CN108449973A - Aqua增强版本后的计算机进程 - Google Patents

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Abstract

本发明部分涉及用于对包含源于癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的系统和方法。从这些方法获得的所述分数能够表示患者可能对免疫疗法有积极应答的可能性。本发明还部分涉及针对存在于源于癌症患者的组织样本的视野中的所有细胞或可选地针对其一个或多个子集导出生物标志物阳性率(PBP)％的值的方法。所述PBP的值能够表示患者对免疫疗法的应答。

Description

AQUA增强版本后的计算机进程
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月23日提交的美国临时申请序列号62/245,938、于2015年11月24日提交的美国临时申请序列号62/259,328以及于2016年2月29日提交的美国临时申请序列号62/301,037的权益和优先权，所有这些的全部内容均通过引用并入本文。
背景技术
本发明一般涉及癌症治疗领域。
发明内容
在一个方面中，本文公开了成像系统，其包括图像处理控制器，图像处理控制器包括处理电路，该处理电路被配置成执行在计算机可读介质上存储的指令，该指令使得图像处理系统的控制器：
被配置成接收源于成像装置的图像数据，图像数据描述从癌症患者获取的肿瘤组织的样本；以及使用图像数据确定代表在肿瘤组织中的至少一对细胞之间的接近性的分数，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；其中所述分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。在一些实施方案中，代表至少一对细胞之间的接近性的分数代表该对细胞在彼此的预定接近度内的程度。在一些实施方案中，接近性是按像素级别进行评估的。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约1个像素至约100个像素。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约5个像素至约40个像素。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约0.5μm至约50μm。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约2.5μm至约20μm。在一些实施方案中，通过获得该对细胞的边界之间的接近度来确定分数。在一些实施方案中，通过获得该对细胞的质量中心之间的接近度来确定分数。在一些实施方案中，使用基于该对细胞中选定的第一细胞周围的周长的边界逻辑来确定分数。在一些实施方案中，通过确定该对细胞的边界中的交叉点来确定分数。在一些实施方案中，通过确定该对细胞的重叠区域来确定分数。在一些实施方案中，图像处理控制器还被配置成将图像数据分离成未混合的图像数据；通过多个数据通道提供数据，其中在第一数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第二数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号。在一些实施方案中，为了确定分数，图像处理控制器被配置成使源于第一数据通道的可归因于第一生物标志物的荧光信号被扩大预定的余量以生成扩大的第一生物标志物掩膜，所述预定的余量被选定为包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；确定交互面积，其中交互面积是所有下述细胞的第一总面积，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内；以及将交互面积除以归一化因子，并将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数。在一些实施方案中，归一化因子是具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。在一些实施方案中，交互面积是通过将扩大的第一生物标志物掩膜与根据第二数据通道的信号确定的代表表达第二生物标志物的细胞的掩膜相组合来确定的。在一些实施方案中，第三数据通道描述可归因于细胞核的荧光信号，且第四数据通道描述可归因于样本中的肿瘤区域的荧光信号。在一些实施方案中，具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积是通过将以下二者组合来确定的：基于源于第三数据通道的信号的代表样本中的所有细胞的细胞掩膜，与基于源于第四数据通道的信号的代表样本上的肿瘤区域的肿瘤区域掩膜。在一些实施方案中，组合细胞掩膜和肿瘤区域掩膜包括从细胞掩膜移除肿瘤区域掩膜。在一些实施方案中，每个掩膜是通过将二进制值分配给源于选定通道的图像数据的每个像素来生成的。在一些实施方案中，二进制值通过阈值函数被分配给每个值，其中阈值函数将为1的值分配给具有等于或大于预定强度阈值的强度的每个像素，并将为0的值分配给具有低于预定强度阈值的强度的每个像素。在一些实施方案中，二进制值通过直方图阈值函数被分配给每个值，其中直方图阈值函数使用像素强度的计算尺(sliding scale)来确定阈值，并将为1的值分配给具有等于或大于强度阈值的强度的每个像素，并将为0的值分配给具有低于强度阈值的强度的每个像素。在一些实施方案中，阈值是通过以下内容确定的：将每个像素的强度求和成总强度；将阈值百分比乘以总强度以获得截止和；按直方图中的强度对所有像素进行分组；以及将像素强度从最低到最高求和直至达到截止和为止；其中在该过程中访问的最后一个最高的像素强度为强度阈值。在一些实施方案中，组合掩膜是使用“and”操作来执行的；其中“and”操作是第一掩膜中像素的像素强度与第二掩膜中像素的像素强度的乘积。在一些实施方案中，组合掩膜是使用“out”操作来执行的；其中“out”操作从第一掩膜移除第二掩膜。在一些实施方案中，图像处理控制器还被配置成获得代表图像中的第一或第二生物标志物的浓度的低倍率的图像数据；识别包括第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；选择预定数量的包括第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；向成像装置发送指令以获得针对预定数量的区域的高倍率图像数据；以及其中高倍率图像数据被提供至控制器以进行分析并用于确定分数。在一些实施方案中，低倍率小于或等于10倍的倍率，且其中高倍率大于10倍。在一些实施方案中，低倍率为10倍的倍率，且其中高倍率为40倍。在一些实施方案中，低倍率为10倍的倍率，且其中高倍率为20倍。在一些实施方案中，低倍率为4倍的倍率，且其中高倍率为40倍。在一些实施方案中，低倍率为4倍的倍率，且其中高倍率为20倍。在一些实施方案中，图像处理单元还被配置成将分数与和样本的图像相关联的元数据关联起来。在一些实施方案中，图像处理单元生成包括分数的报告。在一些实施方案中，图像处理单元还被配置成将分数提供给操作员以确定免疫治疗策略。在一些实施方案中，图像处理单元还被配置成将分数记录在数据库中。在一些实施方案中，图像处理单元还被配置成将分数与患者的医疗记录关联起来。在一些实施方案中，图像处理单元还被配置成在显示装置上显示分数。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括肿瘤细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括非肿瘤细胞。在一些实施方案中，非肿瘤细胞包括免疫细胞。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一和第二成员包括免疫细胞。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括免疫细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞表达PD-L1且免疫细胞表达PD-1。在一些实施方案中，图像处理单元还被配置成从包括得自癌症患者的肿瘤组织的样本选择预定数量的可用视野，并根据与每个视野相关联的数据确定分数。在一些实施方案中，样本用多个荧光标签进行染色，且其中荧光标签中的每一个是针对特定生物标志物的。在一些实施方案中，多个荧光标签包括用于第一生物标志物的第一荧光标签和用于第二生物标志物的第二荧光标签。在一些实施方案中，余量的范围是约1至约100个像素。在一些实施方案中，表达第二生物标志物的位于近侧的细胞在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5至约50μm内。在一些实施方案中，预定因子为104。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合所组成的组的第一生物标志物，且至少一对细胞中的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合所组成的组的第二生物标志物。在一些实施方案中，阈值的范围是约500至约5000。在一些实施方案中，阈值为约900加或减100。在一些实施方案中，免疫疗法包括免疫检查点疗法。在一些实施方案中，与第一生物标志物的表达的定量或第二生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。
在另一个方面中，本文公开了用于确定代表肿瘤组织样本中至少一对细胞之间的接近度的分数的系统，该系统包括存储器，该存储器包括光谱解混器，其接收源于成像装置的图像数据，将图像数据分离成未混合的图像数据，且通过多个数据通道提供数据，其中在第一数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于细胞核的荧光信号，在第二数据通道中的未混合的数据描述可归因于肿瘤组织的荧光信号，在第三数据通道中的未混合的数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第四数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号；细胞掩膜器，其使用源于第一数据通道的图像数据并生成代表在视野中的所有核的图像且扩大图像以生成细胞掩膜；肿瘤区域掩膜器，其使用源于第二数据通道的图像数据并生成在视野中的所有肿瘤区域的掩膜；第一生物标志物掩膜器，其使用源于第三数据通道的图像数据并生成表达第一生物标志物的在视野中的所有细胞的第一生物标志物掩膜；第二生物标志物掩膜器，其使用源于第四数据通道的图像数据并生成表达第二生物标志物的在视野中的所有细胞的第二生物标志物掩膜；肿瘤掩膜器，其组合细胞掩膜和肿瘤区域掩膜以生成非肿瘤细胞掩膜和肿瘤细胞掩膜中的至少一个；扩大器，其扩大第一生物标志物掩膜以生成扩大的第一生物标志物掩膜；交互掩膜器，其用于组合扩大的第一生物标志物掩膜和第二生物标志物掩膜以生成交互掩膜；交互计算器，其计算空间接近度分数。在一些实施方案中，交互计算器将交互掩膜的面积除以非肿瘤细胞掩膜、肿瘤细胞掩膜和细胞掩膜中的一个的面积。在一些实施方案中，空间接近度分数是根据下列等式进行计算的：
其中AI是总交互面积(交互掩膜的面积)，且AC是非肿瘤细胞掩膜、肿瘤细胞掩膜和细胞掩膜中的至少一个的总面积。在一些实施方案中，与第一生物标志物的表达的定量或第二生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。
在另一个方面中，本文公开了用于确定代表组织中至少一对细胞之间的接近度的分数的方法，该方法包括：接收与取自癌症患者的肿瘤组织的组织样本相关联的图像数据；从用多个荧光标签染色的包括取自癌症患者的肿瘤组织的样本选择至少一个视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的至少一个视野；为选定视野中的每一个按下述余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，所述余量足以包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内的；以及记录分数，当与阈值相比较时，分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。在一些实施方案中，与第一生物标志物的表达的定量或第二生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。
在另一个方面中，本文公开了用于确定组织样本中生物标志物阳性值的系统，该系统包括处理电路，处理电路包括存储器，该存储器包括光谱解混器，其接收源于成像装置的图像数据，将图像数据分离成未混合的图像数据，且通过多个数据通道提供数据，其中在第一数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于细胞核的荧光信号，在第二数据通道中的未混合的数据描述可归因于感兴趣的子集组织的荧光信号，且在第三数据通道中的未混合的数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号；细胞掩膜器，其使用源于第一数据通道的图像数据并生成代表在视野中的所有核的图像，且扩大图像以生成细胞掩膜；子集区域掩膜器，其使用源于第二数据通道的图像数据并生成在视野中的所有子集区域的掩膜；第一生物标志物掩膜器，其使用源于第三数据通道的图像数据并生成表达第一生物标志物的在视野中的所有细胞的第一生物标志物掩膜；子集掩膜器，其组合细胞掩膜和子集区域的掩膜以生成非子集细胞掩膜和子集细胞掩膜中的至少一个；组合掩膜器，其用于组合生物标志物掩膜和非子集细胞掩膜与子集细胞掩膜中的至少一个；阳性计算器，其用于计算生物标志物的阳性值。在一些实施方案中，计算器将生物标志物掩膜的面积除以非子集细胞掩膜与子集细胞掩膜中的至少一个的面积。在一些实施方案中，感兴趣的子集组织是肿瘤组织，子集细胞是肿瘤细胞，且非子集细胞为非肿瘤细胞。
在一些实施方案中，第一生物标志物包括选自PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86的生物标志物。
在一些实施方案中，第二生物标志物不同于第一生物标志物且包括选自PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86的生物标志物。
在另一个方面中，本文公开了包括图像处理单元的系统，该图像处理单元被配置成接收源于成像装置的图像数据，该图像数据描述从患者获取的组织的样本；以及确定生物标志物的阳性值，所述值代表了相对于样本中一个类型的细胞的总量而言表达感兴趣的生物标志物的该类型的细胞的量。
在一个方面中，本文公开了用于对包括取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的成像系统，成像系统包括成像装置，成像装置包括用于将样本定位在成像场中的平台，用于指引样本处的电磁辐射的电磁辐射源和被配置成检测源于样本的电磁辐射的检测器，以及控制器。控制器包括用于在操作员和控制器之间交换信息的用户界面；以及被配置成执行在计算机可读介质上存储的指令的处理电路。指令被配置成使得控制器：(i)接收关于所检测到的源于成像装置的电磁辐射的信息；(ii)基于检测到的电磁辐射生成图像数据；(iii)分析图像数据以确定代表至少一对细胞之间的接近性的分数，该至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(iv)记录分数，当与阈值相比时，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
在一些实施方案中，代表至少一对细胞之间的接近性的分数代表该对细胞在彼此的预定接近度内的程度。在一些实施方案中，接近性是按像素级别进行评估的。在一些实施方案中，该对细胞之间的预定接近度的范围为约1个像素至约100个像素。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约5个像素至约40个像素。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约0.5μm至约50μm。在一些实施方案中，在该对细胞之间的预定接近度的范围为约2.5μm至约20μm。
在一些实施方案中，通过获得该对细胞的边界之间的接近度来计算分数。在一些实施方案中，通过获得该对细胞的质量中心之间的接近度来计算分数。在一些实施方案中，使用基于该对细胞中选定的第一细胞周围的周长的边界逻辑来计算分数。在一些实施方案中，通过确定在该对细胞的边界中的交叉点来计算分数。在一些实施方案中，通过确定该对细胞的重叠区域来计算分数。
在一些实施方案中，生成图像数据包括：(i)将关于所检测到的电磁辐射的信息分离成未混合的图像数据；以及(ii)通过多个数据通道提供数据，其中在第一数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第二数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号。
在一些实施方案中，分析数据包括：(i)使用处理电路的扩大器来使源于第一数据通道的可归因于第一生物标志物的荧光信号被扩大预定的余量以生成扩大的第一生物标志物掩膜，所述预定的余量被选定为包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；(ii)确定交互面积，其中交互面积是所有下述细胞的第一总面积，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞扩大的荧光信号内；以及(iii)使用处理电路的交互计算器来将交互面积除以归一化因子，并将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数。
在一些实施方案中，归一化因子是具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。在一些实施方案中，交互面积是通过将扩大的第一生物标志物掩膜与根据第二数据通道的信号确定的代表表达第二生物标志物的细胞的掩膜相组合来确定的。在一些实施方案中，第三数据通道描述可归因于细胞核的荧光信号，且第四数据通道描述可归因于样本中的肿瘤区域的荧光信号。在一些实施方案中，具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积是通过将以下二者组合来确定的：基于源于第三数据通道的信号的代表样本中的所有细胞的细胞掩膜与基于源于第四数据通道的信号的代表在样本上的肿瘤区域的肿瘤区域的掩膜。在一些实施方案中，组合细胞掩膜和肿瘤区域掩膜包括从细胞掩膜移除肿瘤区域掩膜。
在一些实施方案中，处理电路还被配置成使得控制器：(i)获得代表图像中的第一或第二生物标志物的浓度的低倍率的图像数据；(ii)识别包括第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；(iii)选择预定数量的包括第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；(iv)向成像装置发送指令以获得针对预定数量的区域的高倍率图像数据；其中高倍率图像数据被提供至控制器以进行分析并用于确定分数。
在一些实施方案中，低倍率小于或等于10倍的倍率，且其中高倍率大于10倍。在一些实施方案中，低倍率为10倍的倍率，且其中高倍率为40倍。在一些实施方案中，低倍率为10倍的倍率，且其中高倍率为20倍。在一些实施方案中，低倍率为4倍的倍率，且其中高倍率为40倍。在一些实施方案中，低倍率为4倍的倍率，且其中高倍率为20倍。
在一些实施方案中，控制器将分数和与样本的图像相关联的元数据关联起来。在一些实施方案中，控制器生成包括分数的报告。在一些实施方案中，控制器将分数提供给操作员以确定免疫治疗策略。在一些实施方案中，控制器将分数记录在数据库中。在一些实施方案中，控制器将分数与患者的医疗记录关联起来。
在一些实施方案中，电磁辐射源是选自由白炽灯、荧光灯或二极管所组成的组的非相干电磁辐射源。在一些实施方案中，电磁辐射源是相干电磁辐射源。在一些实施方案中，系统还包括电磁辐射调节光学器件，其被定位成将源于电磁辐射源的电磁辐射引向样本。在一些实施方案中，电磁辐射调节光学器件包括可调整的光谱过滤元件，其被配置成使用不同的电磁辐射波长带提供对样本的照明。
在一些实施方案中，系统还包括电磁辐射会聚光学器件，该电磁辐射会聚光学器件被配置成接收源于样本的发射的电磁辐射并将发射的电磁辐射作为输出电磁辐射引向检测器。在一些实施方案中，电磁辐射会聚光学器件包括可调整的光谱过滤元件，其被配置成从源于样本的电磁辐射选择特定的电磁辐射波长带。
在一些实施方案中，检测器包括至少一个CCD传感器。在一些实施方案中，检测器包括光电倍增管。在一些实施方案中，检测器被配置成生成与源于样本的电磁辐射相对应的电信号并将该电信号传递至控制器。
在一些实施方案中，控制器还被配置成将电信号发送至平台、电磁辐射源和检测器中的一个或多个以调整平台、电磁辐射源和/或检测器的至少一个特性。在一些实施方案中，系统还包括用于向操作员显示信息的显示装置。在一些实施方案中，所显示的信息是系统的参数、系统的属性以及样本的捕获图像中的一种。在一些实施方案中，控制器在显示装置上显示分数。
在一些实施方案中，关于源于成像装置的所检测的电磁辐射的信息是多个光谱图像。在一些实施方案中，多个光谱图像中的每一个对应于样本发射的且由检测器检测的电磁辐射的不同波长。在一些实施方案中，样本发射的电磁辐射的每个波长对应于被添加至样本以识别样本中的特定特性的不同荧光团。
在一些实施方案中，与第一生物标志物的表达的定量或第二生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。
在另一个方面中，本文公开了对组织样本进行评分的方法，其包括：(i)使用成像系统获得针对从癌症患者获取的组织样本的图像数据。成像系统包括壳体，其包括用于将样本定位在成像场中的平台，用于指引在样本处的电磁辐射的电磁辐射源和用于收集电磁辐射输出的检测器；以及控制器，其包括存储器和具有图像处理模块的处理电路。(ii)使用图像处理模块分析图像数据以确定代表一对细胞之间的接近性的分数，该对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(iii)将分数记录在存储器中，当与阈值相比时，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
在一些实施方案中，代表该对细胞之间的接近性的分数代表该对细胞在彼此的预定接近度内的程度。在一些实施方案中，分析图像数据包括按像素级别评估接近性。在一些实施方案中，该对细胞之间的预定接近度的范围为约1个像素至约100个像素。在一些实施方案中，该对细胞之间的预定接近度的范围为约5个像素至约40个像素。在一些实施方案中，该对细胞之间的预定接近度的范围为约0.5μm至约50μm。在一些实施方案中，该对细胞之间的预定接近度的范围为约2.5μm至约20μm。在一些实施方案中，通过获得该对细胞的边界之间的接近度来计算分数。在一些实施方案中，通过获得该对细胞的质量中心之间的接近度来计算分数。在一些实施方案中，使用基于该对细胞中选定的第一细胞周围的周长的边界逻辑来计算分数。在一些实施方案中，通过确定该对细胞的边界中的交叉点来计算分数。在一些实施方案中，通过确定该对细胞的重叠区域来计算分数。
在一些实施方案中，生成图像数据包括：(i)将关于所检测到的电磁辐射的信息分离成未混合的图像数据；以及(ii)通过多个数据通道提供数据，其中在第一数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第二数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号。
在一些实施方案中，分析图像数据包括：(i)使用处理电路的扩大器来使源于第一数据通道的可归因于第一生物标志物的荧光信号被扩大预定的余量以生成扩大的第一生物标志物掩膜，所述预定的余量被选定为包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；(ii)确定交互面积，其中交互面积是所有下述细胞的第一总面积，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞扩大的荧光信号内；以及(iii)使用处理电路的交互计算器来将交互面积除以归一化因子，并将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数。
在一些实施方案中，归一化因子是具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。在一些实施方案中，确定交互面积包括将扩大的第一生物标志物掩膜与根据第二数据通道的信号确定的代表表达第二生物标志物的细胞的掩膜相组合。在一些实施方案中，第三数据通道描述可归因于细胞核的荧光信号，且第四数据通道描述可归因于样本中的肿瘤区域的荧光信号。
在一些实施方案中，该方法还包括通过将以下二者组合来确定具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积：基于源于第三数据通道的信号的代表样本中的所有细胞的细胞掩膜，与基于源于第四数据通道的信号的代表在样本上的肿瘤区域的肿瘤区域掩膜。在一些实施方案中，组合细胞掩膜和肿瘤区域掩膜包括从细胞掩膜移除肿瘤区域掩膜。
在一些实施方案中，该方法还包括(i)使用成像系统来获得代表图像中的第一或第二生物标志物的浓度的低倍率的图像数据；(ii)识别包括第一或第二生物标志物的最高浓度的区域；(iii)选择包括第一或第二生物标志物的最高浓度的预定数量的区域；(iv)向成像装置发送指令以获得针对预定数量的区域的高倍率图像数据；以及(v)其中高倍率图像数据被提供至控制器以进行分析并用于确定分数。
在一些实施方案中，低倍率小于或等于10倍的倍率，且其中高倍率大于10倍。在一些实施方案中，低倍率为4倍的倍率，且其中高倍率为20倍。
在一些实施方案中，该方法还包括将分数和与样本的图像相关联的元数据关联起来。在一些实施方案中，该方法还包括生成包括分数的报告。在一些实施方案中，该方法还包括将分数提供给专业人员以确定免疫治疗策略。在一些实施方案中，该方法还包括将分数记录在数据库中。在一些实施方案中，该方法还包括将分数与患者的医疗记录关联起来。在一些实施方案中，该方法还包括在显示装置上显示分数。
在一些实施方案中，与第一生物标志物的表达的定量或第二生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。
在另一个方面中，本文公开了组织样本的评分系统，其包括：(i)成像装置，其获得从癌症患者获取的组织样本的图像数据；以及(ii)控制器，其接收源于图像装置的图像数据并分析数据以确定代表一对细胞之间的接近性的分数，该至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；(iii)其中，当与阈值相比时，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
在一些实施方案中，成像装置包括用于将样本定位在成像场中的平台，用于指引在样本处的电磁辐射的电磁辐射源和被配置成检测源于样本的电磁辐射的检测器。
在一些实施方案中，电磁辐射选自由可见光和不可见光所组成的组。在一些实施方案中，可见光包括具有落在约380nm至约720nm范围内的波长的可见光带。在一些实施方案中，可见光包括具有落在约400nm至约700nm范围内的波长的可见光带。在一些实施方案中，可见光包括具有落在约380nm至约720nm范围内的波长的可见光带。
