CN108440369A - 一种肿瘤早期诊断探针及其合成和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类肿瘤早期诊断相关的醌氧化还原酶响应型的近红外荧光探针化合物及其合成和应用，所述化合物结构如式(I)所示，其中R1和R2相同或不同，R1和R2独立的选自C1‑6的直链烷基，C1‑6的直链烷基羧基、磺酸基或C1‑6的直链烷基酯基；X为卤素。本发明所述化合物初步的细胞共聚焦实验证明本发明化合物具有良好的醌氧化还原酶响应能力，且能够产生易检测的强荧光，可以用于肿瘤早期检测。

Description

一种肿瘤早期诊断探针及其合成和应用
技术领域
本发明涉及与肿瘤早期诊断有关的高等有机合成与生物成像领域，具体涉及一类醌氧化还原酶响应型的近红外荧光探针化合物，及该类化合物的合成与应用。
背景技术
肿瘤严重威胁人类健康，其诊断与治疗成为了精准医学的重要研究方向。醌氧化还原酶1(NQO1)是一种人体细胞中氧浓度升高时用于清除过氧化物和超氧化物的酶，在细胞清除外源毒性物质的过程中发挥重要作用。它以NADPH为受体，催化醌类化合物发生还原反应。部分恶性肿瘤细胞会高度表达NQO1，如U87细胞系、MCF-7细胞系等，这种高表达的NQO1有助于使恶性肿瘤细胞对抗产活性氧类化疗药物，导致化疗效果下降。
放射性造影检查虽然已成功的用于肿瘤成像，但是成本较高、仪器设备要求高。与此同时分辨率有限，病灶定位模糊。相较于放射性造影检查，基于近红外荧光探针的诊疗技术具有毒副作用低、生物安全性好、高的时空分辨率的优势，可实现活体可视无创实时成像。利用NQO1靶向配体和荧光探针的连接，可以获得生物相容性好、灵敏性高、特异性高、响应迅速、荧光量子产率高的肿瘤响应型荧光探针，突出表现在极低的生物毒性，即使探针化合物浓度高达28μM/L，细胞存活率依然保持在80％以上。在肿瘤部位产生易检测的强荧光且持续时间长，其Strokes位移达到100nm，可以有效的降低噪音带来的影响，避免因激发光引起的荧光检测误差，极大的提高了检测准确性，可运用于癌症早期检测与荧光外科手术治疗。与已报道的NQO1响应型探针相比，本发明的探针最大发射波长达到800nm，减少了生物体自身荧光造成的背景干扰，有利于实际应用。通过对NQO1高表达的肿瘤细胞进行精准成像，可提高放化疗联合治疗的成效，为抗肿瘤治疗提供了新思路。
发明内容
本发明公开一种醌氧化还原酶响应的近红外荧光探针化合物，本发明所述化合物初步的细胞成像实验证明本发明化合物具有良好的醌氧化还原酶响应作用，且能够在醌氧化还原酶的作用下产生易检测的强荧光，可用于肿瘤成像。
本发明的化合物(I)结构式如下：
式中，R1和R2相同或不同，R1和R2独立的选自C1-6的直链烷基，C1-6的直链烷基羧基、磺酸基或C1-6的直链烷基酯基；优选甲基、乙基或丙基；X为卤素，优选为I。
本发明还公开了化合物(I)的制备方法，优选的制备方法如下：
其中，R1和R2相同或不同，R1和R2独立的选自C1-6的直链烷基，C1-6的直链烷基羧基、磺酸基或C1-6的直链烷基酯基；优选甲基、乙基或丙基；X为卤素，优选为I。
优选的，化合物3的合成步骤中，采用氮气保护，反应温度为50～90℃，优选70℃。
优选的，化合物4的合成步骤中，使用氮气保护，所采用的溶剂为乙腈、丙酮、水的混合溶剂或者乙腈、丙酮的混合溶剂，优选为乙腈、丙酮、水的混合溶剂。
优选的，化合物a的合成步骤中，溶剂为无水N，N-二甲基甲酰胺或无水N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液，优选为N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液。反应温度为60～100℃，优选80℃。
优选的，化合物b的合成步骤中，溶剂为二氯甲烷或乙腈，优选为乙腈，反应温度70～90℃，优选为85℃。
优选的，Cy7-C1的合成步骤中，溶剂为丁醇或丁醇和甲苯的混合溶液，优选为丁醇和甲苯的混合溶液，反应温度为100～130℃，优选为120℃，反应时间为8～20h，优选为12h。
优选的，Cy-NH的合成步骤中，条件是氮气保护，溶剂为无水N，N-二甲基甲酰胺或无水N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液，优选为无水N，N-二甲基甲酰胺。
优选的，LGT-80的合成步骤中，溶剂是无水N，N-二甲基甲酰胺或无水N，N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合溶液，优选为N，N-二甲基甲酰胺。反应温度为0～50℃，优选为从0℃逐渐升温至室温。
本发明还提供一种包含式(I)化合物的组合物或诊断试剂盒。
本发明还提供所述式(I)化合物或所述组合物或诊断试剂盒在醌氧化还原酶响应或肿瘤早期诊断中的应用。
下面实验中涉及的化合物代号等同于此处代号所对应的化合物。
