CN108450462B

CN108450462B - 法尼醇对甲氧基丙烯酸类杀菌剂在防治黑粉病中的增效应用

Info

Publication number: CN108450462B
Application number: CN201810279381.XA
Authority: CN
Inventors: 常长青; 仇善旭; 蔡恩平; 吴熔熔; 王雨婷; 王金佩; 张炼辉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-04-01
Filing date: 2018-04-01
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2038-04-01
Also published as: CN108450462A

Abstract

本发明公开法尼醇与甲氧基丙烯酸类杀菌剂在防治黑粉病的杀菌增效新用途。其增效组合可应用于防治由孢堆黑粉菌属（Sporisorium）和黑粉菌属（Ustilago）引起的甘蔗黑粉病、玉米黑粉病及其他作物的黑粉病等，具有较高的协同增效作用，能大幅减少化学农药的使用量，防治效果明显优于单个药剂使用。

Description

法尼醇对甲氧基丙烯酸类杀菌剂在防治黑粉病中的增效应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及法尼醇和甲氧基丙烯酸类杀菌剂的增效作用，主要应用于防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病以及由孢堆黑粉菌属和黑粉菌属引起的其他作物黑粉病等。

背景技术

黑粉病主要由黑粉菌所引起的植物病害，据不完全统计，黑粉菌大约有1200种，可侵染4000多种植物，它们的寄主包括草科植物和世界上重要作物如：玉米、甘蔗、大麦、小麦、燕麦、高粱等。黑粉菌的特征是在侵染寄主的组织上形成成堆黑色粉状的冬孢子堆。

甘蔗是制糖业的主要原料，玉米则是主要的粮食作物，它们同时也是重要的饲料作物和生物质能源材料。由孢堆黑粉菌属（sporisorium）引起的甘蔗黑粉病和黑粉菌属（Ustilago）引起玉米黑粉病严重影响作物的产量和品质

目前，防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病采用的措施包括育种和化学防治。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是近年来开发的一类高效、广谱杀菌剂，代表产品有嘧菌酯（azoxystrobin）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）等，它们具有保护、治疗、铲除、渗透作用，无致癌和致突变的特点，对黑粉菌有良好的防治效果。但是由于广泛使用该化学药剂，其抗性不断发展，杀菌作用日益减弱，使其田间用量不断加大，所以为解决这一问题，开发增效剂成为一种主要解决途径。

法尼醇（Farnesol）是一种倍半萜化合物，分子式为C₁₅H₂₆O（3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇），同分异构体主要分为反-反式、反-顺式、顺-反式和顺-顺式，天然存在于合金欢、巴西檀木、黄葵子、玫瑰香、茉莉及橙花的香精中，也是真菌产生的一种小分子物质，能调节细胞形态、生长、生物膜形成、抗氧化应激和菌体生活的其他过程。法尼醇的结构如下：

。

发明内容

本发明的目的在于提供的法尼醇在防治黑粉病的新用途。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现:

法尼醇在甲氧基丙烯酸类杀菌剂防治黑粉病中的增效作用中的应用；所述黑粉病主要包括甘蔗黑粉病、玉米黑粉病和由孢堆黑粉菌属和黑粉菌属引起的其他作物黑粉病。

所述的应用，具体地，所述黑粉病选自甘蔗黑粉病、玉米黑粉病。

所述法尼醇的使用浓度为0.01～1μM，优选为0.02～0.5μM，与甲氧基丙烯酸类杀菌剂混配使用，以增加防治效果。

所述甲氧基丙烯酸类杀菌剂为嘧菌酯。

优选地，所述嘧菌酯为25%悬浮剂，使用浓度为稀释10000～800000倍。

优选地，所述法尼醇与嘧菌酯混配比是：0.15μM法尼醇+稀释4×10⁴倍25%嘧菌酯悬浮剂。

优选地，所述法尼醇与嘧菌酯混配比是0.04μM法尼醇+稀释8×10⁵倍25%嘧菌酯悬浮剂。

优选地，针对玉米黑粉菌，所述法尼醇与嘧菌酯混配比是0.2μM 法尼醇+稀释4×10⁴倍25%嘧菌酯悬浮剂。

本发明所述的法尼醇为购买所得，也可以通过植物或微生物提取到；将所述法尼醇与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯）通过不同混配比，处理甘蔗黑粉病病菌（Sporisorium scitamineum）担孢子，通过统计其抑制率、增效比、菌落生长情况，确定法尼醇与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂混配使用可显著提高抑菌作用，大幅度降低甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的使用量。所以将其作为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在防治黑粉病上的增效剂有着很好的前景。

基于以后生产应用成本控制，本发明提供了所述法尼醇与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂混合配制以0.01μM~1μM浓度范围应用于防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1）本发明中法尼醇在与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂混配时，明显优于单个药剂使用效果，可以显著提高杀菌能力。目前，25%嘧菌酯悬浮剂在田间推荐用量为1000-5000倍，而本发明中0.15μM的法尼醇与40000倍的苯醚甲环唑混用达到的增效作用为单独使用的34倍，极大的降低嘧菌酯的田间用量。

