检测的S100(黑素瘤的肿瘤细胞标志物)以产生该图像(图8b)内所有肿瘤区域的二元掩膜。在该掩膜和所有细胞的掩膜之间的重叠使用肿瘤细胞掩膜器218为肿瘤细胞(图8c)创建了新的掩膜。
类似地，肿瘤细胞标志物的缺乏与所有细胞核的掩膜组合，为所有非肿瘤细胞(图8d)产生了新的掩膜，使用非肿瘤细胞掩膜器220进行。
每个5图像(图9a)由第一生物标志物掩膜器222处理并与所有细胞的掩膜重叠，以产生PD-L1阳性(图9b)的所有细胞的二元掩膜。所有细胞的掩膜与生物标志物掩膜的重叠消除了在掩膜中可能被错误识别为生物标志物阳性细胞的噪声像素。
每个3.5图像(图10a)由第二生物标志物掩膜器224处理以创建用于PD-1阳性细胞的二元掩膜，并且与所有非肿瘤细胞的掩膜重叠以创建所有非肿瘤细胞(即PD-1阳性)(图10b)的二元掩膜。所有非肿瘤细胞的掩膜与生物标志物掩膜的重叠消除了在掩膜中可能被错误识别为生物标志物阳性细胞的噪声像素。
使用第二扩张器226扩张所有PD-L1阳性细胞的二元掩膜以产生涵盖最接近的相邻细胞(例如具有PD-1的细胞)(图11a)的交互掩膜。使用交互掩膜器230将该交互掩膜与所有PD-1阳性非肿瘤细胞的二元掩膜结合，以产生与PD-L1阳性细胞足够接近的PD-1阳性细胞的交互隔室，使得该PD-1可能与PD-L1相互作用(图11b)。
分别在面积评估器232、234中计算交互隔室的所有可接受区域(多达40个视场)的总面积和非肿瘤细胞的总面积。将来自交互隔室的所有可接受视场的总面积除以非肿瘤细胞的总面积并乘以10,000因子，使用交互计算器236来创建代表每个样本的交互得分的整数。PD-L1和PD-1的测量具有高度的重现性(分别为R2＝0.98和0.97)。在档案临床标本(n＝53)中观察到广泛的PD-L1和PD-1表达和交互得分。在用nivolumab(n＝5)或pembrolizumab(n＝21)治疗的26名晚期黑色素瘤患者队列中，发现PD-1/PD-L1交互得分可靠地区分应答者与非应答者(p＝0.01)，而仅PD-L1(p＝0.07)或仅CD8(p＝0.23)则不能。此外，表现较高PD-1/PD-L1交互得分的患者的反应率更高(82％对20％，p＝0.01)。与具有较低PD-1/PD-L1交互得分的患者相比，具有高PD-1/PD-L1交互得分的患者的中位无进展生存期更长(p＝0.059)，死亡更少(22％对58％)。这些结果表明，与单独PD-L1表达相比，这种对组织样本进行评分以获得PD-1/PD-L1交互得分的方法提供了优越的预测能力(82％阳性预测值，80％阴性预测值)。
图12a示出了来自26名患者的代表性得分。根据这些数据，选择800-900的阈值来表示对治疗作出反应的可能性。
或者，针对每个个体视场计算交互得分，并且在图12b中示出每个患者的最大得分。根据最高得分，选择1900的阈值来表示对治疗的反应可能性。
为了评估富集算法对交互得分的影响，使用完整载玻片成像代替富集算法进行上述过程(参见图13)。当进行完整的载玻片图像分析时，对抗PD1治疗有反应的患者与对抗PD1治疗无反应的患者之间不再存在统计学显着性差异。因此，通过此分析无法确定阈值。
将交互得分与患者的无进展存活率(PFS)进行比较(图14)。至少803的交互得分与存活率相关性良好。值得注意的是，PD-L1表达与改善的PFS无关(图15)。
图16和图17显示了指示PD-L1阳性细胞(红色)，PD-L-阳性细胞(黄色)，肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)的重叠掩膜的代表性实例。对于对免疫疗法呈阳性的反应者，图16中的掩膜容易指示PD-L1阳性细胞(红色)，PD-1阳性细胞(黄色)和所有肿瘤细胞(绿色)的存在。相反，对于免疫疗法呈阴性的反应者，图17中的掩膜表明存在肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)，但显示很少或不显示PD-L1阳性细胞(红色)或PD-1阳性细胞(黄色)。图16表示2176的交互得分(对免疫疗法的完全应答)。图17表示8的交互得分(对免疫疗法无反应)。
还使用FDA批准的使用抗PD-L1抗体克隆22C3测量非小细胞肺癌中PD-L1的方法(目前未用于黑素瘤组织样本)来评估组织样本。将PD-L1表达与患者PFS进行比较并显示在图19中。与使用交互得分的本文所述的方法相比，该方法没有显示统计学相关的诊断值。
对另外34名转移性黑素瘤患者的验证队列进行检查并获得PD-1/PD-L1交互得分(参见图20a)。这些交互得分还与患者的无进展存活率(PFS)进行比较(图20b)。尽管并非统计学显著的(P＝0.19)，但比较表明具有较长PFS的患者PD-1/PD-L1交互得分较高的趋势。由于在临床中相对最近使用这些疗法，所以统计学显著性可能受到限制，因此限制了这些患者的随访时间。
图20c-20e中显示了PD-1/PD-L1交互得分以及这些得分与26位患者的早期队列和34位患者的验证队列的组合的患者PFS或患者总存活率(OS)的比较。联合分析清楚地表明具有高PD-1/PD-L1的患者表现出对抗PD-1疗法的改善的反应。
实施例2、来自人类患者的非小细胞肺癌组织样本的样本制备、成像以及成像分析。