本发明中的“直链烷基”表示1-20个碳原子的直链饱和的脂烃基(本申请书中提到的数字范围，例如“1-6”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括6个碳原子)，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
本发明基于醌酸结构特异性响应醌氧化还原酶，发明了结构新颖、具有较好的理化性质的小分子近红外荧光探针，该探针在U87和MCF-7肿瘤细胞共聚焦成像实验中表现出良好的醌氧化还原酶响应能力，有望进一步开发用于肿瘤早期诊断。
附图说明
图1探针吸收和荧光响应实验
图2探针动力学和滴定实验
图3探针选择性实验
图4探针酶动力学实验
图5探针细胞毒性实验
图6探针细胞共聚焦成像实验
图7探针氢谱表征
图8探针碳谱表征
图9探针质谱表征
具体实施方式
以下为本发明优选的实施方式。需要说明的是，在本领域工作的技术人员，依照相关原理和规律，围绕本发明做出的改进和修饰，也应当包含在发明的保护范围之内。
实施例1
将2，3，5-三甲基苯-1，4-二醇(304.4mg，2mol，1equiv.)与甲磺酸(5ml)加入反应瓶中，抽充氮气，注射入3-甲基丁-2-烯酸甲酯溶液(0.3ml，273.94mg，2.4mol，1.2equiv.)后加热到50℃搅拌0.5h。碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液终止反应，乙酸乙酯萃取。旋除溶剂得到化合物3。化合物3(232.32mg，1mol，1equiv.)与乙腈(9ml)、丙酮(2ml)、水(9ml)、NBS(266.97mg，1.5mol，1.5equiv.)加入反应瓶中，抽充氮气，常温下反应0.5h后用乙酸乙酯冲洗。饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，调节水层pH值至2-3。收集有机层并旋除溶剂得到黄色油状物质化合物4.
冰浴条件下，将POCl3(10.5mL，115mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)缓慢加入DMF(20mL，258mmol)与二氯甲烷(15mL)混合溶液中，搅拌0.5h。向溶液中逐滴加入环己酮(5g，50mmol)。混合溶液回流6h后倒入冰水混合物中，12h后将生成的黄色晶体过滤得到黄色固体粉末，即化合物a。用50ml乙腈在室温下溶解2，3，3-三甲基吲哚(2g，12.5mmol)和丙基碘(10.6g，62mmol)，在85℃下避光搅拌15h。旋除溶剂用无水乙醚重结晶获得紫色粉末，即化合物b。将化合物a(0.52g，3mmol，1equiv.)，b(1.97g，6mmol，2equiv.)溶于丁醇和甲苯的混合溶液(20mL，3∶7，v/v)，120℃避光搅拌12h。冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂以获得粗产物，并将其从乙醚中重结晶两次，获得了绿色粉末Cy7-Cl。
将Cy7-Cl(668mg，1mmol，1equiv.)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)，在氮气环境下中加入哌嗪(345mg，4mmol，4equiv.)。混合溶液在室温下避光搅拌过夜。柱层析(SiO2；CH2Cl2/CH3OH，40∶1，v/v)纯化，获得蓝色固体Cy-NH。
将Cy-NH(500mg，0.697mmol，1equiv.)和吡啶(11mg，0.14mmol，0.2equiv.)溶于DMF(5ml)，在氮气环境下搅拌0.5h。化合物4(348mg，1.39mmol，2equiv.)的DMF溶液(3ml)逐滴加入反应瓶中，将温度从0℃逐渐升温至室温，避光反应12h。柱层析(SiO2，CH2Cl2/CH3OH，30∶1，v/v)纯化得到产物LGT-80。
实施例2
将2，3，5-三甲基苯-1，4-二醇(304.4mg，2mol，1equiv.)与甲磺酸(5ml)加入反应瓶中，抽充氮气，加入3-甲基丁-2-烯酸甲酯溶液(0.3ml，273.94mg，2.4mol，1.2equiv.)后加热到70℃搅拌2h。碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液终止反应，乙酸乙酯萃取。旋除溶剂得到化合物3。化合物3(232.32mg，1mol，1equiv.)与乙腈(9ml)、丙酮(2ml)、水(9ml)、NBS(266.97mg，1.5mol，1.5equiv.)加入反应瓶中，抽充入氮气，常温下反应1h后用乙酸乙酯冲洗。饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，调节水层pH值至2-3。收集有机层并旋除溶剂得到黄色油状物质化合物4.