在一些实施方案中，发射的或输出的电磁辐射包括来自由包括落在约440nm至约480nm、约490nm至约550nm、约505nm至约535nm、约550nm至约595nm、约585nm至约630nm、约600nm至约640nm和约650nm至约710nm范围内的波长的带所组成的组的一个或多个可见光带。在一些实施方案中，电磁辐射选自由可见光和不可见光所组成的组。在一些实施方案中，可见光包括具有落在约380nm至约720nm范围内的波长的可见光带。在一些实施方案中，可见光包括具有落在约400nm至约700nm范围内的波长的可见光带。在一些实施方案中，可见光包括具有落在约380nm至约720nm范围内的波长的可见光带。
在一些实施方案中，与第一生物标志物的表达的定量或第二生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。
附图说明
图1是用于获得样本的图像数据的成像装置的方框图。
图2是根据一个示例性实施方案的控制器的方框图，所述控制器被配置成对包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本进行评分。
图3是根据一个示例性实施方案的用于对包括肿瘤组织的样本进行评分的过程的流程图。
图4是根据第二个示例性实施方案的用于对包括肿瘤组织的样本进行评分的过程的流程图。
图5是根据一个示例性实施方案的用于对包括肿瘤组织的样本进行评分的图像处理步骤的流程图。
图6示出用于制备组织样本以供成像和分析中的抗体和检测试剂的概况的非限制性实施例。
图7a示出在图像内用DAPI检测到的所有核的非限制性实施例。
图7b示出图7a中的所有细胞的扩大的二元掩膜的非限制性实施例。
图8a示出用488染料检测到的S100图像的非限制性示例。
图8b示出图8a中的所有肿瘤区域的二元掩膜的非限制性实施例。
图8c示出图8a中的所有肿瘤细胞的掩膜的非限制性实施例。
图8d示出图8a中的所有非肿瘤细胞的掩膜的非限制性实施例。
图9a示出用5检测到的PD-L1图像的非限制性实施例。
图9b示出图9a内所有PD-L1阳性细胞的二元掩膜的非限制性实施例。
图9c示出图9a内所有PD-L1阳性肿瘤细胞的掩膜的非限制性实施例。
图9d示出图9a内所有PD-L1阳性非肿瘤细胞的掩膜的非限制性实施例。
图10a示出用3.5检测到的PD-1图像的非限制性示例。
图10b示出图10a内所有PD-1阳性非肿瘤细胞的二元掩膜的非限制性实施例。
图11a示出所有PD-L1阳性细胞和最接近的邻居细胞的交互掩膜的非限制性实施例。
图11b示出紧邻PD-L1阳性细胞的PD-1-阳性细胞的交互隔室的非限制性实施例。
图12a示出源于26名黑素瘤患者的交互分数的非限制性实施例。
图12b示出图12a的源于26名患者的最大交互分数的非限制性实施例。
图13示出基于代替富集算法的全载玻片成像的分析结果。
图14示出交互分数与26名患者的无进展生存期的比较。注意：*表示未校正的对数秩检验。
图15示出PD-L1表达与患者的无进展生存期的比较。
图16示出用于免疫疗法的阳性应答者的与PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1-阳性细胞(黄色)、所有肿瘤细胞(绿色)和所有细胞(蓝色)相对应的荧光信号的掩膜的非限制性实施例。
图17示出用于免疫疗法的阴性应答者的与PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1-阳性细胞(黄色)、所有肿瘤细胞(绿色)和所有细胞(蓝色)相对应的荧光信号的掩膜的非限制性实施例。
图18示出源于38名非小细胞肺癌患者的代表性PD-1/PD-Ll交互分数和针对PD-L1和PD-1的％生物标志物阳性(PBP)值。
图19示出以患者的无进展生存期表示的使用22C3FDA批准的IHC测定来确定的PD-L1表达的比较。注意：*表示使用未校正的对数秩检验确定的p值。
图20a示出源于另外34名黑素瘤患者的交互分数的非限制性实施例。
图20b示出交互分数与图20a的患者的无进展生存期的比较。
图20c示出源于图12a和12b的患者和图20a的患者的交互分数。
图20d示出交互分数与图20c的患者的无进展生存期的比较。注意：*表示使用未校正的对数秩检验确定的p值。
图20e示出图20c的患者的以总生存期(OS)表示的交互分数的比较。注意：*表示使用未校正的对数秩检验计算的p值。
图21示出源于29名转移性黑素瘤患者的CTLA-4/CD80交互分数的非限制性实施例。
图22示出源于29名睾丸癌患者的PD-1/PD-L1交互分数的非限制性实施例。
图23示出根据一个示例性实施方案的控制器的方框图，所述控制器被配置成导出生物标志物阳性值。
图24示出根据一个示例性实施方案的用于导出生物标志物阳性值的过程的流程图。
图25示出根据第二个示例性实施方案的用于导出生物标志物阳性值的过程的流程图。
图26示出根据一个示例性实施方案的用于导出生物标志物阳性值的图像处理步骤的流程图。
图27a示出通过增加PD-L1表达来分选的源于21名黑素瘤患者的组织样本中表达PD-L1的所有细胞的％生物标志物阳性(PBP)值的非限制性实施例。
图27b示出通过增加PD-L1表达来分选的源于相同的21名黑素瘤患者的组织样本中的表达PD-1的所有非肿瘤细胞的PBP值的非限制性实施例。
图28示出通过自动化细胞计数方法与本文所述方法确定的％PD-L1阳性的比较。
图29a示出在图像内用DAPI检测到的所有核的非限制性实施例。
图29b示出图29a中的所有细胞的扩大的二元掩膜的非限制性实施例。
图30a示出用5检测到的PD-1图像的非限制性实施例。
图30b示出图30a内所有PD-1阳性细胞的二元掩膜的非限制性实施例。
图31a示出用3检测到的CD3图像的非限制性示例。
图31b示出图31a内所有CD3阳性细胞的二元掩膜的非限制性实施例。
图32示出针对PD-1和CD3为双阳性的所有细胞的二元掩膜的非限制性实施例。
图33a示出源于DLBCL患者(n＝43)的组织样本中CD3+T-细胞的定量评估的非限制性实施例。
图33b示出源于DLBCL患者(n＝43)的组织样本中CD3+/PD1+T-细胞的定量评估的非限制性实施例。
图34a示出在NSCLC、胃和黑素瘤组织上的CD25的定量评估的非限制性实施例。
图34b示出在NSCLC、胃和黑素瘤组织上的FoxP3的定量评估的非限制性实施例。
图35示出在NSCLC、胃和黑素瘤组织中CD25+/FoxP3+T-细胞的定量评估的非限制性实施例。
图36a示出在NSCLC、胃和黑素瘤组织上的CD4的定量评估的非限制性实施例。
图36b示出在NSCLC、胃和黑素瘤组织上的CD8的定量评估的非限制性实施例。
图37a示出在转移性黑素瘤组织上的CD11b+/HLA-DR-表型的定量评估的非限制性实施例。
图37b示出在转移性黑素瘤组织上的CD11b+/IDO-1+/HLA-DR-表型的定量评估的非限制性实施例。
图38a示出在转移性黑素瘤组织上的IDO-1+/HLA-DR+表型的定量评估的非限制性实施例。
图38b示出在转移性黑素瘤组织上的CD11b+/IDO-1+/HLA-DR+表型的定量评估的非限制性实施例。
图39a示出在NSCLC组织上的CD11b+/CD33+/ARG1+表型的定量评估的非限制性实施例。
图39b示出在NSCLC组织上的CD11b+/HLA-DR+/IDO-1+表型的定量评估的非限制性实施例。
图40示出在NSCLC组织上的CD11b+/HLA-DR-/IDO-1+表型的定量评估的非限制性实施例。
图41示出在转移性黑素瘤组织上的CD8+Ki67+T细胞的定量评估的非限制性实施例。
图42a示出在转移性黑素瘤组织上的CD163+细胞的定量评估的非限制性实施例。
图42b示出在转移性黑素瘤组织上的CD68+细胞的定量评估的非限制性实施例。
图42c示出在转移性黑素瘤组织上的CD163+CD68+细胞的定量评估的非限制性实施例。
图43a示出在DLBCL和NET组织上的LAG-3阳性T细胞的定量评估的非限制性实施例。
图43b示出在DLBCL和NET组织上的TIM-3阳性T细胞的定量评估的非限制性实施例。
图44a示出在黑素瘤组织上的T细胞中的CTLA-4的定量评估的非限制性实施例。
图44b示出在黑素瘤组织上的CD80的定量评估的非限制性实施例。
图45示出基于其免疫情境的代表性肿瘤分类。
具体实施方式
下面描述各种实施方案。应注意的是，特定实施方案并不旨在作为详尽描述或作为对本文所讨论的更广泛方面的限制。结合特定实施方案描述的一个方面不一定仅限于该实施方案且可以与任何其他实施方案一起实践。
如本文所使用的，“约”将由本领域普通技术人员理解且将根据使用其的上下文而在一定程度上变化。如果对于本领域的普通技术人员来说存在不明确的术语使用，考虑到使用其的上下文，“约”将表示高达特定术语的加或减10％。
在描述元件的上下文(特别是在下面的权利要求的上下文)中术语不定冠词(“a”、“an”)和定冠词“该”(the)以及类似的指示物的使用要被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾外。除非本文另有说明外，本文中对数值范围的叙述仅仅旨在用作单独提及落在该范围内的每个单独的值的便捷方法，且每个单独的值被并入说明书中，如同在本文中单独叙述的一样。在此描述的所有方法能够按任何合适的顺应执行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾外。除非另有说明外，否则本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明实施方案且不会限制权利要求的范围。说明书中的任何语言都不应被解释为将任何非要求保护的元件指示为必要。
术语“治疗(treating或treatment)”是指以有效改善与病症相关联的状况、症状或参数或预防病症发展的量、方式或模式，按统计学显著程度或本领域的技术人员可检测的程度施予疗法。有效的量、方式或模式能够根据受试者发生变化且可以为患者定制。
在一个方面中，本文提供了用于执行对包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本进行评分的方法的系统和方法。在另一个方面中，本文提供了用于导出组织样本的生物标志物阳性百分比的系统和方法。
在本文公开的方法中，癌症患者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物不是人。在另外的实施方案中，哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫或马。
在本文公开的方法中，肿瘤组织取自癌症患者。癌症的类型包括但不限于以下的癌症：循环系统，例如，心脏(肉瘤[血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤]、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)、纵隔和胸膜和其他胸内器官、血管肿瘤和肿瘤相关联的血管组织；呼吸道，例如鼻腔和中耳、副窦、喉、气管、支气管和肺，诸如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管癌(鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；胃肠系统，例如，食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃、胰腺(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；生殖泌尿道，例如，肾(腺癌、Wilm’s瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和/或尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝，例如，肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胰腺内分泌肿瘤(诸如嗜铬细胞瘤、胰岛瘤、血管活性肠肽肿瘤、胰岛细胞瘤和胰高血糖素瘤)；骨，例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨黏液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统，例如，中枢神经系统(CNS)的肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、脑胶质瘤)、脑癌(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；生殖系统，例如，妇科、子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈不典型增生)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌]、颗粒细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、阴户(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)和其他与女性生殖器官相关联的部位；胎盘、阴茎、前列腺、睾丸和与男性生殖器官相关联的部位；血液系统，例如，血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；口腔，例如，嘴唇、舌头、牙龈、口底、腭和其他口腔部分、腮腺、和唾腺的其他部分、扁桃腺、口咽、鼻咽、梨状窦、喉咽、和在嘴唇、口腔和咽中的其他部位；皮肤，例如，恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、发育异常性痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤和瘢痕瘤；肾上腺：成神经细胞瘤；和其他组织，包括结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼睛、眼内黑素瘤和附件、乳房、头部或/和颈部、肛门区域、甲状腺、副甲状腺、肾上腺和其他内分泌腺及相关结构、继发性和未指明的恶性淋巴结肿瘤、呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤以及其他部位的继发性恶性肿瘤，或其一种或多种的组合。
免疫疗法的实例包括但不限于单克隆抗体(例如，阿仑单抗或曲妥单抗)、缀合的单克隆抗体(例如，替伊莫单抗、CD30单抗或曲妥珠单抗-美坦新缀合物)、双特异性单克隆抗体(博纳吐单抗)、免疫检查点抑制剂(例如，伊匹单抗、派姆单抗、尼鲁单抗、联合贝伐珠单抗或度伐鲁单抗)、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺和咪喹莫特及其组合。在一些实施方案中，免疫疗法包括免疫检查点疗法。
肿瘤可基于其免疫情境被分类为“热的”(发炎的)或“冷的”(未发炎的)(参见图45)。尽管预计患热肿瘤的患者会对某些免疫疗法有应答且可能比患冷肿瘤的患者活得更久，但之前对于本领域的技术人员来说哪些生物标志物与应答和生存期相关仍是不清楚的。
为了解决这个问题，本文描述的方法的一些实施方案有助于通过免疫衰竭生物标志物(例如，PD-1和PD-L1)的表达而识别应答一种或多种免疫疗法的癌症患者，和通过已知会引起免疫抑制的细胞类型或没有MHC I类表达的高度增殖的肿瘤细胞(例如，Ki67+、B2M-)的存在而识别没有应答的癌症患者(即，非应答者)。在一些实施方案中，本文所述的方法包括基于特定免疫抑制或激活签名使用多重免疫组织化学测定(例如，多重FIHC测定)。下表中示出了基于特定免疫抑制或激活签名的多重FIHC测定的非限制性实施例。
图1是用于获得样本的多个光谱分辨图像的成像装置100的示意图。电磁辐射(EMR)源102向调节光学器件104提供电磁辐射。在一些实施方案中，电磁辐射是可见光。EMR源102能够是非相干光源，诸如白炽灯、荧光灯或二极管。EMR源102还能够是相干源，诸如激光源，且相干源能够提供连续波(CW)或脉冲光。EMR源102可以含有用于产生具有一定波长范围的多个光源元件(例如，多个二极管)。光能够是连续波(CW)或时间门控(即脉冲)光。此外，能够在电磁光谱的选定部分中提供光。例如，光能够具有落在光谱的紫外、可见、红外或其他区域内的中心波长或波长分布。在一些实施方案中，光具有落在约380nm至约720nm范围内的波长。EMR源102还能够包括各种光学元件，诸如透镜、反射镜、波片和非线性晶体，所有这些均能够被用于产生具有选定特征的光。通常，EMR源102包括光学元件和装置，其被配置成提供具有所需光谱、空间，且在一些实施方案中为具有时间特性的光。
调节光学器件104能够被配置成以多种方式转化电磁辐射，诸如，可见光。例如，调节光学器件104能够对光进行光谱过滤以在光谱的选定波长区域中提供输出光。替代地或额外地，调节光学器件能够调整光的空间分布和光的时间特性。入射电磁辐射或入射光是通过EMR上的调节光学器件104的元件的作用而生成的。
入射光被引至在被安装在照明平台106上的样本108上入射。平台106能够提供用于固定样本108的工具，诸如安装夹或其他紧固装置。替代地，平台106能够包括其上固定有多个样本108的可移动轨道或带。驱动器机构能够被配置成移动轨道，以使得将多个样本一次一个地相继移动通过平台106上的照明区域，在该平台上，入射光照射在样本上。平台106还能够包括用于相对于照明平台106的固定位置平移样本108的平移轴线和机构。平移机构能够是手动操作的(例如，螺纹杆)或能够经电致动(例如，机动驱动器、压电致动器)而可自动移动。
响应于入射的电磁辐射，诸如可见光，发射的电磁辐射从样本108现出。能够以多种方式生成发射光。例如，在一些实施方案中，发射光对应于被透射通过样本108的入射光的一部分。在其他实施方案中，发射光对应于从样本反射的入射光的一部分。在另外的实施方案中，入射光能够被样本108吸收，且发射光对应于响应于入射光而源于样本108的荧光发射。在另外的实施方案中，样本108能够是发光的，且即使在没有入射光的情况下也可以产生发射光。在一些实施方案中，发射光能够包括经前述机构中的两个或更多个机构产生的光。
会聚光学器件110被定位成接收源于样本108的发射的电磁辐射，诸如发射光。会聚光学器件110能够被配置成例如，当光发散时使发射光准直。会聚光学器件110还能够被配置成对发射光进行光谱过滤。过滤操作能够是有用的，例如，以便将经上面所讨论的机构之一产生的发射光的一部分与经其他过程产生的光相隔离。此外，在实施方案中，会聚光学器件110能够被配置成修改发射光的空间和/或时间特性以用于特定目的。光会聚光学器件110将发射光转化成在检测器112上入射的输出光。
调节光学器件104和会聚光学器件110能够包括用于操纵在感兴趣的样本上入射的和从其发射出的光的特性。例如，调节光学器件104和会聚光学器件110中的每一个能够包括用于从入射和发射光选择特定波长带的光谱过滤元件。光谱过滤元件能够包括，例如，被安装在滤波器上的干涉滤波器。在一些实施方案中，能够使用基于液晶掩膜的可调整过滤元件以改变入射或发射光的光谱特性。基于液晶的装置能够经通信接口152由控制器150控制。
调节光学器件104和会聚光学器件110还能够包括元件，诸如空间光掩膜、空间光调制器和光学脉冲整形器，以便操纵在样本上入射或从其发射出的光的空间分布。空间光调制器和其他适应装置也能够经通信接口152由控制器150控制。
最后，调节光学器件104和会聚光学器件110能够包括其他常见的光学元件，诸如反射镜、透镜、分束器、波片等，其被配置成使得赋予入射或发射光选定的特征。
通常，检测器112包括一个或多个测量装置，其被配置成检测和捕获由样本发射的光作为样本的多个图像。在实施方案中，检测器112能够被配置成测量光的空间和/或时间和/或光谱特性。检测器112能够包括装置，诸如CCD阵列和光电倍增管，及其各自的控制系统以用于获得图像。检测器112生成对应于输出光的电信号且被传送至控制器150。检测器112中的适应光学装置通常能够经通信接口152由控制器150控制。
控制器150包括通信接口152和处理电路156。除了接收对应于由检测器112检测到的输出光的信号之外，控制器150还通过通信接口152向检测器112发送电信号以调整检测器112的各种特性。例如，如果检测器112包括CCD传感器，控制器150则能够将电信号发送到检测器112以控制CCD传感器的曝光时间、活动区域、增益设置和其他特性。
控制器150还经通信接口152与EMR源102、调节光学器件104、平台106和会聚光学器件110相通信。控制系统114向系统100的这些元件中的每一个提供电信号以调整元件的各种属性。例如，被提供给光源102的电信号能够被用于调整光122的强度、波长、重复率或其他特性。当由EMR源102产生的光被脉冲化(即，时间门控)时，能够经通信接口152根据从控制器150被提供至EMR源102的控制信号来操纵光脉冲的各种特性。例如，被提供至光调节光学器件104和光会聚光学器件110的信号能够包括下述信号，所述信号用于配置调整光的空间特性的装置(例如，空间光调制器)的特性以及用于配置光谱过滤装置。例如，被提供至照明平台106的信号能够提供相对于平台106的对样本108的定位和/或用于将样本移动至在平台106上进行照明的位置上。
通信接口152可以包括用于与各种系统、装置或网络进行数据通信的有线或无线接口(例如，插孔、天线、发射器、接收器、收发器、有线终端等)。例如，通信接口152可以包括用于经基于以太网的通信网络发送和接收数据的以太网卡和端口和/或用于经无线通信网络进行通信的WiFi收发器。通信接口152可以被配置成经局域网或广域网(例如，因特网、建筑物WAN等)进行通信且可以使用各种通信协议(例如，BACnet、IP、LON等)。
控制器150还可以经通信接口152与用户界面154进行通信。用户界面154可以是用于显示系统特性和参数以及用于显示样本108的捕获图像的显示装置。提供用户界面154以便操作员与成像装置100交互且控制成像装置100。处理电路156包括用于存储使用检测器112捕获的图像数据的存储装置，诸如存储器160，且还包括对处理器158表达指令的计算机软件，所述指令使得处理器158执行控制功能，例如，诸如上面和下面另外讨论的那些。此外，软件指令使得处理器158用数学方法操纵由检测器112捕获的图像。在本文中更详细地描述了图像的处理和计算，其是由成像装置100的处理器116或与成像装置100相关联的外部计算系统，诸如图2中所示及下面所述的控制器200执行的。
在许多实施方案中，系统100被配置成获得样本108的多个光谱图像。多个光谱图像可以对应于在光的各种选定波长下对样本108的照明，并检测被透射通过样本108或由其反射的光的强度。替代地，多光谱图像可以对应于用具有相似光谱特性的光来照明样本108以及收集样本108的多个图像，每个图像对应于发射光的不同波长。调节光学器件104和会聚光学器件110中的光谱过滤元件通常被用于获得光谱分辨数据。
在一些实施方案中，能够顺次收集样本108的图像，调整相继捕获的图像之间的光学组件(例如，光学滤波器)的配置。在其他实施方案中，能够使用被配置成检测多个样本视图的检测系统来同时捕获多个图像。例如，检测系统能够被配置成将对应于不同照明或发射波长的样本的不同视图投射至检测器，诸如CCD相机上，且能够同时捕获多个视图。
在一些实施方案中，调节光学器件104包括可调整的光谱过滤元件，诸如滤光轮或液晶光谱滤波器。过滤元件能够被配置成使用不同的光波长带来提供对样本108的照明。EMR源102能够提供具有宽分布的光谱波长分量的光。该宽波长分布的选定区域被过滤元件允许作为入射光在调节光学器件104中通过且被引至在样本108上入射。被透射通过样本108的光的图像由检测器112记录。随后，改变调节光学器件104中的滤波器的通过带的波长，以提供具有不同波长的入射光，且记录被透射通过样本108(且对应于入射光的新波长)的光的图像。还能够通过采用具有生成不同波长的光的多个源元件的EMR源102，且交替地打开和关闭不同源元件以提供具有不同波长的入射光来记录类似组的光谱分辨图像。
如前所述，源于样本108的发射光也能够对应于从样本108反射的入射光。此外，如果样本包括荧光化学结构，则发射光能够对应于源于样本108的荧光发射。对于一些样本而言，发射光能够包括源于多个源的贡献(即，透射和荧光)，且光调节光学器件110中的光谱过滤元件能够被用于分离这些信号贡献。
通常，调节光学器件104和会聚光学器件110都包括可配置的光谱过滤元件。因此，能够在样本108的激发侧(例如，经调节光学器件104)或在样本108的发射侧(例如，经会聚光学器件110)或两者上提供光谱分辨。在任何情况下，收集样本108的多个光谱分辨图像的结果是“图像栈”，其中在该栈中的每个图像为对应于特定波长的样本的二维图像。从概念上讲，该组图像能够被形象化为形成三维矩阵，其中矩阵维度中的两个是图像中的每一个的空间长度和宽度，且第三矩阵维度是该图像所对应的光谱波长(发射或激发)。出于这个原因，该组光谱分辨图像能够被称为图像的“光谱立方体”。如本文所使用的，在这样一组图像(或图像栈或光谱立方体)中的“像素”是指用于图像中的每一个的公共空间位置。因此，一组图像中的像素包括与在对应于该像素的空间位置处的每个图像相关联的值。
根据手头样本的要求，可以采用本领域已知的用于获得光谱图像的其他布置。
虽然上述每个光谱图像通常是指特定波长或波长范围(例如，光谱带)，但更一般地，每个光谱图像能够对应于下述光谱指数，所述光谱指数可包括一个或多个波长带或一些更复杂的光谱分布。例如，能够通过使用光谱梳状滤波器来生成这种图像。通常，图像立方体将包括几个光谱图像，例如10个或更多。然而，在一些实施方案中，图像立方体可以包括更少的图像，例如仅有两个或三个光谱图像。一个这样的实施例是红-绿-蓝(RGB)彩色图像，其中每个像素包括与红色、绿色和蓝色中的每一个的强度相关联的值。这种信息可以被显示为单个彩色图像，而不是一组单独的图像；然而，信息内容与该组图像中的相同，且因此我们使用表述“光谱图像”来表示这两种情况。
成像装置100能够包括各种各样的光学元件和装置，用于捕获图像并生成在后续样本分析算法中(诸如用于对包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本进行评分的方法和算法)使用的样本的图像数据130，如本文所述。这样的成像装置在题为“分类图像特征(Classifying Image Features)”的美国专利号7,555,150中进行了描述，所述美国专利全部内容通过引用并入本文。
在对样本进行成像之前，可以使用对特定生物标志物具有亲和力的多个荧光标签对组织样本进行染色。可以获得染色样本的数字图像，且基于荧光标签的位置进一步分析图像。成像装置100的处理电路156可以包括用于使控制器150执行视野选择的软件，而不是进行全图像分析。其中，可以基于表达感兴趣的第一生物标志物的细胞的数量来对视野进行优先化。然后，可以针对荧光信号进一步分析预定数量的视野。在一些实施方案中，四种不同类型的荧光标签的使用生成对应于感兴趣的第一生物标志物的荧光信号的图像和对应于感兴趣的第二生物标志物的荧光信号的图像，以及对应于由所有细胞表达的生物标志物的荧光信号的图像和对应于由肿瘤细胞表达的生物标志物的荧光信号的图像。
荧光团的实施例包括但不限于荧光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、加利福尼亚红、iFluor594、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6F、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、级联蓝、级联黄、香豆素、Cy-铬、350、405、488、549、594、633、649、680、750、800、藻红蛋白、PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯)、NED、ROX(5-(和-6-)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄、玛丽娜蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568、Alexa594、Alexa 633、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、 FL、 FL-Br2、530/550、558/568、630/650、650/665、R6G、 TMR、 TR、OPALTM520、OPALTM540、OPALTM570、OPALTM620、OPALTM650、OPALTM690及其组合。在一些实施方案中，荧光团选自由DAPI、2、3、3.5、5、7、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、德克萨斯红和香豆素所组成的组。488染料的实施例包括但不限于Alexa 488、OPALTM520、488和CFTM488A。555染料的实施例包括但不限于Alexa 555。594染料的实施例包括但不限于Alexa 594。