进行与实施例1类似的过程，对于上皮肿瘤样本，用直接用488染料标记的小鼠抗泛细胞角蛋白替换直接用488染料标记的小鼠抗S100。图18显示了38个样本的交互得分。
实施例3、带有表达PD-L1的细胞和表达CD80的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
样本制备：将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡，再水化，并在高温条件下进行抗原修复。然后进行染色，染色包括以下步骤。首先，使用(先进细胞诊断(Advanced Cell Diagnostics))，使用20对跨越CTLA-4mRNA的约1kb的杂交探针对组织进行CTLA-4表达检测。用TSA-3观察原位杂交。洗涤载玻片，然后使用具有50mM过氧化氢和新鲜的100mM苯甲酰肼洗涤两次来淬灭任何残留的HRP。在用小鼠抗CD80一级抗体染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后与抗小鼠HRP二级抗体一起孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(PerkinElmer)检测CD80染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼洗涤两次来淬灭任何残留的HRP。在用兔抗CD3一级抗体染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后用抗兔HRP二级抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-(生命科技(LifeTechnologies))检测CD3染色。最后一次洗涤载玻片，然后用安装介质套盖，并在室温下干燥过夜。
进行与实施例1类似的成像和分析过程，在DAPI、FITC、3和5波长上成像。使用CTLA-4和CD80的表达来开发用于获取20倍图像的富集算法。通过测量CD80阳性细胞接近度内CTLA-4和CD3阳性细胞的总面积(以像素为单位)除以CD3阳性细胞的总面积(以像素为单位)，再乘以因子10,000，进行分析以确定CTLA-4/CD80交互得分。结果显示在图21中。
实施例4、带有表达CTLA-4的细胞和表达CD80的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用CTLA-4和CD80的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例5、带有表达PD-L2的细胞和表达PD-1的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用PD-L2的染色和分析取代PD-L1的染色和分析。
实施例6、带有表达CTLA-4的细胞和表达CD86的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用CTLA-4和CD86的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例7、带有表达LAG-3的细胞和表达HLA-DR的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用LAG-3和HLA-DR的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例8、带有表达TIM-3的细胞和表达半乳凝素9的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用TIM-3和半乳凝素9的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例9、带有表达41BB的细胞和表达4.1BBL的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用41BB和4.1BBL的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例10、带有表达OX40的细胞和表达OX40L的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用OX40和OX40L的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例11、带有表达CD40的细胞和表达CD40L的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用CD40和CD40L的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例12、带有表达ICOS的细胞和表达ICOSL的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用ICOS和ICOSL的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例13、带有表达GITR的细胞和表达GITRL的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用GITR和GITRL的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例14、带有表达HLA-DR的细胞和表达TCR的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