将POCl3(10.5mL，115mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)缓慢加入常温下的DMF(20mL，258mmol)中并搅拌0.5h。逐滴加入环己酮(5g，50mmol)。混合溶液回流4h。12h后将生成的黄色晶体过滤得到黄色固体粉末，即化合物a。用50ml乙腈在室温下溶解2，3，3-三甲基吲哚(2g，12.5mmol)和丙基碘(10.6g，62mmol)，85℃下避光搅拌15h。旋除溶剂，无水乙醚重结晶获得紫色粉末，即化合物b。将化合物a(0.52g，3mmol，1equiv.)，b(1.97g，6mmol，2equiv.)溶于丁醇和甲苯的混合溶液(20mL，3∶7，v/v)，120℃避光搅拌12h。冷却至室温后，在减压蒸馏除去溶剂获得粗产物，并将其从乙醚中重结晶两次，获得了绿色粉末Cy7-Cl。
将Cy7-Cl(668mg，1mmol，1equiv.)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)，在氮气环境中加入哌嗪(345mg，4mmol，4equiv.)。混合溶液在室温下避光搅拌过夜。柱层析(SiO2；CH2Cl2/CH3OH，40∶1，v/v)纯化，获得蓝色固体Cy-NH。
将Cy-NH(500mg，0.697mmol，1equiv.)和吡啶(11mg，0.14mmol，0.2equiv.)溶于DMF(5ml)，在氮气环境下搅拌0.5h。化合物4(348mg，1.39mmol，2equiv.)的DMF溶液(3ml)逐滴加入反应瓶中，将温度从0℃逐渐升温至室温，避光反应12h。柱层析(SiO2，CH2Cl2/CH3OH，30∶1，v/v)纯化得到产物LGT-80。
实施例3
将2，3，5-三甲基苯-1，4-二醇(304.4mg，2mol，1equiv.)与甲磺酸(5ml)加入反应瓶中，抽充氮气，加入3-甲基丁-2-烯酸甲酯溶液(0.3ml，273.94mg，2.4mol，1.2equiv.)后加热到70℃搅拌2h。碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液终止反应并用乙酸乙酯萃取。旋除溶剂得到化合物3。化合物3(232.32mg，1mol，1equiv.)与乙腈(9ml)、丙酮(2ml)、水(9ml)、NBS(266.97mg，1.5mol，1.5equiv.)加入反应瓶中，抽充氮气，常温下反应1h后用乙酸乙酯冲洗。饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，调节水层pH值至2-3。收集有机层并旋除溶剂得到黄色油状物质化合物4.