如本文所使用的，“视野”是指组织样本的全载玻片数字图像的部分。在一些实施方案中，全载玻片图像具有2-200个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有10-200个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有30-200个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有10-150个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有10-100个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有10-50个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有10-40个预定视野。在一些实施方案中，全载玻片图像具有10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个(包括在其中的增量的)预定的视野。
为了如本文所述对组织样本进行评分，可以通过控制器200执行对源于成像装置100的图像数据的操纵，如在图2中示意性示出的。控制器200被示为包括通信接口202和处理电路204。处理电路204被配置成实施用于对组织样本进行评分的步骤。可以考虑的是，控制器200的元件和功能可以被包括在成像装置100的控制器150中，或可以存在于与成像装置100相分离的计算系统中。
在一些实施方案中，操纵荧光信号的图像以生成对应于图像内的细胞的荧光信号的一个或多个掩膜。在一些实施方案中，荧光信号的一个或多个掩膜包括选自由以下所组成的组中的一个或多个：图像内所有细胞的掩膜、图像内表达子集生物标志物的所有细胞(例如，所有肿瘤细胞)的掩膜、图像内不表达子集生物标志物的所有细胞(例如，所有非肿瘤细胞)的掩膜、图像内表达感兴趣的第一生物标志物的所有细胞的掩膜、图像内表达感兴趣的第二生物标志物的所有细胞的掩膜，和图像内代表表达感兴趣的第一生物标志物的所有细胞以及表达感兴趣的第二生物标志物的位于近侧的细胞的交互掩膜。在另外的实施方案中，使用交互掩膜来生成源于表达感兴趣的第二生物标志物的所有选定视野的细胞的交互隔室，该细胞位于表达感兴趣的第一生物标志物的细胞的近侧。交互隔室的总面积可以被用于生成表示至少一对细胞之间的空间接近度的分数，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物。在一些实施方案中，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。在一些实施方案中，与感兴趣的第一生物标志物的表达的定量或感兴趣的第二生物标志物的表达的定量相比，该系统提供了更优越的预测能力。
图3是描绘用于对包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本进行评分的方法的一个实施方案的步骤的流程图。在步骤301中，获得图像数据，诸如图像数据130。图像数据可以通过诸如成像装置100的成像装置获得。在步骤302中，图像数据被解混合，以使得将特定于各种类型的荧光信号的数据分离成不同的通道。在步骤303中，使用源于第一通道的数据以生成对于第一生物标志物呈阳性的所有细胞的掩膜(第一生物标志物掩膜)。然后，扩大所有细胞的掩膜(步骤304)以生成代表预定接近度的扩大掩膜，在该预定接近度内，可能发现交互细胞(对于第二生物标志物呈阳性)。在一些实施方案中，第一生物标志物掩膜被扩大1至100个像素。在步骤305中，使用源于第二通道的数据以生成对于第二生物标志物呈阳性的所有细胞的掩膜(第二生物标志物掩膜)。在步骤306中，组合第一生物标志物掩膜和第二生物标志物掩膜以生成识别细胞的交互掩膜，该细胞对于第二生物标志物呈阳性的并位于对于第一生物标志物呈阳性的细胞的预定接近度内。在步骤307中，基于交互掩膜的面积来计算空间接近度分数。
图4是描绘用于对包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本进行评分的方法的第二实施方案的步骤的第二个流程图。在步骤401中，获得图像数据，且在步骤402中，将图像数据解混合，以使得将特定于各种类型的荧光信号的数据分离成不同的通道。在步骤403中，源于第一通道的数据被用于生成在视野中的所有细胞的掩膜，且在步骤404中，源于第二通道的数据被用于生成子集区域(诸如在视野中的肿瘤区域)掩膜。在步骤405中，将所有细胞的掩膜与子集区域掩膜相组合以生成子集细胞的掩膜和非子集细胞的掩膜。在步骤406中，使用源于第三通道的数据以生成对于第一生物标志物呈阳性的所有阳性细胞的掩膜(第一生物标志物掩膜)。然后，扩大所有细胞的掩膜(步骤407)以生成代表预定接近度的扩大掩膜，在该预定接近度内，可能发现交互细胞(即，对于第二生物标志物呈阳性的细胞)。在一些实施方案中，第一生物标志物掩膜被扩大1至100个像素。在步骤408中，使用源于第四通道的数据以生成对于第二生物标志物呈阳性的所有细胞的掩膜(第二生物标志物掩膜)。在步骤409中，组合扩大的第一生物标志物掩膜和第二生物标志物掩膜以生成识别下述细胞的交互掩膜，所述细胞对于第二生物标志物呈阳性且位于对于第一生物标志物呈阳性的细胞的预定接近度内。在步骤410中，通过将交互掩膜的面积除以所有子集细胞或所有细胞的面积(如通过在代表任一输入的使用的图15的流程图中的虚线所示)来计算空间接近度分数。在一些实施方案中，子集细胞是能够对第二生物标志物呈阳性的细胞。在一些实施方案中，能够对第二生物标志物呈阳性的细胞是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。
在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于肿瘤细胞和非肿瘤细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于活细胞和非活细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集是活细胞子集，且细胞的非子集是由不包括在活细胞子集中的活细胞组成的。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于T细胞和非T细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于骨髓细胞和非骨髓细胞，或反之亦然。
在一些实施方案中，空间接近度分数代表一对细胞的接近性。在一些实施方案中，可以通过该对细胞的边界之间的接近度、通过该对细胞的质量中心之间的接近度、使用基于该对细胞中选定的第一细胞周围的周长的边界逻辑、确定该对细胞的边界中的交叉点和/或确定该对细胞的重叠区域，来确定一对细胞的接近性。
在一些实施方案中，空间接近度分数和与样本图像相关联的元数据相关联、被包括在生成的报告中、被提供至操作员以确定免疫治疗策略、被记录在数据库中、与患者的医疗记录相关联和/或被显示在显示装置上。
在一些实施方案中，与感兴趣的第一生物标志物的表达的定量或感兴趣的第二生物标志物的表达的定量相比，该系统提供了更优越的预测能力。
在本文所公开的方法中，根据一个示例性实施方案，数字图像的操纵可以由包括控制器(诸如在图2的方框图中所示的控制器)的计算系统执行。控制器200被示为包括通信接口202和处理电路204。通信接口202可以包括用于与各种系统、装置或网络进行数据通信的有线或无线接口(例如，插孔、天线、发射器、接收器、收发器、有线终端等)。例如，通信接口202可以包括用于经基于以太网的通信网络发送和接收数据的以太网卡和端口和/或用于经无线通信网络进行通信的WiFi收发器。通信接口202可以被配置成经局域网或广域网(例如，因特网、建筑物WAN等)进行通信且可以使用各种通信协议(例如，BACnet、IP、LON等)。
通信接口202可以是被配置成促进在控制器200和各种外部系统或装置(例如，成像装置102)之间的电子数据通信的网络接口。例如，控制器200可以接收源于成像装置102的针对选定视野的成像数据，以分析数据并计算空间接近度分数(SPS)。
仍然参考图2，处理电路204被示为包括处理器206和存储器208。处理器206可以是通用或专用处理器、专用集成电路(ASIC)、一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)、一组处理组件或其他合适的处理组件。处理器506可以被配置成执行在存储器508中存储的或从其他计算机可读介质(例如，CDROM、网络存储器、远程服务器等)接收的计算机代码或指令。
存储器208可以包括用于存储用于完成和/或促进在本公开中描述的各种进程的数据和/或计算机代码的一个或多个装置(例如，存储器单元、存储器装置、存储装置等)。存储器208可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬盘驱动器存储器、临时存储器、非易失性存储器、闪存、光存储器或用于存储软件对象和/或计算机指令的任何其他合适的存储器。存储器208可以包括数据库组件、目标代码组件、脚本组件或用于支持在本公开中描述的各种活动和信息结构的任何其他类型的信息结构。存储器508可以经处理电路204被可通信地连接至处理器206，且可以包括用于执行(例如，通过处理器206执行)本文描述的一个或多个进程的计算机代码。
仍然参考图2，控制器200被示为接收源于成像装置102的输入。成像装置获取所有成像数据并将其与描述其的所有元数据记录下来。成像装置然后将数据串行化成能够由控制器200读取的流。数据流可以适应任何二进制数据流类型，诸如文件系统、RDBM或直接TCP/IP通信。为了使用数据流，控制器200被示为包括光谱解混器210。光谱解混器210可以接收源于成像装置102的图像数据，其对该图像数据执行光谱解混以将呈现各种波长的图像解混成针对每个波长带的各个离散通道。例如，图像数据可以被“解混”成用于识别组织样本中感兴趣的细胞或蛋白质的各种荧光团中的每一种的单独通道。仅举例来说，荧光团可以是由DAPI、2、3、3.5、5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料和德克萨斯红所组成的组中的一个或多个。在一个示例中，通道之一可以包括落在围绕461nm的波长(DAPI的最大发射波长)的预定带内的图像数据，以识别图像中的核。其他通道可以包括针对不同波长的图像数据以使用不同的荧光团来识别组织样本的不同部分。
控制器200还被示为包括各种掩膜器，诸如细胞掩膜器212、子集区域掩膜器216、第一生物标志物掩膜器22和第二生物标志物掩膜器224。这些掩膜器或其他实施方案中可以包括在控制器200中的其他掩膜器被用于接收源于光谱解混器210的未混合的信号，并根据被用于识别组织样本中感兴趣的某些特性的荧光团来创建针对感兴趣的特定细胞或区域的掩膜。为了创建掩膜，掩膜器(诸如细胞掩膜器212、子集区域掩膜器216、第一生物标志物掩膜器22和第二生物标志物掩膜器224)接收与视野中的每个像素的强度相关的图像数据。像素强度与样本发射的荧光量成正比，其转而与样本中的蛋白生物标志物的量成正比(当使用荧光团来识别特定生物标志物时)。可以基于图像像素中存在的值来设置绝对阈值。所有大于或等于阈值的像素将被映射为1.0或“开”，且所有其他像素将被映射为0.0或“关”。以这种方式，创建二元掩膜以识别视野中感兴趣的细胞或组织部分。在其他实施方案中，使用下限创建掩膜，其中具有处于或高于下限的强度的所有像素均被接受且被用作该掩膜的像素值。如果强度低于下限，则将像素值设置为0.0或“关”。
在图5中所示的用于掩膜的实施例流程图中，示出了用于识别核和肿瘤区域的荧光信号的通道(诸如，分别为DAPI和染料488通道)使用了下限协议(步骤510、512、520、522)，而用于识别生物标志物的通道(诸如Cy5和Cy3.5通道)则使用了阈值协议(步骤530、540)以用于提供掩膜输出。与下限协议相关联地，还存在用于确定下限的直方图步骤。特别地，直方图阈值(步骤512、522)产生了输入图像的阈值，但却使用了计算尺以确定产生阈值的点。输入是当前图像和用户定义的阈值百分比。后者被用于确定阈值水平应设置的总强度的百分比。首先，将每个像素的强度求和成总强度。将阈值百分比乘以该总强度以获得截止和。最后，按(直方图中的)强度对所有像素进行分组且将其强度从最低到最高地(逐个二进制地)求和直至达到截止和为止。在该过程中访问的最后一个最高的像素强度为针对当前图像的阈值。所有强度大于该值的像素都将其强度设置为最大，而其他像素则被设置为最小。
在图5中被识别为步骤514、516、524、526、528、532、534、536、542、544的步骤表示发生在初始掩膜器(诸如细胞掩膜器212、子集区域掩膜器216、第一生物标志物掩膜器222和第二生物标志物掩膜器224)中的中间步骤。这些步骤被定义如下：
扩大增加了图像中的最亮区域的面积。需要两个输入以进行扩大。第一个是隐式的当前图像，且第二个是用于扩大的迭代次数。假定仅二进制图像被用于第一输入。该程序将对连续图像进行操作，但输出将不会是有效的扩大。扩大过程是通过首先找到图像中的最大像素强度而开始的。随后，图像中的每个像素被检查一次。如果所调查的像素具有等于最大强度的强度，则该像素将在输出图像中被绘制为具有迭代半径且以原始像素为中心的圆。该圆中的所有像素将具有等于最大强度的强度。所有其他像素被无修改地复制到输出图像。
填充孔程序将以最大强度的像素填充图像的“空白”区域。这些空白区域是具有最小强度且其像素面积(大小)是由用户指定的那些区域。当前的图像和大小是所需的两个输入。像扩大一样，这个程序仅适用于二进制图像。
腐蚀按与扩大相同的方式处理图像。所有功能均与扩大相同，除了第一步确定图像中的最小强度，仅更改了与该最低强度相匹配的像素且用最低强度值填充了被用于使所找到的最小强度的像素泛光的圆之外。像扩大一样，这个程序仅适用于二进制图像。
移除对象。预计有两个输入：当前图像和对象大小。移除对象与填充孔的程序相反。任何仅包含填充小于输入对象大小的区域的最大强度的像素的区域将被设置成最小强度且因此被“移除”。该程序仅适用于二进制图像；应用于连续的图像可能产生意料不到的结果。
在最终步骤518、529、538和546处的输出分别是所得到的细胞掩膜、子集区域掩膜(或在该特定实施例中为肿瘤区域掩膜)、生物标志物1细胞掩膜和生物标志物2细胞掩膜。图5进一步描绘了用于计算空间接近度分数的这些所得到的掩膜的组合。下面参考图2中描绘的控制器200的组合掩膜器来描述这些组合。
控制器200被示为包括组合掩膜器，诸如子集细胞掩膜器218、非子集细胞掩膜器220和交互掩膜器230。如图5中的步骤552所示，子集细胞掩膜器执行And操作以将细胞掩膜器212的输出(代表图像中的所有细胞)与子集区域掩膜器216的输出相组合。因此，子集细胞掩膜器生成图像中所有子集细胞的掩膜。在一些实施方案中，子集细胞为肿瘤细胞。在一些这样的实施方案中，子集细胞掩膜器218是肿瘤掩膜器，且非子集细胞掩膜器220是非肿瘤掩膜器。如在图5的步骤554所示，使用由非子集细胞掩膜器220执行的Out操作的这种相同组合在图像中生成了所有非子集细胞的掩膜。在一些实施方案中，非子集细胞为非肿瘤细胞。
在与另一个掩膜组合之前，第一生物标志物掩膜(源于第一生物标志物掩膜器222)是由扩大器226扩大的。扩大的掩膜表示围绕表达第一生物标志物的那些细胞的区域，以便识别其中表达第二生物标志物的细胞会位于与表达第一生物标志物的细胞交互的适当的接近度内的空间。这由图5的步骤556和558表示。图5的流程图示出了发生在两个步骤556和558中的扩大。当每个步骤中的最大迭代次数有限时，这可能是必需的。例如，可能最多有10次迭代(对应于10个像素的增加)，所以当需要增加20个像素时，扩大必须要被分成两个后续步骤。
在第二生物标志物的掩膜器224内，如图5的步骤560所示，可以使用And操作，将生物标志物掩膜与上述非子集细胞掩膜相组合，以生成用于对于第一生物标志物呈阳性的所有非子集细胞的掩膜。然后，在交互掩膜器230处将该掩膜与源于扩大器226的扩大掩膜相组合(步骤562)以生成交互掩膜。交互掩膜识别了对于第二生物标志物呈阳性的且也位于交互面积内或与扩大的掩膜相重叠的非肿瘤细胞。然后，这些识别的细胞表示可以与对于第一生物标志物呈阳性的细胞交互的细胞，从而导致更大的治疗应答。
为了计算空间接近度分数(SPS)，在面积评估器232处以像素确定交互掩膜的面积。在一些实施方案中，在面积评估器234以像素确定能够表达第二生物标志物的所有细胞的面积。能够表达第二生物标志物的细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。在一些实施方案中，在面积评估器234处以像素确定在视野中的所有细胞的面积。在交互计算器236处通过将源于面积评估器232的面积除以源于面积评估器234的面积并乘以预定因子来确定分数。如上所述，在一个实施方案中，由交互计算器236执行的等式是：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且AC是归一化因子。在这里，归一化是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积。在一些实施方案中，归一化因子是所有肿瘤或非肿瘤细胞的总面积。在一些实施方案中，归一化因子是所有细胞的总面积。
And程序是在二进制的AND操作之后建模的，但在重要方面却有所不同。And接受当前的图像和用户选定的结果。输出是通过执行源于两个输入图像的匹配像素的归一化强度的乘法而创建的图像。在一些应用中，图像强度数据是已进行归一化的。因此，And程序只是两个图像的像素方式的乘法。Out所需的两个输入为当前的图像和用户选定的结果。Out根据式A*(1–B/Bmax)来从第一个图像中移除第二个图像，其中A是当前的图像，B是要移除的用户选定的图像，且Bmax是B的最大强度。要注意的是将B除以Bmax来使B归一化。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于对包括取自癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的成像系统，成像系统包括成像装置，成像装置包括用于将样本定位在成像场中的平台，用于指引样本处的电磁辐射的电磁辐射源和被配置成检测源于样本的电磁辐射的检测器，以及控制器。控制器包括用于在操作员和电子控制系统之间交换信息的用户界面；以及被配置成执行在计算机可读介质上存储的指令的处理电路。指令使得成像系统的电子控制系统：(i)接收关于所检测到的源于成像设备的电磁辐射的信息；(ii)基于检测到的电磁辐射生成图像数据；(iii)分析图像数据以确定代表至少一对细胞之间的接近性的分数，该至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(iv)记录分数，当与阈值相比时，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
在一些实施方案中，代表至少一对细胞之间的接近性的分数代表该对细胞在彼此的预定接近度内的程度。
在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括肿瘤细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括非肿瘤细胞。在一些实施方案中，非肿瘤细胞为免疫细胞。在一些实施方案中，非肿瘤细胞为基质细胞。
在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一和第二成员包括免疫细胞。
在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括免疫细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞表达PD-L1且免疫细胞表达PD-1。
在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括肿瘤细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括免疫细胞。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括骨髓细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括免疫细胞。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员包括基质细胞，且至少一对细胞中的第二成员包括免疫细胞。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1且免疫细胞表达PD-1。
在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合所组成的组的第一生物标志物。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合所组成的组的第二生物标志物。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合所组成的组的第一生物标志物，且至少一对细胞中的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合所组成的组的第二生物标志物。
在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1且至少一对细胞中的第二成员表达PD-1。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1且至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4且至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L2且至少一对细胞中的第二成员表达PD-1。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4且至少一对细胞中的第二成员表达CD86。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达LAG-3且至少一对细胞中的第二成员表达HLA-DR。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达TIM-3且至少一对细胞中的第二成员表达半乳凝素9。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达41BB且至少一对细胞中的第二成员表达4.1BBL。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达OX40且至少一对细胞中的第二成员表达OX40L。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达CD40且至少一对细胞中的第二成员表达CD40L。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达ICOS且至少一对细胞中的第二成员表达ICOSL。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达GITR且至少一对细胞中的第二成员表达GITRL。在一些实施方案中，至少一对细胞中的第一成员表达HLA-DR且至少一对细胞中的第二成员表达TCR。
在一些实施方案中，由至少一对细胞中的第一成员表达的第一生物标志物和由至少一对细胞中的第二成员表达的第二生物标志物彼此交互。在一些实施方案中，由至少一对细胞中的第一成员表达的第一生物标志物和由至少一对细胞中的第二成员表达的第二生物标志物彼此不交互。
在一些实施方案中，至少一对细胞之间的空间接近度的范围为约0.5μm至约50μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约50μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约45μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约40μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约35μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约30μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约25μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约20μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为2.5μm至约15μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约50μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约45μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约40μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约35μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约30μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约25μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约20μm。在一些实施方案中，空间接近度的范围为5μm至约15μm。在一些实施方案中，空间接近度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μm。