进行与实施例1类似的过程，用HLA-DR和TCR的染色和分析取代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例15、带有表达PD-1、PD-L1和CD3的细胞的组织样本的样本制备，成像和成像分析。
与实施例1类似的过程在没有小鼠抗S100抗体的情况下进行。相反，在PD-L1检测后，通过微波去除一级抗体和二级抗体。然后用兔抗CD3一级抗体对载玻片进行染色。洗涤载玻片，然后用抗兔HRP二级抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-AlexaFluor488(生命科技(LifeTechnologies))检测CD3染色。成像和分析类似于实施例1，其中空间接近度(例如交互得分)通过PD-L1阳性区域中的PD-1阳性细胞的面积(以像素为单位)除以所有有核细胞的面积(以像素为单位)，再乘以因子10,000来计算。图22显示了29个样本的交互得分。
虽然已经说明和描述了某些实施例，但应该理解，在不脱离如以下权利要求中所限定的其更宽方面中的技术的情况下，本领域的普通技术人员可以在其中进行改变和修改。
这里说明性描述的实施例可适当地在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素，一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被解释为开放式的并且非限制性的。此外，本文使用的术语和表述仅用作说明性的术语并且是非限制性的，并且在这种术语和表述的使用中不意欲限制并且不表示排除所给出的和所描述的性质或其一部分的任何等价物，而是应该认识到可以在所要求的技术的范围内进行多种可能的修改。此外，短语“基本上由…组成”将被理解为包括具体指出的那些要素和基本上不影响所要求的技术的基本的和新的特性的那些附加要素。短语“由…组成”不包括未指出的任何要素。
本公开不限制于本申请中描述的特定实施方案的方面。如本领域技术人员将明白的，可以进行多种修改和变化而不脱离其精神和范围。除本文列举的那些之外，本公开的范围内的功能等价方法和化合物从以上说明将对于本领域技术人员是显见的。这种修改和变化意图落入所附权利要求的范围内。本公开仅由所附权利要求的方面，连同这些权利要求给出的全部等价范围限定。应该明白的是该公开不限定于特定的方法、试剂或化合物，其当然可以变化。还应该明白的是使用本文的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不倾向于是限定性的。
此外，在公开的特征或方面以马库什组的方式描述的情况下，本领域技术人员明白该公开从而也以任何单独的成员或马库什组的成员的小组的方式描述。
本领域技术人员同样明白的是，用于任何和所有目的，尤其是在提供书面描述的方面，本文公开的所有范围也包括任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。任意列出的范围可以容易地被认为是足以描述并能够给出分开为至少两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等的相同范围。作为非限制性实施例，本文公开的每个范围可以容易地分开为下面的三分之一、中间的三分之一和上面的三分之一等。如本领域技术人员也将明白的是，所有语言如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所叙述的数目，并且是指可以随后分开为如上所述的子范围的范围。最终，如本领域技术人员将明白的是，范围包括每个单独的成员。
本说明书中提及的所有公布、专利申请、已授权的专利和其他文献以引用方式并入本文，如同每个单独的公布、专利申请、已授权的专利和其他文献被特别地和单独地表明以其整体以引用方式并入一样。在以引用方式并入的内容中含有的定义在它们与本公开内容中的定义矛盾的范围被排除。
其他实施方案在以下权利要求中给出。

Claims (113)

1.一种用于对包含采集自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的成像系统，所述成像系统包括：
成像装置，其包括用于将所述样本定位在成像场中的台，用于将电磁辐射引导到所述样本处的电磁辐射源，以及配置成检测来自所述样本的电磁辐射的检测器；
控制器，包括：
用于在操作员和控制器之间交换信息的用户界面；和
处理电路，将其配置为执行存储在计算机可读介质上的指令，所述指令使所述成像系统的控制器执行以下操作：
从所述成像装置接收与检测到的电磁辐射有关的信息；
基于检测到的电磁辐射生成图像数据；