冰浴条件下，将POCl3(10.5mL，115mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)缓慢加入DMF(20mL，258mmol)与二氯甲烷(15mL)混合溶液中，搅拌0.5h。向溶液中逐滴加入环己酮(5g，50mmol)。混合溶液回流6h后倒入冰水混合物中，12h后将生成的黄色晶体过滤得到黄色固体粉末，即化合物a。30ml甲醇在室温下溶解2，3，3-三甲基吲哚(2g，12.5mmol)和丙基碘(10.6g，62mmol)，在85℃下避光搅拌8h。旋除溶剂后用无水乙醚重结晶获得紫色粉末，即化合物b。将化合物a(0.52g，3mmol，1equiv.)，b(1.97g，6mmol，2equiv.)溶于丁醇和甲苯的混合溶液(20mL，3∶7，v/v)，120℃避光搅拌12h。冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂以获得粗产物，并将其从乙醚中重结晶两次，获得了绿色粉末Cy7-Cl。
将Cy7-Cl(668mg，1mmol，1equiv.)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)，在氮气环境中加入哌嗪(345mg，4mmol，4equiv.)。混合溶液在室温下避光搅拌过夜。柱层析(SiO2；CH2Cl2/CH3OH，40∶1，v/v)纯化粗产物，获得蓝色固体Cy-NH。
将Cy-NH(500mg，0.697mmol，1equiv.)和吡啶(11mg，0.14mmol，0.2equiv.)溶于DMF(5ml)，在氮气氛围下搅拌0.5h。化合物4(348mg，1.39mmol，2equiv.)的DMF溶液(3ml)逐滴加入反应瓶中，将温度从0℃逐渐升温至室温，避光反应12h。柱层析(SiO2，CH2Cl2/CH3OH，30∶1，v/v)纯化得到产物LGT-80。
实施例4
将2，3，5-三甲基苯-1，4-二醇(304.4mg，2mol，1equiv.)与甲磺酸(5ml)加入反应瓶中，抽充氮气，注射入3-甲基丁-2-烯酸甲酯溶液(0.3ml，273.94mg，2.4mol，1.2equiv.)后加热到70℃搅拌2h。碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液终止反应，乙酸乙酯萃取。旋除溶液得到化合物3。化合物3(232.32mg，1mol，1equiv.)与乙腈(9ml)、丙酮(2ml)、水(9ml)、NBS(266.97mg，1.5mol，1.5equiv.)加入反应瓶中，抽充氮气，常温下反应1h后用乙酸乙酯冲洗。饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，调节水层pH值至2-3。收集有机层并旋除溶剂得到黄色油状物质化合物4。
冰浴条件下，将POCl3(10.5mL，115mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)缓慢加入DMF(20mL，258mmol)与二氯甲烷(15mL)混合溶液中，搅拌0.5h。向溶液中逐滴加入环己酮(5g，50mmol)。将混合溶液回流6h后倒入冰水混合物中，12h后将生成的黄色晶体过滤得到黄色固体粉末，即化合物a。用50ml乙腈在室温下溶解2，3，3-三甲基吲哚(2g，12.5mmol)和丙基碘(10.6g，62mmol)，在85℃下避光搅拌15h。旋除溶剂后用无水乙醚重结晶获得紫色粉末，即化合物b。将化合物a(0.52g，3mmol，1equiv.)，b(1.97g，6mmol，2equiv.)溶于丁醇和甲苯的混合溶液(20mL，3∶7，v/v)，120℃避光搅拌12h。冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂以获得粗产物，并将其从乙醚中重结晶两次，获得了绿色粉末Cy7-Cl。
将Cy7-Cl(668mg，1mmol，1equiv.)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)，在氮气环境中加入哌嗪(345mg，4mmol，4equiv.)。混合溶液在室温下避光搅拌过夜。柱层析(SiO2；CH2Cl2/CH3OH，40∶1，v/v)纯化，获得蓝色固体Cy-NH。
将Cy-NH(500mg，0.697mmol，1equiv.)和吡啶(11mg，0.14mmol，0.2equiv.)溶于DMF(5ml)，在氮气氛围下搅拌0.5h。冰浴条件下，化合物4(348mg，1.39mmol，2equiv.)的DMF溶液(3ml)逐滴加入反应瓶中，避光反应8h。柱层析(SiO2，CH2Cl2/CH3OH，30∶1，v/v)纯化得到产物LGT-80。
实施例5本发明的化合物的光学性质、动力学及滴定、选择性、酶动力学、细胞实验及结果：
1.化合物吸收和荧光响应实验
将化合物分子LGT-80溶于含有1％DMSO与0.007％BSA，pH＝7.4的PBS溶液中。测试浓度：探针浓度为5×10-6M，NADH浓度为1×10-4M，NQO1浓度为1μg/mL。图1为探针吸收和荧光响应实验。可以看出，探针本身没有明显的荧光发射，但是当体系中存在NQO1及其受体NADH，800nm处出现一个强的荧光发射。可以看出探针具有良好的NQO1响应性可以较为理想的识别出环境中存在的NQO1。
2.探针动力学和滴定实验
图2为化合物动力学和滴定实验。可以看出当体系中存在NQO1及其受体NADH，荧光强度随着时间的延长和探针浓度的增大而逐渐增强，表现出良好的线性关系。在20min内均可以检测到强荧光，满足实时监测的需求。
3.探针选择性实验
图3为化合物选择性实验，即抗干扰实验。可以看出反应体系中其他的酶、硫醇、氨基酸、金属离子均对化合物荧光无影响，说明化合物对NQO1具有高的特异性，具备较高的抗干扰能力，可以准确的显示机体内NQO1的分布。