在一些实施方案中，至少一对细胞之间的空间接近度的范围为约1个像素至约100个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约100个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约90个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约80个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约70个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约60个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约50个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约40个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约5个至约30个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约100个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约90个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约80个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约70个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约60个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约50个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约40个像素。在一些实施方案中，空间接近度的范围为约10个至约30个像素。在一些实施方案中，空间接近度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个像素。在一些实施方案中，像素为0.5μm宽。
在一些实施方案中，生成图像数据包括(i)将关于所检测到的电磁辐射的信息分离成未混合的图像数据；以及(ii)通过多个数据通道提供数据，其中在第一数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第二数据通道中的未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号。
在一些实施方案中，分析数据包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个按下述余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，所述余量足以包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。
在一些实施方案中，分析数据包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，以包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5至约50μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。
在一些实施方案中，分析数据包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个按范围是约1至约100个像素的余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，以包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的以像素测量的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。
在一些实施方案中，分析数据包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个按范围是约1至约100个像素的余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，以包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的以像素测量的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。
在一些实施方案中，空间接近度分数是根据下列等式确定的：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且AC是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积(归一化因子)。
在一些实施方案中，空间接近度分数(SPS)是根据下列等式确定的：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且ANT是非肿瘤细胞的总面积。
在一些实施方案中，空间接近度分数是根据下列等式确定的：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且AT是所有细胞的总面积。
在一些实施方案中，在确定步骤中使用四个荧光标签，每一个均特定于不同的生物标志物。在另外的实施方案中，第一荧光标签与第一生物标志物相关联，第二荧光标签与第二生物标志物相关联，第三荧光标签与第三生物标志物相关联，且第四荧光标签与第四生物标志物相关联。在一些实施方案中，第一生物标志物包括肿瘤和非肿瘤标志物。在一些实施方案中，第二生物标志物包括非肿瘤标志物。在一些实施方案中，第一生物标志物包括肿瘤和非肿瘤标志物，且第二生物标志物包括非肿瘤标志物。在一些实施方案中，第三生物标志物由所有细胞表达。在一些实施方案中，第四生物标志物仅在肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，第三生物标志物由全部细胞表达，且第四生物标志物仅在肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，一个或多个荧光标签包括被缀合至下述抗体的荧光团，所述抗体具有针对特定生物标志物或另一种抗体的结合亲和力。在一些实施方案中，一个或多个荧光标签为具有针对特定生物标志物的亲和力的荧光团。
在一些实施方案中，按范围是约1至约100个像素的余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号。在一些实施方案中，余量是约5至约100个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约90个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约80个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约70个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约60个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约50个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约40个像素。在一些实施方案中，余量是约5至约30个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约100个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约90个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约80个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约70个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约60个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约50个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约40个像素。在一些实施方案中，余量是约10至约30个像素。在一些实施方案中，余量是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个像素。在一些实施方案中，像素为0.5μm宽。
在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约45μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约40μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约35μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约30μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约25μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约20μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约2.5μm至约15μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约45μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约40μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约35μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约30μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约25μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约20μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5μm至约15μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μm内的表达第二生物标志物的位于近侧的细胞。在一些实施方案中，在位于近侧的细胞上的第二生物标志物与第一生物标志物直接接触。
在一些实施方案中，以像素测量表达第二生物标志物的源于选定视野中的每一个的所有细胞的第一总面积。
在一些实施方案中，归一化因子是源于选定的视野中的每一个的所有非肿瘤细胞的第二总面积。在一些实施方案中，第二总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第一总面积和第二总面积均是以像素测量的。
在一些实施方案中，归一化因子是源于选定视野中的每一个的具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。在一些实施方案中，第二总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第一总面积和第二总面积均是以像素测量的。
在一些实施方案中，归一化因子是源于选定的视野中的每一个的所有细胞的第二总面积。在一些实施方案中，第二总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第一总面积和第二总面积均是以像素测量的。
在一些实施方案中，阈值分数为约500至约5000。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约4500。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约4000。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约3500。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约3000。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约2500。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约2000。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约1500。在一些实施方案中，阈值分数为约500至约1000。在一些实施方案中，阈值分数为约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900或5000，其包括其中的增量。在一些实施方案中，阈值分数为约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900或5000，其包括其中的增量，加或减100。
在一些实施方案中，预定因子为约10至约105。在一些实施方案中，预定因子为约102至约105。在一些实施方案中，预定因子为约103至约105。在一些实施方案中，预定因子为约104至约105。在一些实施方案中，预定因子为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或105，其包括其中的增量。
在一些实施方案中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。通过将分数在阈值之上的应答治疗的患者数量除以应答治疗的患者的总数量来计算阳性预测值。通过将分数位于阈值之下的未应答治疗的患者数量除以未应答治疗的患者的总数量来计算阴性预测值。
在一些实施方案中，阳性预测值为大于60％。在一些实施方案中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为80％或更高。在一些实施方案中，阳性预测值为约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，包括其中的增量。
在一些实施方案中，阴性预测值为60％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为70％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为75％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为80％或更高。在一些实施方案中，阴性预测值为约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，包括其中的增量。
在另一个方面中，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统来确定分数的方法，所述分数代表在选自存在于源于包括肿瘤组织的样本的可用的预定数量的视野中的多个细胞的至少一对细胞之间的空间接近度，其中该样本是从癌症患者获取的，该方法包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一特定生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个扩大可归因于第一特定生物标志物的荧光信号，以包含表达第二特定生物标志物的位于近侧的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二特定生物标志物且被包含在可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在另一个方面中，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统来确定分数的方法，所述分数代表在选自存在于源于包括肿瘤组织的样本的可用的预定数量的视野中的多个细胞的至少一对细胞之间的空间接近度，其中该样本是从癌症患者获取的，该方法包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，以包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在另一个方面中，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统来确定分数的方法，所述分数代表在选自存在于源于包括肿瘤组织的样本的可用的预定数量的视野中的多个细胞的至少一对细胞之间的空间接近度，该样本是从癌症患者获取的，且该方法包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个按范围是约1至约100个像素的余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，以包含表达第二生物标志物的位于近侧的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的以像素测量的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在另一个方面中，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统来确定分数的方法，所述分数代表在选自存在于源于包括肿瘤组织的样本的可用的预定数量的视野中的多个细胞的至少一对细胞之间的空间接近度，该样本是从癌症患者获取的，且该方法包括：(i)从用多个荧光标签染色的包括从癌症患者获取的肿瘤组织的样本选择可用的预定数量的视野，该选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)为选定视野中的每一个按范围是约1至约100个像素的余量扩大可归因于第一生物标志物的荧光信号，以包含在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将源于选定视野中的每一个的所有下述细胞的以像素测量的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达第二生物标志物且被包含在可归因于表达第一生物标志物的细胞的扩大的荧光信号内。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在一些实施方案中，空间接近度分数(SPS)是根据下列等式确定的：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且ANT是非肿瘤细胞的总面积。
在一些实施方案中，空间接近度分数是根据下列等式确定的：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且AC是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积。
在另一方面中，公开了在患者中治疗癌症的方法中使用的、利用包括成像装置和控制器的系统来对样本评分的方法，所述样本包括源于癌症患者的肿瘤组织。在一些实施方案中，对包括源于癌症患者的肿瘤组织的样本进行评分的方法是在施加免疫疗法之前执行的。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在一些实施方案中，空间接近度分数是根据下列等式确定的：
其中AI是总交互面积(表达第二特定生物标志物且由可归因于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大的荧光信号包含的细胞的总面积)且AT是所有细胞的总面积。
在一些实施方案中，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统在有需要的患者体内治疗癌症的方法，该方法包括：(a)对包括从患者获取的肿瘤组织的样本进行评分，其包括(i)使用包括从患者获取的肿瘤组织的样本，确定代表至少一对细胞之间的空间接近度的分数，该至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(ii)记录分数；(b)将该分数与阈值进行比较；以及(b)如果当与阈值进行比较时该分数表示患者将对免疫疗法有积极应答的可能性，则对患者施加免疫疗法。在一些实施方案中，确定步骤如本文所述。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在一些实施方案中，本文公开了对组织样本进行评分的方法，其包括：(i)使用成像系统获得针对从癌症患者获取的组织样本的图像数据，该成像系统包括：壳体，其包括用于将样本定位在成像场中的平台，用于指引样本处的电磁辐射的电磁辐射源和用于收集电磁辐射输出的检测器；以及电子控制系统，其包括存储器和具有图像处理模块的处理电路；
(ii)使用图像处理模块分析图像数据以确定代表一对细胞之间的接近性的分数，该对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；(iii)将分数记录在存储器中，当与阈值相比时，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
在一些实施方案中，本文公开了组织样本评分系统，其包括：成像装置，其获得从癌症患者获取的组织样本的图像数据；以及控制器，其接收源于成像装置的图像数据并分析数据以确定代表在一对细胞之间的接近性的分数，该至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且该至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；其中，当与阈值相比时，该分数表示癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。在一些实施方案中，与第一特定生物标志物的表达的定量或第二特定生物标志物的表达的定量相比，该方法提供了更优越的预测能力。
实施例
实施例1、用于源于人类患者的黑素瘤组织样本的样本制备、成像和成像分析。
样本制备。使福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡。然后，在蒸馏水中进行孵育之前，使载玻片通过一系列的二甲苯至醇的洗涤液进行再水合。然后，使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原修复，允许其冷却并将其转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，阻断内源性过氧化物酶，然后用蛋白封闭溶液孵育以减少非特定的抗体染色。接下来，用小鼠抗PD1的一抗对载玻片进行染色。然后在用抗小鼠HRP二抗进行孵育之前洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后使用TSA+3.5(Perkin Elmer)检测PD-1染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭任何残留的HRP。在用兔抗PD-L1的一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，且然后用以488染料和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)直接标记的抗兔HRP二抗加上小鼠抗S100的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(Perkin Elmer)检测PD-L1染色。在用包埋介质进行盖片之前最后一次洗涤载玻片，且允许其在室温下干燥过夜。图6显示了抗体和检测试剂的示意图。替代地，用抗CD8的一抗代替抗PD1的一抗来对载玻片进行染色。
样本成像和分析。然后使用Vectra2智能载玻片分析系统，使用Vectra软件版本2.0.8版(Perkin Elmer)来获取荧光图像。首先，进行使用DAPI的以4倍倍率进行的载玻片的单色成像。使用自动算法(使用inForm开发的)来识别包含组织的载玻片的区域。
被识别为含有组织的载玻片的区域以4倍的倍率针对与DAPI(蓝色)、FITC(绿色)和5(红色)相关联的通道进行成像，以用于创建RGB图像。这些4倍的图像在视野选择器101中使用自动富集算法(使用inForm开发的)进行处理以识别和排列根据最高5表达的可能的20倍倍率的视野。
前40个视野在DAPI、FITC、德克萨斯红和5波长下以20倍的倍率进行成像。复查原始图像的可接受性，且在分析之前拒绝未聚焦的、缺乏任何肿瘤细胞的、高度坏死的或包含与预期的抗体定位不相关联的高水平的荧光信号(即背景染色)的图像。使用AQUAduct(Perkin Elmer)处理接受的图像，其中每个荧光团是通过光谱解混器210被光谱解混成各个通道并被保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的全自动过程来进一步分析处理过的文件。详情如下。
每个DAPI图像由细胞掩膜器212处理，以识别在该图像内的所有细胞核(图7a)，且随后扩大3个像素以表示整个细胞的大致尺寸。这样产生的掩膜表示在该图像内的所有细胞(图7b)。
以488染料检测的S100(针对黑素瘤的肿瘤细胞标志物)(图8a)由子集掩膜器216处理，以创建在该图像内的所有肿瘤区域的二元掩膜(图8b)。在该掩膜和所有细胞的掩膜之间的重叠使用肿瘤细胞掩膜器218创建了针对肿瘤细胞的新掩膜(图8c)。
类似地，缺乏与所有核的掩膜相组合的肿瘤细胞掩膜器创建了针对所有非肿瘤细胞的新掩膜(图8d)，这是使用非肿瘤细胞掩膜器220执行的。
每个5图像(图9a)由第一生物标志物掩膜器222处理，且与所有细胞的掩膜相重叠以创建PD-L1阳性的所有细胞的二元掩膜(图9b)。使生物标志物掩膜与所有细胞的掩膜相重叠消除了可能在掩膜中被错误地识别为生物标志物阳性细胞的噪声像素。
每个3.5图像(图10a)由第二生物标志物掩膜器224处理以创建针对PD-1阳性细胞的二元掩膜，且与所有非肿瘤细胞的掩膜相重叠以创建PD-1阳性的所有非肿瘤细胞的二元掩膜(图10b)。使生物标志物掩膜与所有非肿瘤细胞的掩膜相重叠，消除了可能在掩膜中被错误地识别为生物标志物阳性细胞的噪声像素。
所有PD-L1阳性细胞的二元掩膜使用第二扩大器226进行扩大以创建包含最接近的邻居细胞(例如，具有PD-1的细胞)的交互掩膜(图11a)。该交互掩膜使用交互掩膜器230与所有PD-1阳性非肿瘤细胞的二元掩膜相组合以创建足够接近PD-L1阳性细胞的PD-1阳性细胞的交互隔室，以使得PD-1可能与PD-L1进行交互(图11b)。
分别在面积评估器232、234计算源于针对交互隔室的所有接受的视野(高达40个视野)的总面积和非肿瘤细胞的总面积。使用交互计算器236将源于针对交互隔室的所有接受的视野的总面积除以非肿瘤细胞的总面积且乘以为10,000的因子，以创建表示针对每个样品的交互分数的整数。PD-L1和PD-1的测量具有高度的再现性(R2分别＝0.98和0.97)。在档案临床样品(n＝53)中观察到了广泛的PD-L1和PD-1表达和交互分数。在用尼鲁单抗(n＝5)或派姆单抗(n＝21)治疗的26名晚期黑素瘤患者的队列中，发现PD-1/PD-L1交互分数可靠地将应答者与非应答者区分开(p＝0.01)，而仅PD-L1(p＝0.07)或仅CD8(p＝0.23)则未实现区分。额外地，表现出较高PD-1/PD-L1交互分数的患者具有更优越的应答率(82％vs.20％，p＝0.01)。与具有较低PD-1/PD-L1交互分数的患者相比，具有高PD-1/PD-L1交互分数的患者经历了较长的中值无进展生存期(p＝0.059)和更少的死亡(22％与58％)。这些结果表明，与仅用PD-L1表达相比，这种对组织样本进行评分以获得PD-1/PD-L1交互分数的方法提供了更优越的预测能力(82％阳性预测值、80％阴性预测值)。
在图12a中示出了源于26名患者的代表性分数。根据该数据，选择为800-900的阈值来表示对治疗有应答的可能性。
替代地，为每一个个别视野计算交互分数且在图12b中展示了针对每名患者的最大分数。根据该最大分数，选择为1900的阈值来表示对治疗有应答的可能性。
为了评估富集算法对交互分数的影响，使用全载玻片成像代替富集算法来执行上述程序(见图13)。当进行全载玻片图像分析时，在对抗PD1疗法有应答的患者和没有应答的那些患者之间不再存在统计学显著性差异。因此，无法用该分析确定阈值。