2）法尼醇（Farnesol）作为植物和微生物产生的一种天然产物，具有绿色，安全，天然存在于环境中也可以被土壤微生物降解等优点。本试验首次将法尼醇作为一种增效剂来防治黑粉病，研究具有新颖性。

附图说明

图1 法尼醇和嘧菌酯混用对甘蔗黑粉菌的抑菌效果，其中，1：0.08μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.04μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍；2：0.1μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.05μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍；3：0.2μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.1μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍；4：0.3μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.15μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍；5：0.4μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.2μMfarnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍；6：0.5μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.25μMfarnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍。

图2 法尼醇和嘧菌酯混配对甘蔗黑粉菌的毒力效果，其中，A:CK；B:嘧菌酯40000倍；C:0.1μM Farnesol；D:0.2μM Farnesol；E:0.3μM Farnesol；F:0.5μM Farnesol； G:嘧菌酯80000倍+0.05μM Farnesol；H:嘧菌酯80000倍+0.1 μM Farnesol；J:嘧菌酯80000倍+0.15μM Farnesol；K:嘧菌酯80000倍+0.25μM Farnesol

图3 法尼醇在嘧菌酯对甘蔗黑粉菌毒力增效作用（甘蔗黑粉菌），其中，1:Azo（嘧菌酯）稀释2×10⁴倍；2:0.4μM Farnesol；3:Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍+0.02μM Farnesol；4:Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍+0.025μM Farnesol；5:Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍+0.05μMFarnesol；6:Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍+0.1μM Farnesol；7:Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍+0.15μM Farnesol；8:Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍+0.2μM Farnesol

图4法尼醇与嘧菌酯对甘蔗黑粉菌抑制率的最优混配比，其中，Azo（嘧菌酯）:稀释2×10⁴倍；Far:0.08μM Farnesol

图5法尼醇与嘧菌酯对玉米黑粉菌的增效作用，其中，A:CK；B：Azo（嘧菌酯）稀释2×10⁴倍；C：0.4μM Farnesol；D：0.2μM Farnesol+Azo（嘧菌酯）稀释4×10⁴倍。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

供试材料

法尼醇( CAS Number:4602-84-0)从sigma公司购买所得。并将所述法尼醇用无水乙醇稀释成浓度为3.98mM母液备用。25%嘧菌酯悬浮剂为中国农科院植保所生产。供试甘蔗黑粉病菌冬孢子采自广西田间自然发病的甘蔗黑粉病植株，供试的1对甘蔗黑粉病菌担孢子WT17、WT18为该甘蔗黑粉病病株上冬孢子分离所得，并经鉴定二者分别为“+”和-”的单倍体，能相互识别，进行有性配合产生双倍体菌丝。本实验室所用培养液为YEPSA+0.5%甘油。

供试培养基

YEPSA培养基：酵母浸出物10 g、蛋白胨20 g、蔗糖20 g、琼脂18 g，加去离子水定容至1000 mL后常规灭菌。YEPS液体培养基：不加琼脂的YEPSA培养基。培养基在使用时均添加0.5%甘油助溶。

实例一

在预备试验的基础上，先将法尼醇和25%嘧菌酯悬浮剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（分别为0.08μM 、0.1μM 、0.2μM 、0.3μM、0.4μM 、0.5μM farnesol，嘧菌酯稀释4×10⁴倍，0.04μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍，0.05μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍，0.1μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍，0.15μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍，0.2μMfarnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍，0.25μM farnesol+嘧菌酯稀释8×10⁴倍）。从平板上挑取少许担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液，次日离心收集菌体，用YEPS液体培养基重悬菌体（OD600为0.2）待用。分别吸取300μL不同浓度母液到2mL灭菌离心管中，加入等量的担孢子悬浮液混匀，以不加药剂YEPS液体培养基为对照，各浓度处理设置三个重复。然后用分光光度计测量各处理起始OD600后，置于28℃，200rpm/min摇床中培养20h，在测得各处理的最终OD600，通过计算OD600净增长量，求出抑制率。

实验结果显示（请参见图1），法尼醇在和嘧菌酯混配使用时其抑菌效果明显优于单个药剂使用效果。当0.04μM的法尼醇与稀释8×10⁴倍嘧菌酯使用，抑制率达到92%以上。而两者单独的抑制率仅为8%和56%。

实例二

在预备试验的基础上，先将法尼醇和25%嘧菌酯悬浮剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.5μM，嘧菌酯：稀释4×10⁴倍）。从平板上挑取少许担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD600为0.2），分别吸取不同浓度的母液500μL到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为单独使用对照组；另分别吸取法尼醇不同浓度母液250μL与250μL嘧菌酯母液混合于5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为混配组；吸取YEPS500μL到5mL灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，记为对照组，设置重复，置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释10³倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。最后确定法尼醇和25%嘧菌酯悬浮剂对黑粉菌增殖的毒力效果。实验通过控制嘧菌酯的用量，不断减少法尼醇使用浓度（0.5μM、0.3μM、0.2μM、0.1μM），结果显示两者混配时浓度减半，但是抑菌效果却比单独使用的要好，当0.25μM法尼醇与嘧菌酯混配使用，抑菌效果几乎达到100%，其增益效果也十分明显（请参见图2）。