分析所述图像数据以确定代表至少一对细胞之间的接近程度的得分，所述至少一对细胞的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞的第二成员表达与第一种生物标志物不同的第二生物标志物；
记录所述得分，当与阈值比较时，所述得分表示癌症患者将对免疫疗法积极响应的可能性。
2.根据权利要求1所述的系统，其中表示所述至少一对细胞之间的接近程度的得分代表所述细胞对彼此之间再预定接近度内的程度。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述接近程度是在像素级上评估的。
4.根据权利要求2所述的系统，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约1个像素到约100个像素。
5.根据权利要求2所述的系统，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约5个像素到约40个像素。
6.根据权利要求2所述的系统，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约0.5μm至约50μm。
7.根据权利要求2所述的系统，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约2.5μm至约20μm。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述得分通过获得所述细胞对的边界之间的接近度来计算。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述得分通过获得所述细胞对的质量中心之间的接近度来计算。
10.根据权利要求1所述的系统，其中使用基于所述细胞对中的所选第一细胞周围的周界的边界逻辑来计算所述得分。
11.根据权利要求1所述的系统，其中通过确定所述细胞对的边界中的交集来计算所述得分。
12.根据权利要求1所述的系统，其中通过确定所述细胞对的重叠区域来计算所述得分。
13.根据权利要求1所述的系统，其中生成所述图像数据包括：
将与检测到的电磁辐射有关的信息分离成未混合的图像数据；和
通过多个数据通道提供所述数据，其中第一数据通道中的未混合图像数据描述可归属于所述第一生物标志物的荧光信号，第二数据通道中的未混合图像数据描述可归属于所述第二生物标志物的荧光信号。
14.根据权利要求13所述的系统，其中分析所述数据包括：
使用所述处理电路的扩张器，将来自第一数据通道的归属于所述第一生物标志物的荧光信号扩张预定余量，选择所述预定余量以涵盖位于近侧的表达所述第二生物标志物的细胞以产生扩张的第一生物标志物掩膜；
确定交互面积，其中所述交互面积是下述所有细胞的第一总面积，所述细胞表达所述第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达所述第一生物标志物的细胞的扩张的荧光信号内；和
使用所述处理电路的交互计算器，将所述交互面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得到空间接近度得分。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述归一化因子是具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。
16.根据权利要求14所述的系统，其中所述交互面积通过将所述扩张的第一生物标志物掩膜与代表表达所述第二生物标志物的细胞的掩膜组合而确定，所述第二生物标志物从所述第二数据通道的信号确定。
17.根据权利要求13所述的系统，其中第三数据通道描述可归属于细胞核的荧光信号，第四数据通道描述可归属于所述样本中的肿瘤区域的荧光信号。
18.根据权利要求15所述的系统，其中通过组合基于来自所述第三数据通道的信号的、代表所述样本中的所有细胞的细胞掩膜，和基于来自所述第四数据通道的信号的、代表所述样本上的肿瘤区域的肿瘤区域掩膜，来确定具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述细胞掩膜和所述肿瘤区域掩膜的组合包括从所述细胞掩膜移除所述肿瘤区域掩膜。
20.根据权利要求1所述的系统，其中还将所述处理电路配置为使所述控制器：
获得代表所述图像中第一或第二生物标志物浓度的低倍率图像数据；
识别包含所述第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；
选择包括所述第一或第二生物标志物的最高浓度的预定数量的区域；
向所述成像装置发送指令以获得预定数量区域的高倍率图像数据；和
其中将所述高倍率图像数据提供给所述控制器以便分析并用于确定得分。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述低倍率小于或等于10倍放大率，并且其中所述高倍率大于10倍。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述低倍率是10倍放大率，并且其中所述高倍率是40倍。