将交互分数与患者的无进展生存期(PFS)进行比较(图14)。至少为803的交互分数与生存期有良好的关联性。值得注意地，PD-L1表达与改进的PFS不相关(图15)。
图16和17示出了表示PD-L1阳性细胞(红色)、PD-L阳性细胞(黄色)、肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)的重叠掩膜的代表性实施例。对于免疫治疗的阳性应答者而言，在图16中的掩膜很容易地指出PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1阳性细胞(黄色)和所有肿瘤细胞(绿色)的存在。相反地，对于免疫治疗的阴性应答者而言，在图17中的掩膜指出肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)的存在，但却显示很少到无的PD-L1阳性细胞(红色)或PD-1阳性细胞(黄色)。图16表示为2176的交互分数(对免疫疗法完全应答)。图17表示为8的交互分数(对免疫疗法无应答)。
还使用了FDA批准的方法评估组织样本以测量在具有抗PD-L1抗体克隆22C3的非小细胞肺癌中的PD-L1，这目前未被用于黑素瘤组织样品。将PD-L1表达与患者PFS进行比较并显示在图19中。与使用交互分数的本文所述的方法相比，该方法没有显示出在统计学上相关的诊断值。
检查了34名额外的转移性黑素瘤患者的验证队列并获得了PD-1/PD-L1交互分数(见图20a)。还将这些交互分数与患者的无进展生存期(PFS)进行比较(图20b)。尽管没有统计学意义(p＝0.19)，但该比较表示具有较高的PD-1/PD-L1交互分数的患者具有更长的PFS的趋势。统计显著性可能受到限制，由于这些疗法在临床上的使用相对近期并因而限制了对这些患者的随访时间。
在图20c至20e中示出了针对之前26名患者的队列与34名患者的验证队列的组合的PD-1/PD-L1交互分数以及这些分数与患者的PFS或患者的总生存期(OS)的比较。组合分析清楚地表明具有高PD-1/PD-L1的患者表现出对抗PD-1疗法的改进的应答。
实施例2、用于源于人类患者的非小细胞肺癌组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，其用以488染料直接标记的小鼠抗泛细胞角蛋白来替代以488染料直接标记的小鼠抗S100以用于上皮肿瘤样本。在图18中示出了针对38个样本的交互分数。
实施例3、用于具有表达PD-L1的细胞和表达CD80的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
样本制备使福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡，再水合并以提高的温度条件执行抗原修复。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先使用(Advanced Cell Diagnostics)，使用20对跨越约1kb的CTLA-4 mRNA的杂交探针来对组织进行CTLA-4表达检测。用TSA-3使原位杂交显色。洗涤载玻片且然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭任何残留的HRP。在用小鼠抗CD80一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片然后用抗小鼠HRP二抗进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(Perkin Elmer)检测CD80染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭任何残留的HRP。在用兔抗CD3的一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后用抗兔HRP二抗加上4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-(Life Technologies)检测CD3染色。在用包埋介质进行盖片之前最后一次洗涤载玻片，且允许其在室温下干燥过夜。
执行与实施例1相类似的成像和分析程序，该成像是跨越DAPI、FITC、3和5波长进行的。使用CTLA-4和CD80的表达来开发用于获取20倍图像的富集算法。执行分析以确定CTLA-4/CD80交互分数，这是通过测量以像素计的接近CD80阳性细胞的CTLA-4和CD3阳性细胞的总面积，除以以像素计的CD3阳性细胞的总面积且乘以为10,000的因子来进行的。在图21中示出了结果。
实施例4、用于具有表达CTLA-4的细胞和表达CD80的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用CTLA-4和CD80的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例5、用于具有表达PD-L2的细胞和表达PD-1的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用PD-L2的染色和分析来替代PD-L1的染色和分析。
实施例6、用于具有表达CTLA-4的细胞和表达CD86的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用CTLA-4和CD86的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例7、用于具有表达LAG-3的细胞和表达HLA-DR的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用LAG-3和HLA-DR的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例8、用于具有表达TIM-3的细胞和表达半乳凝素9的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用TIM-3和半乳凝素9的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例9、用于具有表达41BB的细胞和表达4.1BBL的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用41BB和4.1BBL的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例10、用于具有表达OX40的细胞和表达OX40L的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用OX40和OX40L的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例11、用于具有表达CD40的细胞和表达CD40L的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用CD40和CD40L的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例12、用于具有表达ICOS的细胞和表达ICOSL的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用ICOS和ICOSL的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例13、用于具有表达GITR的细胞和表达GITRL的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用GITR和GITRL的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例14、用于具有表达HLA-DR的细胞和表达TCR的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序，用HLA-DR和TCR的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例15、用于具有表达PD-1、PD-L1和CD3的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例1相类似的程序但不使用小鼠抗S100抗体。相反地，在PD-L1检测之后，经微波去除一抗和二抗。然后，用兔抗CD3的一抗对载玻片进行染色。洗涤载玻片，然后用抗兔HRP二抗加上4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后用TSA-AlexaFluor488(Life Technologies)检测CD3染色。成像和分析类似于实施例1，其中通过将按像素测量的在PD-L1阳性面积中的PD-1阳性细胞的面积除以按像素测量的所有有核细胞的面积并乘以为10,000的因子来计算空间接近度(例如，交互分数)。在图22中示出了针对29个样本的交互分数。
可以通过控制器1900执行对源于成像装置100的图像数据的操纵，用于如本文所述的导出组织样本的生物标志物阳性百分比值，如在图23中示意性示出的。控制器1900被示为包括通信接口1902和处理电路1904。处理电路1904被配置成实施用于确定生物标志物阳性百分比的步骤。可以考虑的是，控制器1900的元件和功能可以被包括在成像装置100的控制器150中，或可以存在于与成像装置100相分离的计算系统中。
在一些实施方案中，可以使用对特定生物标志物具有亲和力的多个荧光标签对样本进行染色。可以获得染色样本的数字图像，且基于荧光标签的位置进一步分析图像。可以基于表达感兴趣的第一生物标志物的细胞的数量来对视野进行优先化而不是进行全图像分析。然后，可以针对荧光信号进一步分析预定数量的视野。在一些实施方案中，操纵荧光信号的图像以生成对应于图像内的细胞的荧光信号的一个或多个掩膜。在一些实施方案中，荧光信号的一个或多个掩膜包括选自由以下所组成的组中的一个或多个：图像内所有细胞的掩膜、图像内表达子集生物标志物的所有细胞(例如，所有肿瘤细胞)的掩膜、图像内不表达子集生物标志物的所有细胞(例如，所有非肿瘤细胞)的掩膜、图像内表达感兴趣的第一生物标志物的所有细胞的掩膜以及表示表达生物标志物的感兴趣的所有细胞的生物标志物阳性掩膜。根据需要，这些掩膜的面积可以被用于导出用于PBP的值。生物标志物掩膜的总面积可以被用于通过将针对感兴趣的细胞类型的生物标志物掩膜的面积除以在感兴趣的隔室中的所有细胞的面积来计算生物标志物阳性值百分比。
图24是描绘了用于导出用于％生物标志物阳性(PBP)的值的方法的一个实施方案的步骤的流程图。在步骤2001中，获得图像数据，且在步骤2002中，将图像数据解混合，以使得将特定于各种类型的荧光信号的数据分离成不同的通道。在步骤2003中，使用源于第一通道的数据来生成所有细胞的掩膜。在步骤2004中，使用源于第二通道的数据来生成在表达子集生物标志物的视野中的区域的掩膜，例如，该子集掩膜可以是存在于视野中的肿瘤区域掩膜。在步骤2005中，所有细胞掩膜和子集掩膜(例如，肿瘤区域掩膜)相组合以生成所有子集细胞的掩膜。在某些实施方案中，将所有细胞掩膜与子集掩膜进行组合可以识别所有肿瘤细胞和/或所有非肿瘤细胞。
在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于肿瘤细胞和非肿瘤细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于活细胞和非活细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集是活细胞子集，且细胞的非子集是由不包括在活细胞子集中的活细胞组成的。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于T细胞和非T细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，由子集生物标志物识别的细胞子集和细胞的非子集分别对应于骨髓细胞和非骨髓细胞，或反之亦然。
可以仅对感兴趣的选定类型的细胞(例如仅对肿瘤细胞或仅对非肿瘤细胞)进行该过程。该过程也可以针对这两种细胞的分析。在步骤2006中，源于第三通道的数据被用于生成对生物标志物呈阳性的所有细胞的掩膜(基于表示具有与感兴趣的特定生物标志物的结合的亲和力的荧光标签的存在的荧光信号)。在步骤2007和2008中，将在步骤2006中生成的生物标志物掩膜与在步骤2005中生成的子集细胞掩膜相组合。步骤2007以第一方式将生物标志物掩膜与子集细胞掩膜相组合，以生成对生物标志物呈阳性的所有子集细胞的掩膜。步骤2008以第二方式将生物标志物掩膜与子集细胞掩膜相组合，以生成对生物标志物不呈阳性的所有子集细胞的掩膜。步骤2007和2008中的一个或两个可以根据本方法的各种实施方案进行执行。在步骤2009/2010中，通过将感兴趣的子集细胞(例如，由步骤2007中创建的掩膜识别的对生物标志物呈阳性的子集细胞或由步骤2008中创建的掩膜识别的对生物标志物不呈阳性的子集细胞)的面积除以感兴趣的所有细胞的总面积来计算PBP分数。步骤2009计算用于对生物标志物呈阳性的子集细胞的PBP。步骤2010计算用于对生物标志物不呈阳性的子集细胞的PBP。步骤2009和2010中的一个或两个可以根据本方法的各种实施方案进行执行。
图25是描绘了用于导出针对％生物标志物阳性(PBP)的值的方法的第二实施方案的步骤的流程图。在步骤2101中，获得图像数据，且在步骤2102中，将图像数据解混合，以使得将特定于各种类型的荧光信号的数据分离成不同的通道。在步骤2103中，使用源于第一通道的数据来生成所有细胞的掩膜。在步骤2104中，源于第二通道的数据被用于生成对生物标志物呈阳性的所有细胞的掩膜(基于表示具有与感兴趣的特定生物标志物的结合的亲和力的荧光标签的存在的荧光信号)。在步骤2105中，通过将对生物标志物呈阳性的细胞的面积(由步骤2104中创建的掩膜所识别)除以感兴趣的所有细胞的总面积(得自步骤2103的)来计算PBP分数。图25的过程可以与图24中所描绘的方法分开或同时进行。换句话说，可以为所有细胞、所有肿瘤细胞和所有非肿瘤细胞或其任何组合计算PBP分数，其可以组合图24和25的方法。
在图23中，控制器1900被示为包括通信接口1902和处理电路1904。通信接口1902可以包括用于与各种系统、装置或网络进行数据通信的有线或无线接口(例如，插孔、天线、发射器、接收器、收发器、有线终端等)。例如，通信接口1902可以包括用于经基于以太网的通信网络发送和接收数据的以太网卡和端口和/或用于经无线通信网络进行通信的WiFi收发器。通信接口1902可以被配置成经局域网或广域网(例如，因特网、建筑物WAN等)进行通信且可以使用各种通信协议(例如，BACnet、IP、LON等)。通信接口1902可以是被配置成促进在控制器1900和各种外部系统或装置(例如，成像装置100)之间的电子数据通信的网络接口。例如，控制器1900可以接收源于成像装置100的用于选定视野的成像数据以分析数据并计算生物标志物阳性百分比。
处理电路1904被示为包括处理器1906和存储器1908。处理器1906可以是通用或专用处理器、专用集成电路(ASIC)、一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)、一组处理组件或其他合适的处理组件。处理器506可以被配置成执行在存储器508中存储的或从其他计算机可读介质(例如，CDROM、网络存储器、远程服务器等)接收的计算机代码或指令。
存储器1908可以包括用于存储用于完成和/或促进在本公开中描述的各种进程的数据和/或计算机代码的一个或多个装置(例如，存储器单元、存储器装置、存储装置等)。存储器1908可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬盘驱动器存储器、临时存储器、非易失性存储器、闪存、光存储器或用于存储软件对象和/或计算机指令的任何其他合适的存储器。存储器1908可以包括数据库组件、目标代码组件、脚本组件或用于支持在本公开中描述的各种活动和信息结构的任何其他类型的信息结构。存储器508可以经处理电路1904被可通信地连接至处理器1906且可以包括用于执行(例如，通过处理器1906执行)本文描述的一个或多个进程的计算机代码。
仍然参考图23，控制器1900被示为接收源于成像装置100的输入。成像装置获取所有成像数据并将所述成像数据与描述所述成像数据的所有元数据一起记录下来。成像装置然后将数据串行化成能够由控制器1900读取的流。数据流可以适应任何二进制数据流类型，诸如文件系统、RDBM或直接TCP/IP通信。为了使用数据流，控制器1900被示为包括光谱解混器1910。光谱解混器1910可以接收源于成像装置100的图像数据，其对该图像数据执行光谱解混以将呈现各种波长的图像解混成针对每个波长带的各个离散通道。例如，图像数据可以被“解混”成用于识别组织样本中感兴趣的细胞或蛋白质的各种荧光团中的每一种的单独通道。仅举例来说，荧光团可以是由DAPI、2、3、3.5、5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料和德克萨斯红所组成的组中的一个或多个。在一个示例中，通道之一可以包括落在围绕461nm的波长(DAPI的最大发射波长)的预定带内的图像数据，以识别图像中的核。其他通道可以包括针对不同波长的图像数据以使用不同的荧光团来识别组织样本的不同部分。
控制器1900还被示为包括各种掩膜器，诸如细胞掩膜器1912、子集区域掩膜器216和生物标志物掩膜器1922。这些掩膜器或在其他实施方案中可以包括在控制器1900中的其他掩膜器被用于接收源于光谱解混器1910的未混合的信号，并根据被用于识别组织样本中感兴趣的某些特性的荧光团来创建针对感兴趣的特定细胞或区域的掩膜。为了创建掩膜，掩膜器(诸如细胞掩膜器1912、子集区域掩膜器1916和生物标志物掩膜器1922)接收与视野中的每个像素的强度相关的图像数据。像素强度与样本发射的荧光量成正比，其转而与样本中的蛋白生物标志物的量成正比(当使用荧光团来识别特定生物标志物时)。可以基于图像像素中存在的值来设置绝对阈值。所有大于或等于阈值的像素将被映射为1.0或“开”，且所有其他像素将被映射为0.0或“关”。以这种方式，创建二元掩膜以识别视野中感兴趣的细胞或组织部分。在其他实施方案中，使用下限创建掩膜，其中具有处于或高于下限的强度的所有像素均被接受且被用作该掩膜的像素值。如果强度低于下限，则将像素值设置为0.0或“关”。在图26中所示的用于掩膜的实施例流程图中，示出了DAPI和488染料通道(或分别用于识别核和肿瘤区域的其它荧光团)使用下限协议(步骤2210、2212、2220、2222)，而Cy5通道(或用于识别感兴趣的生物标志物的其他荧光团)则使用阈值协议(步骤2230)，以用于提供掩膜输出。与下限协议相关联地，还存在用于确定下限的直方图步骤。特别地，直方图阈值(步骤2212、2222)产生了输入图像的阈值，但却使用了计算尺以确定产生阈值的点。输入是当前图像和用户定义的阈值百分比。后者被用于确定阈值水平应设置的总强度的百分比。首先，将每个像素的强度求和成总强度。将阈值百分比乘以该总强度以获得截止和。最后，按(直方图中的)强度对所有像素进行分组且将其强度从最低到最高地(逐个二进制地)求和直至达到截止和为止。在该过程中访问的最后一个最高的像素强度为用于当前图像的阈值。所有强度大于该值的像素都将其强度设置为最大，而其他像素则被设置为最小。
在图26中被识别为步骤2214、2216、2224、2226、2228、2232、2234、2236的步骤表示发生在初始掩膜器，诸如细胞掩膜器1912(步骤2214、2216)、子集区域掩膜器1916(步骤2224、2226、2228)和生物标志物掩膜器1922(步骤2232、2234、2236)中的中间步骤。这些步骤被定义如下：
扩大增加了图像中的最亮区域的面积。需要两个输入以进行扩大。第一个是隐式的当前图像，且第二个是用于扩大的迭代次数。假定仅二进制图像被用于第一输入。该程序将对连续图像进行操作，但输出将不会是有效的扩大。扩大过程是通过首先找到图像中的最大像素强度而开始的。随后，图像中的每个像素被检查一次。如果所调查的像素具有等于最大强度的强度，则该像素将在输出图像中被绘制为具有迭代半径且以原始像素为中心的圆。该圆中的所有像素将具有等于最大强度的强度。所有其他像素被无修改地复制到输出图像。
填充孔的程序将以最大强度的像素填充图像的“空白”区域。这些空白区域是具有最小强度且其像素面积(大小)是由用户指定的那些区域。当前的图像和大小是所需的两个输入。像扩大一样，这个程序仅适用于二进制图像。
腐蚀按与扩大相同的方式处理图像。所有功能均与扩大相同，除了第一步确定图像中的最小强度，仅更改了与该最低强度相匹配的像素且用最低强度值填充了被用于使所找到的最小强度的像素泛光的圆之外。像扩大一样，这个程序仅适用于二进制图像。
移除对象。预计有两个输入：当前图像和对象大小。移除对象与填充孔的程序相反。任何仅包含填充小于输入对象大小的区域的最大强度的像素的区域将被设置成最小强度且因此被“移除”。该程序仅适用于二进制图像；应用于连续的图像可能产生意料不到的结果。
在步骤2218、2229和2238处的输出分别是所得到的细胞掩膜、子集掩膜(或在该特定实施例中为肿瘤区域掩膜)和生物标志物细胞掩膜。图26还描述了用于获得用于PBP值的相关区域信息的这些得到的掩膜的组合。下面参考图23中描绘的控制器1900的组合掩膜器来描述这些组合。
控制器1900被示为包括组合掩膜器，诸如子集细胞掩膜器1918、非子集细胞掩膜器1920和组合掩膜器1930。在一些实施方案中，由掩膜器1918识别的子集细胞和由掩膜器1920识别的非子集细胞分别是肿瘤细胞和非肿瘤细胞。在一些这样的实施方案中，子集细胞掩膜器1918是肿瘤掩膜器，且非子集细胞掩膜器1920是非肿瘤掩膜器。如图26中的步骤2252所示，子集细胞掩膜器执行And操作以将细胞掩膜器1912的输出(代表图像中的所有细胞)与子集区域掩膜器1916的输出相组合。因此，子集细胞掩膜器生成图像中所有子集细胞的掩膜。如在图26的步骤2254所示，使用由非子集细胞掩膜器1920执行的Out操作的这种相同组合在图像中生成了所有非子集细胞的掩膜。
组合掩膜器1930被配置成组合两个输入掩膜。如图26中所示，组合掩膜器1930将生物标志物掩膜与子集细胞掩膜(源于子集细胞掩膜器1918)或非子集细胞掩膜(源于非子集细胞掩膜器1920)之一相组合，或组合生物标志物掩膜+子集掩膜和生物标志物掩膜+非子集掩膜二者。虚线表示细胞掩膜中的任一个或两个可以在组合掩膜器1930处与生物标志物掩膜相组合。组合掩膜器1930的结果是代表对生物标志物呈阳性的所有子集细胞和/或对生物标志物呈阳性的所有非子集细胞的掩膜。组合掩膜器1930可以按替代的方式组合掩膜，以使得组合掩膜器1930的结果是代表对生物标志物不呈阳性(即，生物标志物阴性)的子集细胞的掩膜。如果感兴趣的细胞与该子集不具有特异的相关性，例如，肿瘤或非肿瘤细胞而不是所有细胞，那么生物标志物阳性掩膜则不与任何额外的掩膜进行组合且在不进行修改的情况下通过组合掩膜器1930。
为了计算％生物标志物阳性分数(PBP)，在面积评估器1932处以像素确定选定的子集细胞(例如全部、肿瘤或非肿瘤)生物标志物阳性掩膜或生物标志物阴性掩膜(其中，分数表示生物标志物阴性)的面积。在面积评估器1932处以像素确定所有选定细胞(对于生物标志物呈阳性的和非阳性的)的总面积。终止于面积评估器1932处的虚线指出总面积输入可以是要单独计算的所有细胞掩膜、子集细胞掩膜和非子集掩膜中的一个或多个。在阳性计算器1936确定百分比生物标志物阳性分数。在一个实施方案中，通过将得自面积评估器1932的选定的细胞生物标志物阳性掩膜的面积除以得自面积评估器1932的所有选定细胞掩膜的面积并乘以100来计算BPB值。在一个实施方案中，由交互计算器1936执行的等式是：
其中，AP是选定类型的子集细胞(例如，全部、肿瘤或非肿瘤)的生物标志物阳性面积，且AA是选定的细胞类型(全部、肿瘤、非肿瘤)的所有细胞的总面积。在一些实施方案中，AN代替上述等式中的AP，其中AN是选定类型的细胞(例如，全部、肿瘤或非肿瘤)的生物标志物阴性面积，以确定代表该类型的子集细胞的生物标志物阴性百分比的分数。
And程序是在二进制的AND操作之后建模的，但在重要方面却有所不同。And接受当前的图像和用户选定的结果。输出是通过执行源于两个输入图像的匹配像素的归一化强度的乘法而创建的图像。在一些情况下，图像强度数据是已进行归一化的。因此，And程序只是两个图像的像素方式的乘法。
Out所需的两个输入为当前的图像和用户选定的结果。Out根据式A*(1–B/Bmax)来从第一个图像移除第二个图像，其中A是当前的图像，B是要移除的用户选定的图像，且Bmax是B的最大强度。要注意的是将B除以Bmax来使B归一化。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于导出针对存在于从癌症患者获取的组织样本的视野中的所有细胞或可选地其一个或多个子集的％生物标志物阳性(PBP)值的成像系统，所述成像系统包括成像设备，成像设备包括用于将样本定位在成像场中的平台、用于指引样本处的电磁辐射的电磁辐射源和被配置成检测源于样本的电磁辐射的检测器，以及控制器。控制器包括用于在操作员和电子控制系统之间交换信息的用户界面，以及被配置成执行在计算机可读介质上存储的指令的处理电路。指令使得成像系统的电子控制系统：(i)接收关于所检测到的源于成像设备的电磁辐射的信息；(ii)基于检测到的电磁辐射生成图像数据；(iii)分析图像数据以导出针对存在于视野中的所有细胞或可选地其一个或多个子集的PBP值。
在一些实施方案中，分析数据包括：
(i)生成代表存在于视野中的所有细胞的核的第一荧光信号的图像，并将第一荧光信号扩大至整个细胞的直径以构建存在于视野中的所有细胞的第一掩膜；
(ii)构建代表表达子集生物标志物的存在于视野中的所有区域的第二荧光信号的第二掩膜；
(iii)可选地，构建代表表达感兴趣的第一生物标志物的存在于视野中的所有区域的第三荧光信号的第三掩膜；
(iv)按提供第四掩膜的方式组合该第一和第二掩膜，所述第四掩膜包括代表也表达子集生物标志物的在视野中的所有细胞的荧光信号；
(v)可选地，按提供第五掩膜的方式组合该第一和第三掩膜，所述第五掩膜包括代表也表达感兴趣的第一生物标志物的在视野中的所有细胞的第一子集的荧光信号；
(vi)通过将第四掩膜的总面积除以第一掩膜的总面积来导出针对表达子集生物标志物的所有细胞的PBP值；
(vii)可选地，按提供第六掩膜的方式组合该第四和第五掩膜，所述第六掩膜包括代表表达子集生物标志物和感兴趣的第一生物标志物的在视野中的所有细胞的第一子集的荧光信号；
(viii)可选地，通过将第六掩膜的总面积除以第四掩膜的总面积来导出针对表达子集生物标志物和感兴趣的第一生物标志物的所有细胞的第一子集的PBP值。
在一些实施方案中，分析数据包括：
(i)生成代表存在于视野中的所有细胞的核的第一荧光信号的图像，并将第一荧光信号扩大至整个细胞的直径以构建存在于视野中的所有细胞的第一掩膜；
(ii)构建代表表达子集生物标志物的存在于视野中的所有区域的第二荧光信号的第二掩膜；
(iii)可选地，构建代表表达感兴趣的第一生物标志物的存在于视野中的所有区域的第三荧光信号的第三掩膜；
(iv)按提供第四掩膜的方式组合该第一和第二掩膜，所述第四掩膜包括代表也表达子集生物标志物的在视野中的所有细胞的荧光信号；
(v)可选地，按提供第五掩膜的方式组合该第一和第三掩膜，所述第五掩膜包括代表也表达感兴趣的第一生物标志物的在视野中的所有细胞的荧光信号；
(vi)通过将第四掩膜的总面积除以第一掩膜的总面积来导出用于表达子集生物标志物的所有细胞的PBP值；
(vii)可选地，按提供第六掩膜的方式组合该第四和第五掩膜，所述第六掩膜包括代表在视野中的所有下述细胞的荧光信号，该细胞
(a)表达子集生物标志物和感兴趣的第一生物标志物；或
(b)在缺乏感兴趣的第一生物标志物的情况下，表达子集生物标志物；
以及
(viii)可选地，通过将第六掩膜的总面积除以第四掩膜的总面积来导出针对所有下述细胞的第一子集的PBP值，所述细胞(a)表达子集生物标志物和感兴趣的第一生物标志物或(b)在缺乏感兴趣的第一生物标志物的情况下，表达子集生物标志物。