在以上基础上，将法尼醇使用浓度不断降低，寻求法尼醇最低有效浓度。单独使用对照组：法尼醇：0.4μM，嘧菌酯：2×10⁴倍；混配组（法尼醇+嘧菌酯）：0.02μM+4×10⁴倍,0.025μM+4×10⁴倍，0.05μM+4×10⁴倍，0.1μM+4×10⁴倍0.15μM+4×10⁴倍，0.2μM+4×10⁴倍；对照组：YEPS，处理同上。置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释10⁴倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。统计各处理菌落数量，并以对照组增效为1，计算各处理组增效比。

实验结果显示（请参见图3），法尼醇与嘧菌酯混配使用其效果比单独使用且浓度扩大一倍的效果还要明显，说明两者具有协同增效作用。图中显示随着法尼醇浓度提高，增效作用不断增加，对黑粉菌增殖毒力作用的最优混配比为：0.15μM+稀释4×10⁴倍嘧菌酯，增效比达到34倍。

实例三

在预备试验的基础上，先将法尼醇和25%嘧菌酯悬浮剂按比例配置成一定浓度梯度的母液备用（法尼醇：0.08μM、嘧菌酯：稀释4×10⁴倍）。从平板上挑取少许担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD600为0.2）待用。将嘧菌酯母液依次稀释浓度变为原来的0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍。取250μL的法尼醇母液与相同体积的不同浓度梯度的嘧菌酯混配于离心管中，并分别以500μL的法尼醇和嘧菌酯母液作为单独使用组；500μLYEPS作为空白对照，设置重复，所有离心管中再加入500μL的菌液混匀，置于28℃，200rpm/min摇床中培养20h，再测得各处理的最终OD600，通过计算OD600净增长量，计算抑制率。

请参见图4，Farnesol与甲氧基丙烯酸类杀菌剂在防治甘蔗黑粉病病菌上具有协同增效作用且法尼醇的加入可以使化学药剂的用量大幅减少，图中所示当0.04μM法尼醇与嘧菌酯混配时，嘧菌酯的浓度可以降低为1/10，且其抑制率还要高于其单独使用效果。0.08μM法尼醇抑制率为0.13，嘧菌酯母液抑制率为0.64,当0.04μM法尼醇与稀释0.1倍嘧菌酯母液浓度混配时抑制率为0.87。得到对黑粉菌抑制率最优的混配比为0.04μM法尼醇+稀释8×10⁵倍25%嘧菌酯悬浮剂(见图4中第6组）。

实例四

在预备试验的基础上，先将法尼醇和25%嘧菌酯悬浮剂配置成：法尼醇0.4μM，25%嘧菌酯悬浮剂稀释2×104倍母液待用。从平板上挑取少许担孢子于6mLYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μL至50mLYEPS培养液中扩大培养（至OD600为0.2）待用。分别取0.3μM法尼醇和稀释2×10⁴倍嘧菌酯母液、YEPS各500μL于不同灭菌离心管中，再取0.4μM法尼醇和稀释2×10⁴倍嘧菌酯母液各250μL于同一离心管中，将各离心管中加入500μL菌悬液，设置三组重复。置于28℃，200rpm/min摇床中培养24h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各离心管中处理的菌液稀释10⁵倍，吸取200μL涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。统计菌落数量，观察增益效果。

结果显示（参见图5）0.2μM法尼醇+稀释4×10⁴倍25%嘧菌酯悬浮剂的混配比同样适用于抑制玉米黑粉菌的增殖生长，由图中看出0.4μM法尼醇和嘧菌酯的抑制效果明显没有两者混配达到的抑制效果强。所以针对玉米黑粉菌，0.2μM法尼醇+稀释4×10⁴倍25%嘧菌酯悬浮剂为最优混配比。

Claims

1.法尼醇在甲氧基丙烯酸类杀菌剂防治黑粉病中的增效作用中的应用，所述黑粉病选自甘蔗黑粉病、玉米黑粉病，所述甲氧基丙烯酸类杀菌剂为嘧菌酯。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述法尼醇的使用浓度为0.01～1μM，与嘧菌酯混配使用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述法尼醇的使用浓度为0.02μM～0.5μM。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述嘧菌酯为25%悬浮剂，使用浓度为稀释10000～800000倍。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述法尼醇与嘧菌酯混配比是：0.15μM法尼醇+稀释4×10⁴倍25%嘧菌酯悬浮剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，针对玉米黑粉菌，所述法尼醇与嘧菌酯混配比是0.2μM 法尼醇+嘧菌酯稀释4×10⁴倍。