23.根据权利要求21所述的系统，其中所述低倍率是10倍放大率，并且其中所述高倍率是20倍。
24.根据权利要求21所述的系统，其中所述低倍率是4倍放大率，并且其中所述高倍率是40倍。
25.根据权利要求21所述的系统，其中所述低倍率是4倍放大率，并且其中所述高倍率是20倍。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述控制器将所述得分和与所述样本的图像相关联的元数据相关联。
27.根据权利要求1所述的系统，其中所述控制器生成包括所述得分的报告。
28.根据权利要求1所述的系统，其中所述控制器将所述得分提供给操作者以确定免疫疗法策略。
29.根据权利要求1所述的系统，其中所述控制器将所述得分记录在数据库中。
30.根据权利要求1所述的系统，其中所述控制器将所述得分与患者的医疗记录相关联。
31.根据权利要求1所述的系统，其中所述电磁辐射源是从由白炽灯、荧光灯或二极管组成的组中选择的非相干电磁辐射源。
32.根据权利要求1所述的系统，其中所述电磁辐射源是相干电磁辐射源。
33.根据权利要求1所述的系统，还包括电磁辐射调节光学器件，其被定位成将来自所述电磁辐射源的电磁辐射引导至所述样本。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述电磁辐射调节光学器件包括可调滤光器元件，所述可调滤光器元件被配置为使用不同的电磁辐射波段为所述样本提供照射。
35.根据权利要求1所述的系统，还包括电磁辐射会聚光学器件，所述电磁辐射会聚光学器件被配置为从所述样本接收发射的电磁辐射并且将所发射的电磁辐射作为输出电磁辐射引导至所述检测器。
36.根据权利要求35所述的系统，其中所述电磁辐射会聚光学器件包括可调滤光器元件，所述可调滤光器元件被配置为从来自所述样本的电磁辐射中选择特定的电磁辐射波段。
37.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测器包括至少一个CCD传感器。
38.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测器包括光电倍增管。
39.根据权利要求1所述的系统，其中将所述检测器配置为生成与来自所述样本的电磁辐射对应的电信号，并将所述电信号传送至所述控制器。
40.根据权利要求1所述的系统，其中还将所述控制器配置为将所述电信号发送到所述台、所述电磁辐射源和所述检测器中的一个或多个以调节所述台、电磁辐射源和/或检测器的至少一个特性。
41.根据权利要求1所述的系统，还包括用于向所述操作员显示信息的显示装置。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所显示的信息是所述系统的参数、所述系统的特性以及所捕获的所述样本图像中的一个。
43.根据权利要求41所述的系统，其中所述控制器在所述显示装置上显示所述得分。
44.根据权利要求1所述的系统，其中与来自所述成像装置的所检测到的电磁辐射有关的信息是多个光谱图像。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述多个光谱图像各自对应于由所述样本发射并由所述检测器检测到的电磁辐射的不同波长。
46.根据权利要求45所述的系统，其中由所述样本发射的电磁辐射的每个波长对应于添加到所述样本的不同荧光团以识别所述样本中的特定特征。
47.一种对组织样本进行评分的方法，包括：
使用成像系统获得从癌症患者获取的组织样本的图像数据，所述成像系统包括：
外壳，其包括用于将所述样本定位在成像场中的台，用于在所述样本处引导电磁辐射的电磁辐射源，以及用于收集所述电磁辐射输出的检测器；和
控制器，其包括存储器和具有图像处理模块的处理电路；
使用所述图像处理模块分析所述图像数据以确定表示一对细胞之间的接近程度的得分，所述一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述一对细胞中的第二成员表达与第一生物标志物不同的第二生物标志物；和
将所述得分记录在存储器中，当与阈值比较时，所述得分表示癌症患者将对免疫疗法有积极响应的可能性。
48.根据权利要求47所述的方法，其中代表所述细胞对之间的接近程度的得分代表所述细胞对彼此在预定接近度内的程度。
49.根据权利要求47所述的方法，其中分析所述图像数据包括在像素尺度上评估所述接近程度。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约1个像素到约100个像素。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约5个像素到约40个像素。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约0.5μm至约50μm。
53.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞对之间的所述预定接近度从约2.5μm至约20μm。
54.根据权利要求47所述的方法，其中通过获得所述细胞对的边界之间的接近度来计算所述得分。