在一些实施方案中，不执行可选步骤。在一些实施方案中，执行所有所述的可选步骤。在一些实施方案中，总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第四掩膜的总面积和第一掩膜的总面积中的每一个是以像素进行测量的。在一些实施方案中，第六掩膜的总面积和第四掩膜的总面积中的每一个是以像素进行测量的。在一些实施方案中，第一掩膜的总面积、第四掩膜的总面积和第六掩膜的总面积中的每一个是以像素进行测量的。在一些实施方案中，像素为0.5μm宽。
在一些实施方案中，分析数据还包括：
(ix)构建代表表达感兴趣的第二生物标志物的存在于视野中的所有区域的第四荧光信号的第七掩膜；
(x)按提供第八掩膜的方式组合该第一和第七掩膜，所述第八掩膜包括代表也表达感兴趣的第二生物标志物的在视野中的所有细胞的第二子集的荧光信号；
(xi)按提供第九掩膜的方式组合该第四和第八掩膜，所述第八掩膜包括代表表达子集生物标志物和感兴趣的第二生物标志物的在视野中的所有细胞的第二子集的荧光信号；以及
(xii)通过将第九掩膜的总面积除以第四掩膜的总面积来导出针对所有下述细胞的第二子集的PBP值，所述细胞表达子集生物标志物和感兴趣的第二生物标志物。
在一些实施方案中，总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第九掩膜的总面积和第四掩膜的总面积中的每一个是以像素进行测量的。在一些实施方案中，像素为0.5μm宽。
在一些实施方案中，分析数据还包括：
(ix)构建代表表达感兴趣的第二生物标志物的存在于视野中的所有区域的第四荧光信号的第七掩膜；
(x)以提供第八掩膜的方式从该第一掩膜减去该第二掩膜，所述第八掩膜包括代表在视野中不表达子集生物标志物的所有细胞的荧光信号；
(xi)按提供第九掩膜的方式组合该第七和第八掩膜，所述第九掩膜包括代表表达感兴趣的第二生物标志物但却不表达子集生物标志物的在视野中的所有细胞的荧光信号；以及
(xii)通过将第九掩膜的总面积除以第八掩膜的总面积来导出针对表达感兴趣的第二生物标志物但不表达子集生物标志物的所有细胞的PBP值。
在一些实施方案中，该方法还包括：
(ix)构建代表表达感兴趣的第二生物标志物的存在于视野中的所有区域的第四荧光信号的第七掩膜；
(x)按提供第八掩膜的方式组合该第六和第七掩膜，所述第八掩膜包括代表满足下列条件的所有细胞的荧光信号，
(a)在视野中表达子集生物标志物、感兴趣的第一生物标志物和感兴趣的第二生物标志物；
(b)在不存在感兴趣的第二生物标志物的情况下，在视野中表达子集生物标志物和感兴趣的第一生物标志物；或
(c)在不存在感兴趣的第一生物标志物的情况下，在视野中表达子集生物标志物和感兴趣的第二生物标志物；
以及
(xii)通过将第八掩膜的总面积除以第四掩膜的总面积来导出针对所有下述细胞的PBP值，所述细胞表达感兴趣的第一生物标志物或感兴趣的第二生物标志物或其组合，以及子集生物标志物。
在一些实施方案中，相对于感兴趣的一个或多个额外的生物标志物(例如，感兴趣的第三生物标志物)而言，该方法还包括与步骤(ix)、(x)和(xii)相类似的步骤的额外循环。
在一些实施方案中，总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第九掩膜的总面积和第八掩膜的总面积中的每一个是以像素进行测量的。在一些实施方案中，像素为0.5μm宽。
在另一个方面中，本文提供了导出针对存在于视野中的所有肿瘤细胞的％生物标志物阳性(PBP)值的方法，其包括：
(i)生成代表存在于视野中的所有细胞的核的第一荧光信号的图像，并将第一荧光信号扩大至整个细胞的直径以构建存在于视野中的所有细胞的第一掩膜；
(ii)构建代表表达肿瘤生物标志物的存在于视野中的所有区域的第二荧光信号的第二掩膜；
(iii)按提供第三掩膜的方式组合该第一和第二掩膜，所述第三掩膜包括代表在视野中的所有肿瘤细胞的荧光信号；
(iv)构建代表表达感兴趣的生物标志物的存在于视野中的所有区域的第三荧光信号的第四掩膜；
(v)按提供第五掩膜的方式组合该第三和第四掩膜，所述第五掩膜包括代表也表达感兴趣的生物标志物的在视野中的所有肿瘤细胞的荧光信号；以及
(vi)通过将第五掩膜的总面积除以第三掩膜的总面积来导出针对表达感兴趣的生物标志物的所有肿瘤细胞的PBP值。
在一些实施方案中，总面积是以像素测量的。在一些实施方案中，第五掩膜的总面积和第三掩膜的总面积中的每一个是以像素进行测量的。在一些实施方案中，像素为0.5μm宽。在一些实施方案中，感兴趣的生物标志物包括选自由PD-L1、半乳凝素9和MHC所组成的组的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的生物标志物包括PD-L1。在一些实施方案中，感兴趣的生物标志物包括半乳凝素9。在一些实施方案中，感兴趣的生物标志物包括MHC。在一些实施方案中，视野还包括非肿瘤细胞。在一些实施方案中，非肿瘤细胞包括免疫细胞和基质细胞。
在另一个方面中，本文提供了导出针对存在于视野中的所有非肿瘤细胞的％生物标志物阳性(PBP)值的方法，其包括：
(i)生成代表存在于视野中的所有细胞的核的第一荧光信号的图像，并将第一荧光信号扩大至整个细胞的直径以构建存在于视野中的所有细胞的第一掩膜；
(ii)构建代表表达肿瘤生物标志物的存在于视野中的所有区域的第二荧光信号的第二掩膜；
(iii)按提供第三掩膜的方式从该第一掩膜减去该第二掩膜，所述第三掩膜包括代表在视野中的所有非肿瘤细胞的荧光信号；
(iv)构建代表表达感兴趣的生物标志物的存在于视野中的所有区域的荧光信号的第四掩膜；
(v)按提供第五掩膜的方式组合该第三和第四掩膜，所述第五掩膜包括代表也表达感兴趣的生物标志物的在视野中的所有非肿瘤细胞的荧光信号；以及
(vi)通过将第五掩膜的总面积除以第三掩膜的总面积来导出针对表达感兴趣的生物标志物的所有非肿瘤细胞的PBP值。
在一些实施方案中，在视野中的所有细胞的第一子集包括肿瘤细胞。在一些实施方案中，在视野中的所有细胞的第一子集包括非肿瘤细胞。在一些实施方案中，在视野中的所有细胞的第一子集包括非肿瘤和肿瘤细胞。
在一些实施方案中，细胞子集和细胞的非子集分别对应于肿瘤细胞和非肿瘤细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，细胞子集和细胞的非子集分别对应于活细胞和非活细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，细胞子集是活细胞子集，且细胞的非子集是由不包括在活细胞子集中的活细胞组成的。在一些实施方案中，细胞子集和细胞的非子集分别对应于T细胞和非T细胞，或反之亦然。在一些实施方案中，细胞子集和细胞的非子集分别对应于骨髓细胞和非骨髓细胞，或反之亦然。
在一些实施方案中，在视野中的所有细胞的第一子集包括T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达CD3。在一些实施方案中，T细胞表达CD8。在一些实施方案中，T细胞表达CD4。
在一些实施方案中，在视野中的所有细胞的第一子集包括骨髓细胞。在另外的实施方案中，骨髓细胞是骨髓来源的抑制细胞。在另外的实施方案中，骨髓细胞是肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施方案中，子集生物标志物仅在肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物仅在非肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物在T细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物包括CD3。在一些实施方案中，子集生物标志物包括CD19。在一些实施方案中，子集生物标志物在骨髓细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物在骨髓来源的抑制细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物在肿瘤相关巨噬细胞中予以表达。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括Ki67且在视野中的所有细胞的该第一子集包括CD8阳性细胞。
在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括选自由CD11b、CD33、HLA-DR、IDO-1、ARG1、颗粒酶B、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86所组成的组的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、ICOS、CD28、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86所组成的组的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1和GITRL所组成的组的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括选自由PD-L1、半乳凝素9和MHC所组成的组的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括PD-L1。
在一些实施方案中，感兴趣的第二生物标志物包括选自PD-1、TIM-3和TCR的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第二生物标志物包括PD-L1。
在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物和感兴趣的第二生物标志物彼此不同且包括选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86所组成的组的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物和感兴趣的第二生物标志物彼此不同且包括选自由CD11b、CD33、HLA-DR、IDO-1、ARG1、颗粒酶B、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86所组成的组的生物标志物。
在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、ICOS、CD28、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86所组成的组的生物标志物；且感兴趣的第二生物标志物包括选自PD-1、TIM-3和TCR的生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括PD-L1且感兴趣的第二生物标志物包括PD-1。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括PD-L1且感兴趣的第二生物标志物包括CD80。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CTLA-4且感兴趣的第二生物标志物包括CD80。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括PD-L2且感兴趣的第二生物标志物包括PD-1。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CTLA-4且感兴趣的第二生物标志物包括CD86。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括LAG-3且感兴趣的第二生物标志物包括HLA-DR。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括TIM-3且感兴趣的第二生物标志物包括半乳凝素9。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括41BB且感兴趣的第二生物标志物包括4.1BBL。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括OX40且感兴趣的第二生物标志物包括OX40L。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CD40且感兴趣的第二生物标志物包括CD40L。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括ICOS且感兴趣的第二生物标志物包括ICOSL。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括GITR且感兴趣的第二生物标志物包括GITRL。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括HLA-DR且感兴趣的第二生物标志物包括TCR。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CD25且感兴趣的第二生物标志物包括FoxP3。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CD4且感兴趣的第二生物标志物包括CD8。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CD3且感兴趣的第二生物标志物包括PD-1。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CD56且感兴趣的第二生物标志物包括CD16。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括HLA-DR且感兴趣的第二生物标志物包括IDO-1。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括CD33且感兴趣的第二生物标志物包括ARG1。
在一些实施方案中，子集生物标志物仅在肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物仅在非肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物在T细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物包括CD3。在一些实施方案中，子集生物标志物包括CD19。在一些实施方案中，子集生物标志物包括CD45。在一些实施方案中，子集生物标志物在骨髓细胞中予以表达。在一些实施方案中，子集生物标志物包括CD11b。
在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括Ki67且在视野中的所有细胞的第一子集包括CD8阳性细胞。
在一些实施方案中，非肿瘤细胞包括免疫细胞和基质细胞。在一些实施方案中，非肿瘤细胞包括骨髓细胞。
在一些实施方案中，荧光信号源于四个荧光标签，其中的每一个均特定于不同的生物标志物。在另外的实施方案中，第一荧光标签与感兴趣的第一生物标志物相关联，第二荧光标签与感兴趣的第二生物标志物相关联，第三荧光标签与感兴趣的第三生物标志物相关联，且第四荧光标签与感兴趣的第四生物标志物相关联。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括肿瘤和非肿瘤标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第二生物标志物包括非肿瘤标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第一生物标志物包括肿瘤和非肿瘤标志物，且感兴趣的第二生物标志物包括非肿瘤标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第三生物标志物由所有细胞表达。在一些实施方案中，感兴趣的第四生物标志物仅在肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，感兴趣的第三生物标志物由全部细胞表达，且感兴趣的第四生物标志物仅在肿瘤细胞中予以表达。在一些实施方案中，感兴趣的第四生物标志物为子集生物标志物。在一些实施方案中，感兴趣的第三生物标志物由全部细胞表达，且感兴趣的第四生物标志物为子集生物标志物。在一些实施方案中，一个或多个荧光标签包括被缀合至具有针对特定生物标志物或另一种抗体的结合亲和力的抗体的荧光团。在一些实施方案中，一个或多个荧光标签为具有针对特定生物标志物的亲和力的荧光团。
在另一个方面中，本文公开了在患者中治疗癌症的方法中使用的、利用包括成像装置和控制器的系统，导出针对存在于取自癌症患者的组织样本的视野中的所有细胞或其可选的一个或多个子集的％生物标志物阳性(PBP)的值的方法。
在一些实施方案中，本文公开了利用包括成像装置和控制器的系统用于在有需要的患者体内治疗癌症的方法，该方法包括导出针对存在于取自患者的组织样本的视野中的所有细胞或其可选的一个或多个子集的％生物标志物阳性(PBP)的值。
在一些实施方案中，本文公开了针对存在于组织样本的视野中的所有细胞或可选地其一个或多个子集导出％生物标志物阳性(PBP)的值的方法，其包括：(i)使用成像系统获得针对从癌症患者获取的组织样本的图像数据，该成像系统包括：壳体，其包括用于将样本定位在成像场中的平台，用于指引样本处的电磁辐射的电磁辐射源和用于收集电磁辐射输出的检测器；以及电子控制系统，其包括存储器和具有图像处理模块的处理电路；以及(ii)使用图像处理模块分析图像数据以导出针对存在于视野中的所有细胞或其可选的一个或多个子集的PBP。在一些实施方案中，导出针对存在于组织样本的视野中的所有细胞或其可选的一个或多个子集的PBP值的方法被用作监测被诊断有癌症且接受免疫疗法的患者的进展的方法的部分。在一些实施方案中，导出针对存在于组织样本的视野中的所有细胞或其可选的一个或多个子集的PBP值的方法被用作监测被诊断有癌症且接受免疫疗法的患者的免疫细胞调控的方法的部分。
实施例
实施例16、用于源于人类患者的黑素瘤组织样本的样本制备、成像和成像分析。
样本制备。使福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡。然后，在蒸馏水中进行孵育之前，使载玻片通过一系列的二甲苯至醇的洗涤液进行再水合。然后，使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原修复，允许其冷却并将其转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，阻断内源性过氧化物酶，然后用蛋白封闭溶液孵育以减少非特定的抗体染色。接下来，用小鼠抗PD1的一抗对载玻片进行染色。然后在用抗小鼠HRP二抗进行孵育之前洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后使用TSA+3.5(Perkin Elmer)检测PD-1染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭何残留的HRP。在用兔抗PD-L1的一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，且然后用以488染料和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)直接标记的抗兔HRP二抗加上小鼠抗S100的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(Perkin Elmer)检测PD-L1染色。在用包埋介质进行盖片之前最后一次洗涤载玻片，且允许其在室温下干燥过夜。图23显示了抗体和检测试剂的示意图。
样本成像和分析然后使用Vectra2智能载玻片分析系统，使用Vectra软件版本2.0.8版(Perkin Elmer)来获取荧光图像。首先，进行使用DAPI的以4倍倍率进行的载玻片的单色成像。使用自动算法(使用inForm开发的)来识别包含组织的载玻片的区域。
被识别为含有组织的载玻片的区域以4倍的倍率针对与DAPI(蓝色)、FITC(绿色)和5(红色)相关联的通道进行成像，以用于创建RGB图像。这些4倍倍率的图像在视野选择器104中使用自动富集算法(使用inForm开发的)进行处理以识别和排列根据最高5表达的可能的20倍倍率的视野。
前40个视野在DAPI、FITC、德克萨斯红和5波长下以20倍的倍率进行成像。复查原始图像的可接受性，且在分析之前拒绝未聚焦的、缺乏任何肿瘤细胞的、高度坏死的或包含与预期的抗体定位不相关联的高水平的荧光信号(即背景染色)的图像。使用AQUAduct(Perkin Elmer)处理接受的图像，其中每个荧光团是通过光谱解混器1910被光谱解混成各个通道并被保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的全自动过程来进一步分析处理过的文件。详情如下。
每个DAPI图像由细胞掩膜器1912处理，以识别在该图像内的所有细胞核(图7a)，且随后扩大3个像素以表示整个细胞的大致尺寸。这样产生的掩膜表示在该图像内的所有细胞(图7b)。
以488染料检测的S100(针对黑素瘤的肿瘤细胞标志物)(图8a)由子集掩膜器1916处理，以创建在该图像内的所有肿瘤区域的二进制掩膜(图8b)。在该掩膜和所有细胞的掩膜之间的重叠创建了针对肿瘤细胞的新掩膜(图8c)。
类似地，缺乏与所有核的掩膜相组合的肿瘤细胞掩膜器创建了针对所有非肿瘤细胞的新掩膜(图8d)，这是由非肿瘤细胞掩膜器1920执行的。
每个5图像(图9a)由生物标志物掩膜器1922处理，以创建PD-L1阳性的所有细胞的二元掩膜(图9b)。使用组合掩膜器1930的在所有肿瘤细胞的掩膜和所有PD-L1阳性细胞的掩膜之间的重叠创建了所有PD-L1阳性肿瘤细胞的新掩膜(图9c)。类似地，使用组合掩膜器1930的在所有非肿瘤细胞的掩膜和所有PD-L1阳性细胞的掩膜之间的重叠创建了所有PD-L1阳性非肿瘤细胞的新掩膜(图9d)。
每个.5图像(图10a)与所有非肿瘤细胞的掩膜相重叠以创建为PD-1阳性的所有细胞的二元掩膜(图10b)。
使用阳性计算器1936，通过将按像素测量的且由面积评估器1932确定的、所有PD-L1阳性肿瘤细胞的掩膜的总面积(图9c)除以按像素测量的且由面积评估器1932确定的、所有肿瘤细胞的掩膜的总面积(图8c)，来导出针对表达PD-L1的所有肿瘤细胞的％生物标志物阳性(PBP)。在图27a中示出了针对表达PD-L1的所有细胞的PBP的代表值(数据根据增加的表达而分类)。
通过将按像素测量的所有PD-L1阳性非肿瘤细胞的总面积(图10b)除以按像素测量的所有非肿瘤细胞的总面积(图8d)来导出表达PD-1的所有非肿瘤细胞的PBP。在图27b中示出了用于表达PD-1的所有非肿瘤细胞的PBP的代表值(数据根据增加的表达而分类)。
图16和17示出了表示PD-L1阳性细胞(红色)、PD-L阳性细胞(黄色)、肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)的重叠掩膜的代表性实施例。图16很容易地指出PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1阳性细胞(黄色)和所有肿瘤细胞(绿色)的存在。相反地，对于免疫治疗的阴性应答者而言，在图17中的掩膜指出肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)的存在，但却显示很少至无的PD-L1阳性细胞(红色)或PD-1阳性细胞(黄色)。
实施例17、用于源于人类患者的非小细胞肺癌(NSCLC)组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用以488染料直接标记的小鼠抗泛细胞角蛋白来替代以488染料直接标记的小鼠抗S100以用于上皮肿瘤样本。在图18中示出了针对PD-1和PD-L1的PBP值。这些患者的子集表现出高水平的提示免疫抑制的受体-配体交互。
实施例18、分析技术的比较
为了生成对照样品，根据制造商的说明书培养具有之前建立的PD-L1表达(Karpas299)或缺少表达(Ramos RA#1)的淋巴瘤细胞系。然后对细胞进行计数并将两种细胞系按变化的百分比进行混合，以生成一系列范围为0-100％的PD-L1表达的FFPE细胞系小球块(pellet block)。然后，使用源于这些细胞系混合物以及源于正常扁桃体组织切除的核心(600μm)来创建组织微阵列(TMA)。然后，对该TMA的切片进行染色、成像，然后使用AQUAnalysisTM(如在实施例15中所述的所有步骤)对每个核心进行％PD-L1阳性的评分，且在图38的Y轴上示出其结果，其中每个点表示单个核心(单个视野)。
替代地，使用基于细胞计数的软件对相同的图像进行％PD-L1表达的定量以进行如下所述的比较。使用DAPI首先识别每个细胞核，且随后在所识别的细胞核周围创建形态学细胞质。建立强度阈值以识别在细胞的细胞质中具有PD-L1表达的细胞。然后将被识别为在该阈值以上的细胞总数除以图像中的细胞总数以确定在每个核心中的％PD-L1阳性细胞，且其结果显示在图28的X轴上。总体而言，两种细胞计数方法之间存在高度一致性(R2＝0.86，斜率为1.1)；然而，存在有三个明显的异常值，其在图28中被标记为A、B、C，其中由评分确定的％PD-L1阳性显著地高于细胞计数方法的％PD-L1阳性。点A和B是细胞系核心，其中100％的细胞是Karpas299，因此通过评分确定的值更接近于预期，且细胞计数方法未能将细胞的细胞质识别为PD-L1阳性。类似地，在点C中，细胞混合物包括理论上为40％的Karpas299细胞，其中由评分确定的值再次地比细胞计数方法更接近于预期。这些结果证明了本文公开的方法优于基于细胞计数的软件。
实施例19、用于具有表达PD-L1的细胞和表达CD80的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用CD80的染色和分析来替代PD-1的染色和分析。
实施例20、用于具有表达CTLA-4的细胞和表达CD80的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
样本制备使福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡，再水合并以提高的温度条件执行抗原修复。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，使用(Advanced Cell Diagnostics)，使用20对跨越约1kb的CTLA-4 mRNA的杂交探针来对组织进行CTLA-4表达检测。用TSA-3使原位杂交显色。洗涤载玻片且然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭任何残留的HRP。在用小鼠抗CD80一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片且然后用抗小鼠HRP二抗进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(Perkin Elmer)检测CD80染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭任何残留的HRP。在用兔抗CD3的一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，且然后用抗兔HRP二抗加上4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-(Life Technologies)检测CD3染色。在用包埋介质进行盖片之前最后一次洗涤载玻片，且允许其在室温下干燥过夜。