4.探针酶动力学实验
为探究探针浓度对于NQO1反应速率的影响，进行米氏方程酶动力学分析，图4为化合物酶动力学实验。可以看出，在8～10×10-6M的探针浓度下酶促反应速率达到最高。
5.细胞毒性实验
将A549、MCF-7和L02细胞培养在添加10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL)的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(1)将处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化液处理，制成浓度为4×105的细胞悬液，向96孔细胞培养板中加入100μL培养过夜。
(2)待细胞贴壁后加入浓度梯度探针，其中化合物用培养基配置成2倍于所需浓度，分别向对应的孔中加入100μL，纯培养基组为阴性对照。将加好化合物的96孔细胞培养板至于37℃、5％CO2恒温、饱和湿度的条件下孵育16h。
(3)96孔细胞培养板取出，倒置显微镜观察细胞状态后每孔加入20μL的MTT溶液，继续孵育4h。
(4)取出96孔细胞培养板，将培养基从孔中吸出，每孔加入150μL的DMSO溶液，置摇床上低速振荡10min。
(5)将96孔细胞培养板放入酶标仪中检测。
图5为探针的细胞毒性实验结果，在浓度高达28μM/L时依然表现很好的生物相容性，细胞存活率均高于80％，为其进一步的生物应用奠定了基础。
6.细胞亲和力实验
将处于对数生长期的U87、MCF-7、L02细胞用0.25％胰酶消化液处理，调整细胞悬液浓度为5×105个细胞，向共聚焦皿中加入50μL培养过夜。倒置显微镜观察，当整个细胞占据培养皿的70％～80％空间时加入探针(10μM)，继续孵育30min，之后用PBS洗涤细胞三次，最后通过LCFM(FV 1000，Olympus，Japan)检测细胞中荧光信号。图6为探针(LGT-80)的细胞共聚焦成像结果，MCF-7和U87细胞系显示出强的荧光，而L02细胞系没有收集到明显的荧光信号。MCF-7和U87细胞系由于存在过表达的NQO1，会与探针发生特异性识别响应从而发出800nm波长的荧光。阻断实验表明在体系中存在NQO1的抑制剂时，加入探针后没有发现明显荧光，进一步证明荧光的产生是因为探针与体内NQO1作用的结果。上述表明，化合物LGT-80具有高的细胞亲和力且特异性响应细胞内NQO1。

Claims (12)

1.式(I)所示化合物：
其中，R1和R2相同或不同，R1和R2独立的选自C1-6的直链烷基，C1-6的直链烷基羧基、磺酸基或C1-6的直链烷基酯基；X为卤素。
2.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，R1和R2独立的选自甲基、乙基或丙基；X为I。
3.权利要求1所述的式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
其中，R1和R2相同或不同，R1和R2独立的选自C1-6的直链烷基，C1-6的直链烷基羧基、磺酸基或C1-6的直链烷基酯基，优选甲基、乙基或丙基；X为卤素，优选为I。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物3的合成步骤中，采用氮气保护，反应温度为50～90℃，优选70℃。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物4的合成步骤中，采用氮气保护，所采用的溶剂为乙腈、丙酮、水的混合溶剂或者乙腈、丙酮的混合溶剂，优选为乙腈、丙酮、水的混合溶剂。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物a的合成步骤中，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液，优选为N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液。反应温度为60～100℃，优选80℃。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物b的合成步骤中，溶剂为二氯甲烷或乙腈，优选为乙腈，反应温度70～90℃，优选为85℃。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物Cy7-C1的合成步骤中，溶剂为丁醇或丁醇和甲苯的混合溶液，优选为丁醇和甲苯的混合溶液，反应温度为100～130℃，优选为120℃，反应时间为8～20h，优选为12h。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物Cy-NH的合成步骤中，条件是氮气保护，溶剂为无水N，N-二甲基甲酰胺或无水N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液，优选为无水N，N-二甲基甲酰胺。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于化合物I的合成步骤中，溶剂是N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合溶液，优选为N，N-二甲基甲酰胺。反应温度为0～50℃，优选为从0℃逐渐升温至室温。
11.一种包含权利要求1中式(I)所示化合物的组合物或诊断试剂盒。
12.权利要求1中式(I)所示化合物或权利要求11中所述组合物或诊断试剂盒在醌氧还原酶检测识别或肿瘤早期诊断中的应用。
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