55.根据权利要求47所述的方法，其中通过获得所述细胞对的质量中心之间的接近度来计算所述得分。
56.根据权利要求47所述的方法，其中使用基于所述细胞对中的所选第一细胞周围的周界的边界逻辑来计算所述得分。
57.根据权利要求47所述的方法，其中通过确定所述细胞对的边界中的交集来计算所述得分。
58.根据权利要求47所述的方法，其中通过确定所述细胞对的重叠区域来计算所述得分。
59.根据权利要求47所述的方法，其中生成所述图像数据包括：
将与检测到的电磁辐射有关的信息分离成未混合的图像数据；和
通过多个数据通道提供所述数据，其中第一数据通道中的未混合图像数据描述可归属于第一生物标志物的荧光信号，第二数据通道中的未混合图像数据描述可归属于第二生物标志物的荧光信号。
60.根据权利要求59所述的方法，其中分析所述图像数据包括：
使用所述处理电路的扩张器，将来自所述第一数据通道的归属于所述第一生物标志物的荧光信号扩张预定余量，选择所述预定余量以涵盖位于近侧的表达所述第二生物标志物的细胞以产生扩张的第一生物标志物掩膜；
确定交互面积，其中交互面积是下述所有细胞的第一总面积，所述细胞表达所述第二生物标志物并且被涵盖在可归属于表达所述第一生物标志物的细胞的扩张的荧光信号内；和
使用所述处理电路的交互计算器，将所述交互面积除以归一化因子，并将所得商与预定因子相乘以得到空间接近度得分。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述归一化因子是具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。
62.根据权利要求60所述的方法，其中确定所述交互面积包括将所述扩张的第一生物标志物掩膜与代表表达所述第二生物标志物的细胞的掩膜组合，所述第二生物标志物从所述第二数据通道的信号确定。
63.根据权利要求60所述的方法，其中第三数据通道描述可归属于细胞核的荧光信号，第四数据通道描述归属于所述样本中的肿瘤区域的荧光信号。
64.根据权利要求61所述的方法，还包括通过组合基于来自所述第三数据通道的信号的、代表所述样本中的所有细胞的细胞掩膜，和基于来自第四数据通道的信号的、代表所述样本上的肿瘤区域的肿瘤区域掩膜，来确定具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。
65.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞掩膜和所述肿瘤区域掩膜的组合包括从所述细胞掩膜移除所述肿瘤区域掩膜。
66.根据权利要求47所述的方法，还包括：
使用所述成像系统得到代表所述图像中第一或第二生物标志物浓度的低倍率图像数据；
识别包含所述第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；
选择包含所述第一或第二生物标志物的最高浓度的预定数量的区域；
向所述成像装置发送指令以获得预定数量区域的高倍率图像数据；和
其中将所述高倍率图像数据提供给所述控制器以便分析并用于确定得分。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述低倍率是小于或等于10倍的放大率，并且其中所述高倍率大于10倍。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述低倍率是4倍放大率，并且其中所述高倍率是20倍。
69.根据权利要求47所述的方法，还包括将所述得分和与所述样本的图像相关联的元数据相关联。
70.根据权利要求47所述的方法，还包括生成包含所述得分的报告。
71.根据权利要求47所述的方法，还包括将所述得分提供给专业人员以确定免疫疗法策略。
72.根据权利要求47所述的方法，还包括将所述得分记录在数据库中。
73.根据权利要求47所述的方法，还包括将所述得分与患者的医疗记录相关联。
74.根据权利要求47所述的方法，还包括在显示装置上显示所述得分。
75.一种对组织样本进行评分的系统，包括：
成像装置，其获得采集自癌症患者的组织样本的图像数据；和
控制器，其从所述成像装置接收图像数据并分析数据以确定表示一对细胞之间的接近程度的得分，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物；
其中当与阈值比较时，所述得分表示癌症患者将对免疫疗法积极响应的可能性。
76.根据权利要求40所述的系统，其中所述成像装置包括用于将所述样本定位在成像场中的台，用于将电磁辐射引导到所述样本处的电磁辐射源，以及配置成检测来自所述样本的电磁辐射的检测器。
77.根据权利要求1所述的系统，其中所述电磁辐射选自由可见光和不可见光组成的组。
78.根据权利要求77所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
79.根据权利要求77所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约400nm至大约700nm范围的可见光波段。
80.根据权利要求77所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的波长的可见光波段。