执行与实施例1相类似的成像和分析程序，该成像是跨越DAPI、FITC、3和5波长进行的。使用CTLA-4和CD80的表达来开发用于获取20倍图像的富集算法。执行分析以调查CTLA-4在CD3阳性T细胞中的流行率以及在从转移性黑素瘤患者获取的肿瘤样本中的CD80表达。结果显示在图44a和44b中。
实施例21、用于具有表达PD-L2的细胞和表达PD-1的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用PD-L2的染色和分析来替代PD-L1的染色和分析。
实施例22、用于具有表达CTLA-4的细胞和表达CD86的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用CTLA-4和CD86的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例23、用于具有表达LAG-3的细胞和表达HLA-DR的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用LAG-3和HLA-DR的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例24、用于具有表达TIM-3的细胞和表达半乳凝素9的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用TIM-3和半乳凝素9的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例25、用于具有表达41BB的细胞和表达4.1BBL的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用41BB和4.1BBL的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例26、用于具有表达OX40的细胞和表达OX40L的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用OX40和OX40L的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例27、用于具有表达CD40的细胞和表达CD40L的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用CD40和CD40L的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例28、用于具有表达ICOS的细胞和表达ICOSL的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用ICOS和ICOSL的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例29、用于具有表达GITR的细胞和表达GITRL的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用GITR和GITRL的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例30、用于具有表达HLA-DR的细胞和表达TCR的细胞的组织样本的样本制备、成像和成像分析。
执行与实施例15相类似的程序，用HLA-DR和TCR的染色和分析来替代PD-L1和PD-1的染色和分析。
实施例31、对源于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的组织样本的CD3和PD-1的样本制备、成像和分析
样本制备使源于DLBCL患者(n＝43)的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡。然后，在蒸馏水中进行孵育之前，使载玻片通过一系列的二甲苯至醇的洗涤液进行再水合。然后，使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原修复，允许其冷却并将其转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，阻断内源性过氧化物酶，然后用蛋白封闭溶液孵育以减少非特定的抗体染色。接下来，用小鼠抗PD1的一抗对载玻片进行染色。然后在用抗小鼠HRP二抗进行孵育之前洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后使用TSA+3(Perkin Elmer)检测PD-1染色。然后，通过微波去除一抗和二抗试剂。在用兔抗CD3的一抗进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，且然后用抗兔HRP二抗加上4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(Perkin Elmer)检测CD3染色。在用包埋介质进行盖片之前最后一次洗涤载玻片，且允许其在室温下干燥过夜。图31显示了抗体和检测试剂的示意图。
样本成像和分析然后使用Vectra2智能载玻片分析系统，使用Vectra软件版本2.0.8版(Perkin Elmer)来获取荧光图像。首先，进行使用DAPI的以4倍倍率进行的载玻片的单色成像。使用自动算法(使用inForm开发的)来识别包含组织的载玻片的区域。
被识别为含有组织的载玻片的区域以4倍的倍率针对与DAPI(蓝色)、3(绿色)和5(红色)相关联的通道进行成像，以用于以创建RGB图像。这些4倍倍率的图像在视野选择器104中使用自动富集算法(使用inForm开发的)进行处理以识别和排列根据最高3表达的可能的20倍倍率的视野。
前40个视野越过DAPI、3和5波长以20倍的倍率进行成像。复查原始图像的可接受性，且在分析之前拒绝未聚焦的、缺乏任何肿瘤细胞的、高度坏死的或包含与预期的抗体定位不相关联的高水平的荧光信号(即背景染色)的图像。使用AQUAduct(PerkinElmer)处理接受的图像，其中每个荧光团是通过光谱解混器210被光谱解混成各个通道并被保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的全自动过程来进一步分析处理过的文件。详情如下。
每个DAPI图像由细胞掩膜器1912处理，以识别在该图像内的所有细胞核(图29a)，且随后扩大2个像素以表示整个细胞的大致尺寸。这样产生的掩膜表示在该图像内的所有细胞(图29b)。
每个5图像(图30a)由生物标志物掩膜器1922处理，以创建PD-1阳性的所有细胞的二元掩膜(图30b)。
每个3图像(图31a)由生物标志物掩膜器1922处理，以创建CD3阳性的所有细胞的二元掩膜(图31b)。
组合PD-1阳性和CD3阳性的所有细胞的二元掩膜以创建对于PD-1和CD3呈双阳性的所有细胞的二元掩膜(图32)。
使用阳性计算器1936，通过将按像素测量的且由面积评估器1932(图30b)确定的所有PD-1阳性细胞的掩膜的总面积除以按像素测量的且由面积评估器1932确定的所有CD3阳性细胞的掩膜的总面积(图31b)来导出用于表达PD-1的所有CD3细胞的％生物标志物阳性(PBP)。在初级(低水平)与次级位点(高水平)中观察到消耗的T细胞(CD3+/PD1+)的差别分布。结果显示在图33a和33b中。
实施例32、平台比较
通过与流式细胞术的比较来确认与实施例15和30相类似的程序的准确性。在包覆有CD3的平板上用IL-2、TGFβ和CD28刺激了5天的全血中确定调节性T细胞的频率(基于FoxP3和CD25的表达)。
实施例33、对CD25/FoxP3 T细胞在多个肿瘤适应症中的评估
执行与实施例30相类似的程序，用以AlexaFluor488二抗检测且跨越DAPI、FITC、3和5波长成像的抗S100或抗细胞角蛋白抗体进行对肿瘤细胞的额外识别，以对NSCLC、胃和黑素瘤组织上的CD25和FoxP3进行定量评估。用识别CD25和FoxP3的抗体进行组织的染色，且将其在非肿瘤区域中的表达计算成％表达。CD25/FoxP3+T细胞在档案肺、胃和黑素瘤组织样品中的流行率的范围是1％至10％。结果显示在图34和35中。
实施例34、对CD4/CD8 T细胞在多个肿瘤适应症中的评估
执行与实施例30相类似的程序，用以AlexaFluor488二抗检测且跨越DAPI、FITC、3和5波长成像的抗S100或抗细胞角蛋白抗体进行对肿瘤细胞的额外识别，以对NSCLC、胃和黑素瘤组织上的CD4和CD8进行定量评估。用识别CD4和CD8的抗体进行组织的染色，且将其在非肿瘤区域中的表达计算成％表达。针对在肿瘤样品的连续部分中的CD4+和CD8+T细胞观察到了广泛的表达(10％-50％)。结果显示在图36a和36b中。
实施例35、对源于诊断有转移性黑素瘤或非小细胞肺癌的患者的肿瘤样本中的骨髓来源的抑制细胞(MDSC)样细胞的评估。
为了识别表达特征为骨髓细胞(例如，CD11b、CD33和HLA-DR)的表型标志物和生物化学标志物(例如，ARG1和IDO-1)的MDSC样细胞，用CD11b、HLA-DR和IDO或CD11b、CD33和ARG1对样本进行染色。
使用CD11b、HLA-DR和IDO-1的差异表达来调查在源于转移性黑素瘤患者的肿瘤活组织检查中被称为TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的抑制性骨髓细胞的子集的存在。图37a、37b、38a和38b中显示了可能与预测对癌症免疫疗法的应答相关的代表性亚表型。
利用CD11b、CD33和ARG-1或CD11b、HLA-DR和IDO-1的差异表达来调查在源于晚期肺癌(NSCLC)患者的肿瘤样品中的MDSC样细胞和TAM的存在。图39a、39b和40中显示了可能与预测对癌症免疫疗法的应答相关的代表性亚表型。
样本制备使福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本脱蜡。然后，在蒸馏水中进行孵育之前，使载玻片通过一系列的二甲苯至醇的洗涤液进行再水合。然后，使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原修复，允许其冷却并将其转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，阻断内源性过氧化物酶，然后用蛋白封闭溶液孵育以减少非特定的抗体染色。接下来，用兔抗IDO-1或小鼠抗CD33的一抗来对载玻片进行染色。然后在用抗兔或抗小鼠HRP二抗进行孵育之前洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后使用TSA+5(Perkin Elmer)检测抗IDO-1或抗CD33染色。然后使用具有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼的两次洗涤来淬灭任何残留的HRP。在用小鼠抗HLA-DR或兔抗ARG1一抗进行染色之前，再次洗涤载玻片。洗涤载玻片且然后用抗小鼠或抗兔HRP二抗进行孵育。洗涤载玻片，且然后使用TSA-3(Perkin Elmer)检测抗HLA-DR或抗ARG1染色。然后，通过微波去除一抗和二抗试剂。在用兔抗CD11b的抗体进行染色之前再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，且然后用抗兔HRP二抗加上4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行孵育。洗涤载玻片，然后使用TSA-AlexaFluor488(Life Technologies)检测抗CD11b染色。在用包埋介质进行盖片之前最后一次洗涤载玻片，且允许其在室温下干燥过夜。
使用与实施例16相类似的程序进行跨越DAPI、FITC、3和5波长的样本成像和分析。在视野选择器104中使用自动富集算法(使用inForm开发的)对4倍倍率的图像进行处理，以根据最高3和5表达的识别和排列可能的20倍倍率的视野。
每个DAPI图像是由细胞掩膜器212处理的，以识别在该图像内的所有细胞核，且随后进行扩大以表示整个细胞的大致尺寸。这样产生的掩膜表示在该图像内的所有细胞。
每个图像是由生物标志物掩膜器222处理的，以创建CD11b阳性的所有细胞的二元掩膜。
每个3图像是由生物标志物掩膜器222处理的，以创建HLA-DR或CD33阳性的所有细胞的二元掩膜。
每个5图像是由生物标志物掩膜器222处理的，以创建IDO-1或ARG1阳性的所有细胞的二元掩膜。
组合CD11b阳性和HLA-DR阳性的所有细胞的二元掩膜以创建对于CD11b和HLA-DR呈双阳性或为CD11b阳性及HLA-DR阴性的所有细胞的二元掩膜。
使用阳性计算器236，通过将按像素测量的且由面积评估器232确定的所有CD11b阳性且HLA-DR阴性细胞的掩膜的总面积除以按像素测量的且由面积评估器232确定的所有CD11b阳性细胞的掩膜的总面积，来导出缺少HLA-DR表达的所有CD11b细胞的％生物标志物阳性(PBP)。在图37a中示出了从诊断患有转移性黑素瘤的患者获得的肿瘤样本的结果。
组合CD11b阳性、IDO阳性和HLA-DR阳性的所有细胞的二元掩膜，以创建为CD11b阳性、HLA-DR阴性和IDO-1阳性的所有细胞的二元掩膜。
通过将按像素测量的所有CD11b阳性、HLA-DR阴性、IDO-1阳性细胞的掩膜的总面积除以按像素测量的所有CD11b阳性细胞的掩膜的总面积，来导出针对表达IDO-1但却缺少HLA-DR的表达的所有CD11b细胞的PBP。图37b中示出了从诊断有转移性黑素瘤的患者获得的肿瘤样本的结果，且图40针对诊断有非小细胞肺癌的患者。
组合HLA-DR阳性和IDO-1阳性的所有细胞的二元掩膜，以创建对于HLA-DR和IDO-1呈双阳性的所有细胞的二元掩膜。
使用阳性计算器236，通过将按像素测量的且由面积评估器232确定的所有IDO-1阳性且HLA-DR阳性细胞的掩膜的总面积除以按像素测量的且由面积评估器232确定的所有HLA-DR阳性细胞的掩膜的总面积，来导出针对表达IDO-1的所有HLA-DR细胞的％生物标志物阳性(PBP)。在图38a中示出了针对从诊断有转移性黑素瘤的患者获得的肿瘤样本的结果。
组合CD11b阳性、IDO阳性和HLA-DR阳性的所有细胞的二元掩膜以创建CD11b阳性、HLA-DR阳性和IDO-1阳性的所有细胞的二元掩膜。
通过将按像素测量的所有CD11b阳性、HLA-DR阳性、IDO-1阳性细胞的掩膜的总面积除以按像素测量的所有CD11b阳性细胞的掩膜的总面积，来导出用于表达IDO-1和HLA-DR的所有CD11b细胞的PBP。图38b中示出了从诊断有转移性黑素瘤的患者获得的肿瘤样本的结果，且图39b为从诊断有非小细胞肺癌的患者获得的肿瘤样本的结果。
组合CD11b阳性、CD33阳性和ARG1阳性的所有细胞的二元掩膜以创建CD11b阳性、CD33阳性和ARG1阳性的所有细胞的二元掩膜。
通过将按像素测量的所有CD11b阳性、CD33阳性、ARG1阳性细胞的掩膜的总面积除以按像素测量的所有CD11b阳性细胞的掩膜的总面积，来导出表达CD33和ARG1的所有CD11b细胞的PBP。在图39a中示出了从诊断有非小细胞肺癌的患者获得的肿瘤样本的结果。
实施例36、对源于诊断有转移性黑素瘤的患者的肿瘤样本中的激活的T细胞的评估。
执行与实施例20相类似的程序，以用DAPI、CD3、CD8和Ki67的组合来对每个样本进行染色，以识别激活的T细胞的子群。在从诊断有转移性黑素瘤的患者获得的肿瘤活组织检查中调查CD8+Ki67+的流行率(图41)。
实施例37、对源于诊断有转移性黑素瘤的患者的肿瘤样本中巨噬细胞的流行率的评估。
执行与实施例16相类似的程序，用以AlexaFluor488二抗检测且跨越DAPI、FITC、3和5波长成像的抗S100抗体进行对肿瘤细胞的额外识别，以对黑素瘤组织上的CD163和CD68进行定量评估。用识别CD163和CD68的抗体进行组织的染色，且将其在非肿瘤区域中的表达计算成单PBP表达或双PBP表达。结果显示在图42a、42b和42c中。
实施例38、对源于诊断有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和神经内分泌肿瘤(NET)的患者的肿瘤样品中的T细胞抑制流行率的评估。
执行与实施例1相类似的程序，用通过TSA+3.5检测的小鼠抗LAG-3一抗、抗小鼠HRP二抗来对DLBCL和NET肿瘤样品进行染色，剩余的HRP则用100mM苯甲酰肼和50mM过氧化氢进行淬灭。在此之后，用通过TSA-5检测的兔抗TIM-3一抗、抗兔HRP二抗对载玻片进行染色。然后，经微波去除一抗和二抗。随后用通过OpalTM520检测的兔抗CD3一抗、抗兔HRP二抗加上4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)来对组织进行染色。跨越DAPI、FITC、德克萨斯红和5波长按与实施例1相类似的方式进行成像。按与实施例1相类似的方式执行分析，以分别确定为LAG-3和TIM-3阳性的T细胞的PBP流行率。结果显示在图43a和43b中。
第A段.一种图像处理系统，其包括：
图像处理控制器，其包括处理电路，所述处理电路被配置成执行在计算机可读介质上存储的指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：接收源于成像装置的图像数据，所述图像数据描述从癌症患者获取的肿瘤组织的样本；以及
使用所述图像数据确定代表所述肿瘤组织中的至少一对细胞之间的接近性的分数，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物；
其中所述分数表示所述癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
第B段.根据第A段所述的系统，其中代表至少一对细胞之间的接近性的所述分数代表所述一对细胞在彼此的预定接近度内的程度。
第C段.根据第A段所述的系统，其中所述接近性是按像素级别进行评估的。
第D段.根据第B段所述的系统，其中所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约1个像素至约100个像素。
第E段.根据第B段所述的系统，其中所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约5个像素至约40个像素。
第F段.根据第B段所述的系统，其中所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约0.5μm至约50μm。
第G段.根据第B段所述的系统，其中在所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约2.5μm至约20μm。
第H段.根据第A段所述的系统，其中通过获得所述一对细胞的边界之间的接近度来确定所述分数。
第I段.根据第A段所述的系统，其中通过获得所述一对细胞的质量中心之间的接近度来确定所述分数。
第J段.根据第A段所述的系统，其中使用基于所述一对细胞中选定的第一细胞周围的周长的边界逻辑来确定所述分数。
第K段.根据第A段所述的系统，其中通过确定所述一对细胞的边界中的交叉点来确定所述分数。
第L段.根据第A段所述的系统，其中通过确定所述一对细胞的重叠区域来确定所述分数。
第M段.根据第A段所述的系统，其中所述处理电路还被配置成执行指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：
将所述图像数据分离成未混合的图像数据；以及
通过多个数据通道提供所述数据，其中在第一数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于所述第一生物标志物的荧光信号，且在第二数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于所述第二生物标志物的荧光信号。
第N段.根据第M段所述的系统，其中为了确定所述分数，所述处理电路还被配置成执行指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：使源于所述第一数据通道的可归因于所述第一生物标志物的荧光信号被扩大预定的余量以生成扩大的第一生物标志物掩膜，所述预定的余量被选定为包含表达所述第二生物标志物的位于近侧的细胞；
确定交互面积，其中所述交互面积是所有下述细胞的第一总面积，所述细胞表达所述第二生物标志物且被包含在可归因于表达所述第一生物标志物的所述细胞所述扩大的荧光信号内；以及
将所述交互面积除以归一化因子，并将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数。
第O段.根据第N段所述的系统，其中所述归一化因子是具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。
第P段.根据第N段所述的系统，其中所述交互面积是通过将所述扩大的第一生物标志物掩膜与根据所述第二数据通道的信号确定的代表表达所述第二生物标志物的细胞的掩膜相组合来确定的。
第Q段.根据第M段所述的系统，其中第三数据通道描述可归因于细胞核的荧光信号，且第四数据通道描述可归因于在所述样本中的肿瘤区域的荧光信号。
第R段.根据第O段所述的系统，其中具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的所述总面积是通过将基于源于所述第三数据通道的信号的代表所述样本中的所有细胞的细胞掩膜与基于源于所述第四数据通道的信号的代表在所述样本上的所述肿瘤区域的肿瘤区域掩膜相组合来确定的。
第S段.根据第R段所述的系统，其中组合所述细胞掩膜和所述肿瘤区域掩膜包括从所述细胞掩膜移除所述肿瘤区域掩膜。
第T段.根据第N-S段中任一段所述的系统，其中每个掩膜是通过将二进制值分配给源于选定通道的图像数据的每个像素来生成的。
第U段.根据第T段所述的系统，其中所述二进制值通过阈值函数被分配给每个值，其中所述阈值函数将为1的值分配给具有等于或大于预定强度阈值的强度的每个像素，并将为0的值分配给具有低于所述预定强度阈值的强度的每个像素。
第V段.根据第T段所述的系统，其中所述二进制值通过直方图阈值函数被分配给每个值，其中所述直方图阈值函数使用像素强度的计算尺来确定阈值，并将为1的值分配给具有等于或大于强度阈值的强度的每个像素，并将为0的值分配给具有低于所述强度阈值的强度的每个像素。
第W段.根据第V段所述的系统，其中所述阈值是通过以下确定的：
将每个像素的强度求和成总强度；
将阈值百分比乘以所述总强度以获得截止和；
按直方图中的强度对所有像素进行分组；以及
将所述像素强度从最低到最高地求和直至达到所述截止和为止；
其中在所述过程中访问的最后一个最高的像素强度为所述强度阈值。
第X段.根据第N-W段中的任一段所述的系统，其中组合所述掩膜是使用“and”操作来执行的；其中所述“and”操作是第一掩膜中的像素的所述像素强度与第二掩膜中的所述像素的所述像素强度的乘积。
第Y段.根据第N-W段中的任一段所述的系统，其中组合所述掩膜是使用“out”操作来执行的；其中所述“out”操作从第一掩膜移除第二掩膜。
第Z段.根据第A段所述的系统，其中所述处理电路还被配置成执行指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：
获得代表所述图像中的所述第一或所述第二生物标志物的浓度的低倍率的图像数据；
识别包括所述第一或所述第二生物标志物的最高浓度的区域；
选择包括所述第一或所述第二生物标志物的最高浓度的预定数量的区域；
向成像装置发送指令以获得针对所述预定数量的区域的高倍率图像数据；以及
其中所述高倍率图像数据被提供至所述控制器以进行分析并用于确定所述分数。
第AA段.根据第Z段所述的系统，其中所述低倍率小于或等于10倍的倍率，且其中所述高倍率大于10倍。
第AB段.根据第AA段所述的系统，其中所述低倍率为10倍的倍率，且其中所述高倍率为40倍。
第AC段.根据第AA段所述的系统，其中所述低倍率为10倍的倍率，且其中所述高倍率为20倍。
第AD段.根据第AA段所述的系统，其中所述低倍率为4倍的倍率，且其中所述高倍率为40倍。
第AE段.根据第AA段所述的系统，其中所述低倍率为4倍的倍率，且其中所述高倍率为20倍。
第AF段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数与和所述样本的所述图像相关联的元数据关联起来。
第AG段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元生成包括所述分数的报告。
第AH段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数提供给操作员以确定免疫治疗策略。
第AI段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数记录在数据库中。
第AJ段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数与患者的医疗记录关联起来。
第AK段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成在显示装置上显示所述分数。
第AL段.根据第A段所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一成员包括肿瘤细胞，且所述至少一对细胞中的所述第二成员包括非肿瘤细胞。
第AM段.根据第AL段所述的系统，其中所述非肿瘤细胞包括免疫细胞。
第AN段.根据第A段所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一和第二成员包括免疫细胞。
第AO段.根据第A段所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一成员包括肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，且所述至少一对细胞中的所述第二成员包括免疫细胞。
第AP段.根据第AO段所述的系统，其中所述肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞表达PD-L1且所述免疫细胞表达PD-1。
第AQ段.根据第A段所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成从包括得自所述癌症患者的肿瘤组织的所述样本选择预定数量的可用视野，并根据与每个视野相关联的数据确定所述分数。
第AR段.根据第AQ段所述的系统，其中所述样本用多个荧光标签进行染色，且其中所述荧光标签中的每一个是针对特定生物标志物的。
第AS段.根据第AQ段或第AR段所述的系统，其中所述多个荧光标签包括针对所述第一生物标志物的第一荧光标签和针对所述第二生物标志物的第二荧光标签。
第AT段.根据第AQ-AS段中的任一段所述的系统，其中所述余量的范围是约1至约100个像素。
第AU段.根据第AQ-AT段中的任一段所述的系统，其中表达所述第二生物标志物的所述位于近侧的细胞在表达所述第一生物标志物的所述细胞的质膜的约0.5μm至约50μm内。
第AV段.根据第N-AU段中的任一段所述的系统，其中所述预定因子是104。
第AW段.根据第A段所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合所组成的组的第一生物标志物，且所述至少一对细胞中的所述第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合所组成的组的第二生物标志物。
第AX段.根据第A-AW段中的任一段所述的系统，其中所述阈值的范围是约500至约5000。
第AY段.根据第AX段所述的系统，其中所述阈值为约900加或减100。
第AZ段.根据第A-AY段中的任一段所述的系统，其中所述免疫疗法包括免疫检查点疗法。
第BA段.一种用于确定代表肿瘤组织样本中至少一对细胞之间的接近度的分数的系统，所述系统包括：
包括存储器的处理电路，所述存储器包括：
光谱解混器，其被配置成接收源于成像装置的图像数据，将所述图像数据分离成未混合的图像数据，且通过多个数据通道提供所述数据，其中在第一数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于细胞核的荧光信号，在第二数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于肿瘤组织的荧光信号，在第三数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第四数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号；
细胞掩膜器，其被配置成接收源于所述第一数据通道的图像数据并生成代表在视野中的所有核的图像，且扩大所述图像以生成细胞掩膜；
肿瘤区域掩膜器，其被配置成接收源于所述第二数据通道的图像数据并生成在所述视野中的所有肿瘤区域掩膜；
第一生物标志物掩膜器，其被配置成接收源于所述第三数据通道的图像数据并生成表达所述第一生物标志物的在所述视野中的所有细胞的第一生物标志物掩膜；
第二生物标志物掩膜器，其被配置成接收源于所述第四数据通道的图像数据并生成表达所述第二生物标志物的在所述视野中的所有细胞的第二生物标志物掩膜；
肿瘤掩膜器，其被配置成组合所述细胞掩膜和所述肿瘤区域掩膜以生成非肿瘤细胞掩膜和肿瘤细胞掩膜中的至少一个；
扩大器，其被配置成扩大所述第一生物标志物掩膜以生成扩大的第一生物标志物掩膜；
交互掩膜器，其被配置成组合所述扩大的第一生物标志物掩膜和所述第二生物标志物掩膜以生成交互掩膜；
交互计算器，其被配置成计算空间接近度分数。
第BB段.根据第BA段所述的系统，其中所述交互计算器被配置成将所述交互掩膜的面积除以所述非肿瘤细胞掩膜、所述肿瘤细胞掩膜和所述细胞掩膜中的一个的面积。
第BC段.根据第BA段所述的系统，其中所述空间接近度分数是根据下列等式进行计算的：
其中AI是总交互面积(交互掩膜的面积)，且AC是非肿瘤细胞掩膜、肿瘤细胞掩膜和细胞掩膜中的至少一个的总面积。
第BD段.一种处理组织样本的图像以确定代表所述组织中至少一对细胞之间的接近度的分数的方法，所述方法包括：
接收与包括从所述癌症患者获取的肿瘤组织的组织样本相关联的图像数据；
从用多个荧光标签染色的所述样本选择至少一个视野，所述选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达所述第一生物标志物的细胞的至少一个视野；
为所述选定视野中的每一个按下述余量扩大可归因于所述第一生物标志物的荧光信号，所述余量足以包含表达所述第二生物标志物的位于近侧的细胞；
将源于所述选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达所述第二生物标志物且被包含在可归因于表达所述第一生物标志物的所述细胞的所述扩大的荧光信号内；以及
记录所述分数，当与阈值相比较时，所述分数表示所述癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
第BE段.根据第A段所述的系统，其中与所述第一生物标志物的表达的定量或所述第二生物标志物的表达的定量相比，所述方法提供了更优越的预测能力。
第BF段.根据第BA段所述的系统，其中与所述第一生物标志物的表达的定量或所述第二生物标志物的表达的定量相比，所述方法提供了更优越的预测能力。
第BG段.根据第BD段所述的方法，其中与所述第一特定生物标志物的表达的定量或所述第二特定生物标志物的表达的定量相比，所述方法提供了更优越的预测能力。
第BH段.根据第BG段所述的方法或根据第BE段或第BF段所述的系统，其中所述预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。
第BI段.根据第BH段所述的方法或系统，其中所述阳性预测值为65％或更高。
第BJ段.根据第BI段所述的方法或系统，其中所述阳性预测值为70％或更高。
第BK段.根据第BJ段所述的方法或系统，其中所述阳性预测值为75％或更高。
第BL段.根据第BH段所述的方法或系统，其中所述阴性预测值为65％或更高。
第BM段.根据第BL段所述的方法或系统，其中所述阴性预测值为80％或更高。
第BN段.一种用于确定肿瘤组织样本中生物标志物阳性值的系统，所述系统包括：
包括存储器的处理电路，所述存储器包括：
光谱解混器，其被配置成接收源于成像装置的图像数据，将所述图像数据分离成未混合的图像数据，且通过多个数据通道提供所述数据，其中在第一数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于细胞核的荧光信号，在第二数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于感兴趣的子集组织的荧光信号，且在第三数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号；
细胞掩膜器，其被配置成使用源于所述第一数据通道的图像数据并生成代表在视野中的所有核的图像且扩大所述图像以生成细胞掩膜；
子集区域掩膜器，其被配置成使用源于所述第二数据通道的图像数据并生成在所述视野中的所有子集组织区域的掩膜；
第一生物标志物掩膜器，其被配置成使用源于所述第三数据通道的图像数据并生成表达所述第一生物标志物的在所述视野中的所有细胞的第一生物标志物掩膜；
子集细胞掩膜器，其被配置成组合所述细胞掩膜和所述子集组织区域的掩膜以生成非子集细胞掩膜和子集细胞掩膜中的至少一个；
组合掩膜器，其被配置成组合所述生物标志物掩膜和所述非子集细胞掩膜与所述子集细胞掩膜中的至少一个；
阳性计算器，其被配置成计算生物标志物的阳性值。
第BO段.根据第BN段所述的系统，其中所述计算器被配置成将所述生物标志物掩膜的面积除以所述非子集细胞掩膜和所述子集细胞掩膜中的至少一个的面积以计算所述生物标志物的阳性值。
第BP段.根据第BN段所述的系统，其中所述第一生物标志物包括选自PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86的生物标志物。
第BQ段.根据第BN段所述的系统，其中所述第二生物标志物不同于所述第一生物标志物且包括选自PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86的生物标志物。
第BR段.根据第BN段所述的系统，其中所述感兴趣的子集组织是肿瘤组织，所述子集细胞是肿瘤细胞，且所述非子集细胞为非肿瘤细胞。
第BS段.一种系统，其包括图像处理单元，其被配置成：
接收源于成像装置的图像数据，所述图像数据描述从患者获取的组织的样本；以及
确定生物标志物的阳性值，所述值代表了相对于样本中一个类型的细胞的总量而言样本中表达感兴趣的生物标志物的所述类型的细胞的量。
虽然已经说明和描述了某些实施方案，但应理解的是，能够根据本领域的普通技术，在不脱离如在下列权利要求中限定的更广泛方面中的技术的情况下在其中进行改变和修改。
可以在缺乏在本文中未具体公开的任何元件或多个元件、限制或多个限制的情况下适当地实践本文说明性描述的实施方案。因此，例如，应广义地且无限制地理解术语“包括”、“包含”、“含有”等。额外地，本文所采用的术语和表述已被用作描述性而非限制性的术语，且并不旨在使用排除所示和所述特性的任何等同物或其部分的这种术语和表述，但应认识到的是各种修改均在所要求保护的技术的范围之内。额外地，短语“基本上由......组成”将被理解成包括具体描述的那些元件以及对所要求保护的技术的基本和新颖特征不会产生实质上影响的那些额外的元件。短语“由......组成”排除未指定的任何元件。
本公开不限于在本申请中描述的特定实施方案。对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，能够在不脱离其精神和范围的情况下做出许多修改和变化。根据前面的描述，除了本文列举的那些之外，在本公开的范围内的功能等效的方法和组合物对于本领域的那些技术人员来说将是显而易见的。这样的修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅由所附权利要求的术语以及这种权利要求的等同物的全部范围来限制。要理解的是，本公开不限于特定方法、试剂、化合物组合物或生物系统，其当然可能发生变化。还要理解的是，在本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方案，且不旨在限制。
另外，在根据马库什组描述本公开的特性或方面的情况下，本领域的那些技术人员将认识到，本公开还由此是以马库什组的任何单个成员或成员的子群进行描述的。
如本领域的技术人员将理解的是，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包含其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围能够被容易地识别成充分描述和启用被分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的相同范围。作为非限制性实施例，本文所讨论的每个范围能够被容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域的技术人员还将理解的是，所有语言，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所列举的数字且指代能够随后被分解成如上面所讨论的子范围的范围。最后，如本领域的技术人员将理解的，范围包括每个个别的成员。
本说明书中提到的所有出版物、专利申请、授权的专利和其他文件均通过引用并入本文，就好像每个个别的出版物、专利申请、授权的专利和其他文件都是具体且单独地被指示为通过引用整体并入本文的情况一样。包含在通过引用并入的文本中的定义均以与本公开中的定义相矛盾的程度被排除在外。
在下列权利要求中阐明了其他实施方案。

Claims (71)

1.一种图像处理系统，其包括：
包括处理电路的图像处理控制器，所述处理电路被配置成执行在计算机可读介质上存储的指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：
接收源于成像装置的图像数据，所述图像数据描述从癌症患者获取的肿瘤组织的样本；以及
使用所述图像数据确定代表在所述肿瘤组织中的至少一对细胞之间的接近性的分数，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物；
其中所述分数表示所述癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
2.根据权利要求1所述的系统，其中代表至少一对细胞之间的接近性的所述分数代表所述一对细胞在彼此的预定接近度内的程度。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述接近性是按像素级别进行评估的。
4.根据权利要求2所述的系统，其中在所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约1个像素至约100个像素。
5.根据权利要求2所述的系统，其中在所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约5个像素至约40个像素。
6.根据权利要求2所述的系统，其中在所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约0.5μm至约50μm。
7.根据权利要求2所述的系统，其中在所述一对细胞之间的所述预定接近度的范围为约2.5μm至约20μm。
8.权利要求1所述的系统，其中通过获得所述一对细胞的边界之间的接近度来确定所述分数。
9.权利要求1所述的系统，其中通过获得所述一对细胞的质量中心之间的接近度来确定所述分数。
10.权利要求1所述的系统，其中使用基于所述一对细胞中选定的第一细胞周围的周长的边界逻辑来确定所述分数。
11.权利要求1所述的系统，其中通过确定所述一对细胞的边界中的交叉点来确定所述分数。
12.权利要求1所述的系统，其中通过确定所述一对细胞的重叠区域来确定所述分数。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述处理电路还被配置成执行指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：
将所述图像数据分离成未混合的图像数据；以及
通过多个数据通道提供所述数据，其中在第一数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于所述第一生物标志物的荧光信号，且在第二数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于所述第二生物标志物的荧光信号。
14.根据权利要求13所述的系统，其中为了确定所述分数，所述处理电路还被配置成执行指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：使源于所述第一数据通道的可归因于所述第一生物标志物的荧光信号扩大预定的余量以生成扩大的第一生物标志物掩膜，所述预定的余量被选定为包含表达所述第二生物标志物的位于近侧的细胞；
确定交互面积，其中所述交互面积是所有下述细胞的第一总面积，所述细胞表达所述第二生物标志物且被包含在可归因于表达所述第一生物标志物的所述细胞的所述扩大的荧光信号内；以及
将所述交互面积除以归一化因子，并将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述归一化因子是具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的总面积。
16.根据权利要求14所述的系统，其中所述交互面积是通过将所述扩大的第一生物标志物掩膜与根据所述第二数据通道的信号确定的代表表达所述第二生物标志物的细胞的掩膜相组合来确定的。
17.根据权利要求13所述的系统，其中第三数据通道描述可归因于细胞核的荧光信号，且第四数据通道描述可归因于所述样本中的肿瘤区域的荧光信号。
18.根据权利要求15所述的系统，其中具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的所述总面积是通过将以下二者组合来确定的：基于源于所述第三数据通道的信号的代表所述样本中所有细胞的细胞掩膜，与基于源于所述第四数据通道的信号的代表所述样本上的所述肿瘤区域的肿瘤区域掩膜。
19.根据权利要求18所述的系统，其中组合所述细胞掩膜和所述肿瘤区域掩膜包括从所述细胞掩膜移除所述肿瘤区域掩膜。
20.根据权利要求14所述的系统，其中每个掩膜是通过将二进制值分配给源于选定通道的图像数据的每个像素来生成的。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述二进制值通过阈值函数被分配给每个值，其中所述阈值函数将为1的值分配给具有等于或大于预定强度阈值的强度的每个像素，并将为0的值分配给具有低于所述预定强度阈值的强度的每个像素。
22.根据权利要求20所述的系统，其中所述二进制值通过直方图阈值函数被分配给每个值，其中所述直方图阈值函数使用像素强度的计算尺来确定阈值，并将为1的值分配给具有等于或大于强度阈值的强度的每个像素，并将为0的值分配给具有低于所述强度阈值的强度的每个像素。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述阈值是通过以下确定的：
将每个像素的强度求和成总强度；
将阈值百分比乘以所述总强度以获得截止和；
按直方图中的强度对所有像素进行分组；以及
将所述像素强度从最低到最高地求和直至达到所述截止和为止；
其中在所述过程中访问的最后一个最高的像素强度为所述强度阈值。
24.根据权利要求14所述的系统，其中组合所述掩膜是使用“and”操作来执行的；其中所述“and”操作是第一掩膜中像素的所述像素强度与第二掩膜中像素的所述像素强度的乘积。
25.根据权利要求14所述的系统，其中组合所述掩膜是使用“out”操作来执行的；其中所述“out”操作从所述第一掩膜移除所述第二掩膜。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述处理电路还被配置成执行下述指令，所述指令使得所述图像处理系统的所述控制器：
获得代表所述图像中的所述第一或所述第二生物标志物浓度的低倍率的图像数据；
识别包括所述第一或所述第二生物标志物的最高浓度的区域；
选择预定数量的包括所述第一或所述第二生物标志物的最高浓度的区域；
向成像装置发送指令以获得针对所述预定数量的区域的高倍率图像数据；以及
其中所述高倍率图像数据被提供至所述控制器以进行分析并用于确定所述分数。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述低倍率小于或等于10倍的倍率，且其中所述高倍率大于10倍。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述低倍率为10倍的倍率，且其中所述高倍率为40倍。
29.根据权利要求27所述的系统，其中所述低倍率为10倍的倍率，且其中所述高倍率为20倍。
30.根据权利要求27所述的系统，其中所述低倍率为4倍的倍率，且其中所述高倍率为40倍。
31.根据权利要求27所述的系统，其中所述低倍率为4倍的倍率，且其中所述高倍率为20倍。
32.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数与和所述样本的所述图像相关联的元数据关联起来。
33.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元生成包括所述分数的报告。
34.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数提供给操作员以确定免疫治疗策略。
35.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数记录在数据库中。
36.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成将所述分数与患者的医疗记录关联起来。
37.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成在显示装置上显示所述分数。
38.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一成员包括肿瘤细胞，且所述至少一对细胞中的所述第二成员包括非肿瘤细胞。
39.根据权利要求38所述的系统，其中所述非肿瘤细胞包括免疫细胞。
40.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一和第二成员包括免疫细胞。
41.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一成员包括肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，且所述至少一对细胞中的所述第二成员包括免疫细胞。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所述肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞表达PD-L1且所述免疫细胞表达PD-1。
43.根据权利要求1所述的系统，其中所述图像处理单元还被配置成从包括得自所述癌症患者的肿瘤组织的所述样本选择预定数量的可用视野，并根据与每个视野相关联的数据确定所述分数。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述样本用多个荧光标签进行染色，且其中所述荧光标签中的每一个是针对特定生物标志物的。
45.根据权利要求43所述的系统，其中所述多个荧光标签包括用于所述第一生物标志物的第一荧光标签和用于所述第二生物标志物的第二荧光标签。
46.根据权利要求43所述的系统，其中所述余量的范围是约1至约100个像素。
47.根据权利要求43所述的系统，其中表达所述第二生物标志物的所述位于近侧的细胞在表达所述第一生物标志物的所述细胞的质膜的约0.5至约50μm内。
48.根据权利要求14所述的系统，其中所述预定因子是104。
49.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少一对细胞中的所述第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL及其组合所组成的组的第一生物标志物，且所述至少一对细胞中的所述第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28及其组合所组成的组的第二生物标志物。
50.根据权利要求1所述的系统，其中所述阈值的范围是约500至约5000。
51.根据权利要求50所述的系统，其中所述阈值为约900加或减100。
52.根据权利要求1所述的系统，其中所述免疫疗法包括免疫检查点疗法。
53.一种用于确定代表肿瘤组织样本中至少一对细胞之间接近度的分数的系统，所述系统包括：
包括存储器的处理电路，所述存储器包括：
光谱解混器，其被配置成接收源于成像装置的图像数据，将所述图像数据分离成未混合的图像数据，且通过多个数据通道提供所述数据，其中在第一数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于细胞核的荧光信号，在第二数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于肿瘤组织的荧光信号，在第三数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号，且在第四数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于第二生物标志物的荧光信号；
细胞掩膜器，其被配置成接收源于所述第一数据通道的图像数据并生成代表在视野中的所有核的图像且扩大所述图像以生成细胞掩膜；
肿瘤区域掩膜器，其被配置成接收源于所述第二数据通道的图像数据并生成在所述视野中的所有肿瘤区域的掩膜；
第一生物标志物掩膜器，其被配置成接收源于所述第三数据通道的图像数据并生成表达所述第一生物标志物的在所述视野中的所有细胞的第一生物标志物掩膜；
第二生物标志物掩膜器，其被配置成接收源于所述第四数据通道的图像数据并生成表达所述第二生物标志物的在所述视野中的所有细胞的第二生物标志物掩膜；
肿瘤掩膜器，其被配置成组合所述细胞掩膜和所述肿瘤区域掩膜以生成非肿瘤细胞掩膜和肿瘤细胞掩膜中的至少一个；
扩大器，其被配置成扩大所述第一生物标志物掩膜以生成扩大的第一生物标志物掩膜；
交互掩膜器，其被配置成组合所述扩大的第一生物标志物掩膜和所述第二生物标志物掩膜以生成交互掩膜；
交互计算器，其被配置成计算空间接近度分数。
54.根据权利要求53所述的系统，其中所述交互计算器被配置成将所述交互掩膜的面积除以所述非肿瘤细胞掩膜、所述肿瘤细胞掩膜和所述细胞掩膜中的一个的面积。
55.根据权利要求53所述的系统，其中所述空间接近度分数是根据下列等式进行计算的：
其中AI是总交互面积(所述交互掩膜的面积)，且AC是所述非肿瘤细胞掩膜、所述肿瘤细胞掩膜和所述细胞掩膜中的至少一个的总面积。
56.一种处理组织样本的图像以确定代表在所述组织中至少一对细胞之间的接近度的分数的方法，所述方法包括：
接收与包括取自所述癌症患者的肿瘤组织的组织样本相关联的图像数据；
从用多个荧光标签染色的所述样本选择至少一个视野，所述选择偏向于选择相对于其他视野来说含有更多数量的表达所述第一生物标志物的细胞的至少一个视野；
为所述选定视野中的每一个按下述余量扩大可归因于所述第一生物标志物的荧光信号，所述余量足以包含表达所述第二生物标志物的位于近侧的细胞；
将源于所述选定视野中的每一个的所有下述细胞的第一总面积除以归一化因子，且将得到的商乘以预定因子以获得空间接近度分数，所述细胞表达所述第二生物标志物且被包含在可归因于表达所述第一生物标志物的所述细胞的所述扩大的荧光信号内；以及
记录所述分数，当与阈值相比较时，所述分数表示所述癌症患者将对免疫疗法有积极应答的可能性。
57.根据权利要求1所述的系统，其中与所述第一生物标志物的表达的定量或所述第二生物标志物的表达的定量相比，所述方法提供了更优越的预测能力。
58.根据权利要求53所述的系统，其中与所述第一生物标志物的表达的定量或所述第二生物标志物的表达的定量相比，所述方法提供了更优越的预测能力。
59.根据权利要求56所述的方法，其中与所述第一生物标志物的表达的定量或所述第二特定生物标志物的表达的定量相比，所述方法提供了更优越的预测能力。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述阳性预测值为65％或更高。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述阳性预测值为70％或更高。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述阳性预测值为75％或更高。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述阴性预测值为65％或更高。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述阴性预测值为80％或更高。
66.一种用于确定肿瘤组织样本中生物标志物阳性值的系统，所述系统包括：
包括存储器的处理电路，所述存储器包括：
光谱解混器，其被配置成接收源于成像装置的图像数据，将所述图像数据分离成未混合的图像数据，且通过多个数据通道提供所述数据，其中在第一数据通道中的所述未混合的图像数据描述可归因于细胞核的荧光信号，在第二数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于感兴趣的子集组织的荧光信号，且在第三数据通道中的所述未混合的数据描述可归因于第一生物标志物的荧光信号；
细胞掩膜器，其被配置成使用源于所述第一数据通道的图像数据并生成代表在视野中的所有核的图像且扩大所述图像以生成细胞掩膜；
子集区域掩膜器，其被配置成使用源于所述第二数据通道的图像数据并生成在所述视野中的所有子集组织区域的掩膜；
第一生物标志物掩膜器，其被配置成使用源于所述第三数据通道的图像数据并生成表达所述第一生物标志物的在所述视野中的所有细胞的第一生物标志物掩膜；
子集细胞掩膜器，其被配置成组合所述细胞掩膜和所述子集组织区域掩膜以生成非子集细胞掩膜和子集细胞掩膜中的至少一个；
组合掩膜器，其被配置成组合所述生物标志物掩膜和所述非子集细胞掩膜和所述子集细胞掩膜中的至少一个；
阳性计算器，其被配置成计算生物标志物阳性值。
67.根据权利要求66所述的系统，其中所述计算器被配置成将所述生物标志物掩膜的面积除以所述非子集细胞掩膜和所述子集细胞掩膜中的至少一个的面积以计算所述生物标志物阳性值。
68.根据权利要求66所述的系统，其中所述第一生物标志物包括选自PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86的生物标志物。
69.根据权利要求66所述的系统，其中所述第二生物标志物不同于所述第一生物标志物且包括选自PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD16、CD56、CD68、CD163、CD80和CD86的生物标志物。
70.根据权利要求66所述的系统，其中所述感兴趣的子集组织是肿瘤组织，所述子集细胞是肿瘤细胞，且所述非子集细胞为非肿瘤细胞。
71.一种系统，其包括图像处理单元，其被配置成：
接收源于成像装置的图像数据，所述图像数据描述取自患者的组织的样本；以及
确定生物标志物阳性值，所述值代表了相对于样本中一个类型的细胞的总量而言样本中表达感兴趣的生物标志物的所述类型的细胞的量。
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