81.根据权利要求75所述的系统，其中所述电磁辐射选自由可见光和不可见光组成的组。
82.根据权利要求81所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
83.根据权利要求81所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约400nm至大约700nm范围的可见光波段。
84.根据权利要求81所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
85.根据权利要求35所述的系统，其中所述发射的或输出的电磁辐射包括来自由包括波长落在约440nm至约480nm，约490nm至约550nm，约505nm至约535nm，约550nm至约595nm，约585nm至约630nm，约600nm至约640nm和约650nm至约710nm的范围内的波段组成的组的一个或多个可见光波段。
86.根据权利要求45所述的系统，其中所述发射的或输出的电磁辐射包括来自由包括波长落入约440nm至约480nm，约490nm至约550nm，约505nm至约535nm，约550nm至约595nm，约585nm至约630nm，约600nm至约640nm和约650nm至约710nm的范围内的波段组成的组的一个或多个可见光波段。
87.根据权利要求46所述的系统，其中所述发射的或输出的电磁辐射包括来自由包括波长落入约440nm至约480nm，约490nm至约550nm，约505nm至约535nm，约550nm至约595nm，约585nm至约630nm，约600nm至约640nm和约650nm至约710nm的范围内的波段组成的组的一个或多个可见光波段。
88.根据权利要求47所述的系统，其中所述发射的或输出的电磁辐射包括来自由包括波长落在约440nm至约480nm，约490nm至约550nm，约505nm至约535nm，约550nm至约595nm，约585nm至约630nm，约600nm至约640nm和约650nm至约710nm的范围内的波段组成的组的一个或多个可见光波段。
89.根据权利要求47所述的系统，其中所述电磁辐射选自由可见光和不可见光组成的组。
90.根据权利要求89所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
91.根据权利要求89所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约400nm至大约700nm范围的可见光波段。
92.根据权利要求89所述的系统，其中所述可见光包括波长落入大约380nm至大约720nm范围内的可见光波段。
93.根据权利要求1所述的系统，其中与定量所述第一生物标志物的表达或定量所述第二生物标志物的表达相比，所述方法提供优越的预测能力。
94.根据权利要求93所述的系统，其中将所述预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。
95.根据权利要求94所述的系统，其中所述阳性预测值是65％或更高。
96.根据权利要求95所述的系统，其中所述阳性预测值是70％或更高。
97.根据权利要求96所述的系统，其中所述阳性预测值是75％或更高。
98.根据权利要求94所述的系统，其中所述阴性预测值是65％或更高。
99.根据权利要求98所述的系统，其中所述阴性预测值是80％或更高。
100.根据权利要求47所述的系统，其中与定量所述第一生物标志物的表达或定量所述第二生物标志物的表达相比，所述方法提供优越的预测能力。
101.根据权利要求100所述的系统，其中将所述预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。
102.根据权利要求101所述的系统，其中所述阳性预测值是65％或更高。
103.根据权利要求102所述的系统，其中所述阳性预测值是70％或更高。
104.根据权利要求103所述的系统，其中所述阳性预测值是75％或更高。
105.根据权利要求101所述的系统，其中所述阴性预测值是65％或更高。
106.根据权利要求105所述的系统，其中所述阴性预测值是80％或更高。
107.根据权利要求75所述的系统，其中与定量所述第一特异性生物标志物的表达或定量所述第二特异性生物标志物的表达相比，所述方法提供优越的预测能力。
108.根据权利要求107所述的系统，其中将所述预测能力量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。
109.根据权利要求108所述的系统，其中所述阳性预测值是65％或更高。
110.根据权利要求109所述的系统，其中所述阳性预测值是70％或更高。
111.根据权利要求110所述的系统，其中所述阳性预测值是75％或更高。
112.根据权利要求108所述的系统，其中所述阴性预测值是65％或更高。
113.根据权利要求112所述的系统，其中所述阴性预测值是80％或更高。
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