CN108409991B - 一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，将京尼平交联胶原在太阳光或模拟太阳光下照射4～12小时。作为优选的，将京尼平交联胶原在太阳光或模拟太阳光下12小时，京尼平交联胶原消褪成乳白色。本发明提供的京尼平交联制品伴生色素的处理方法安全、便捷、生物相容性好。本方法充分利用京尼平交联生物毒性小的优势，在提升结构稳定性的同时解决了伴生色素的显色问题，这为利用可见光制得适配不同肤色的胶原基医用辅料、人工皮肤等提供了研发方向。本发明提供的光照处理方法一方面为交联制品伴生色素在自然光照条件下快速消褪提供了物质基础，另一方面也为直接制备不同颜色的京尼平交联制品提供了模拟太阳光源测试条件。

Description

一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法。
背景技术
胶原、明胶等天然天然高分子材料因其良好的组织相容性和可降解性被广泛应用于组织工程支架、人工皮肤、生物医用植入物、伤口包扎敷料等领域，但由于其机械强度不足，在体内水解过程中不能保持空间构型，且吸收过快，因此，在应用时常加入壳聚糖等成分，以提高支架的弹性模量、临界变形和强度。交联可以使分子内部和分子间通过共价键结合，从而增强高分子聚合物网络的结构稳定性和力学强度和抗蛋白酶降解的能力。常用的交联方法有物理交联和化学交联。但物理交联法交联度较低且不均一。而化学交联法常采用戊二醛、已异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷、甲醛等传统的交联剂，易引起中毒或不良反应。
京尼平作为一种天然生物交联剂，细胞毒性小、生物相容性好，与含氨基基团的化合物交联反应温和，交联制品稳定性强，已成功应用于医用敷料、组织工程血管和骨缺损修复等。京尼平本身是无色的，但是京尼平与氨基酸、蛋白质反应获得的产物会呈现出蓝黑色，其生色基团的特征光吸收峰在590nm附近，与栀子蓝色素近似。该色素稳定性好、有荧光效应、便于医学观察、会缓慢氧化褪色，但因颜色视觉接受度低，京尼平交联制品极少在外科手术中的使用。
为改善蓝黑色素沉积通常会采用降低交联度的方式，但对于提升交联制品的力学强度以及抗降解性则不利。若等色素自身氧化消褪则时间不可控，且无法保证能否满足交联制品的外观使用需求。目前，针对交联过程伴生的蓝黑色素尚无有效的消除手段，这种显色反应多用于创伤修复手术标记或者纹身，京尼平本身作为毒性极低的天然生物交联剂未能发挥自身的作用。因此，在不改变京尼平交联效果以及交联制品安全性的同时，有效控制伴生色素的降解速率则可提升京尼平交联制品的医用市场接受度和使用率。
发明内容
针对现有技术存在问题，本发明的目的在于提供一种可改变京尼平交联胶原显色的方法，具体为一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，以促进提升京尼平交联制品在外科手术中的医用市场接受度和使用率。
为实现上述发明目的，具体提供了如下技术方案：
一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，将京尼平交联胶原在太阳光或模拟太阳光下照射4～12小时。
进一步，所述模拟太阳光的光源辐照度为1000W/m2，紫外光辐照度为30W/cm2。
进一步优选的。将京尼平交联胶原在太阳光或模拟太阳光下12小时，京尼平交联胶原消褪成乳白色。
进一步，所述京尼平交联胶原浸没于水中进行照射以防脱水。
进一步，所述京尼平交联胶原的制备包括如下步骤：
1)搅拌状态下，在5～7mg/ml的酸性胶原溶液中缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶，所述酸性二氧化钛纳米晶水溶胶与酸性胶原溶液的体积占比为3％～5％；
2)用2mol/L的NaOH水溶液调节步骤1)混合溶液pH值至6～8，倒入模具并置于25～40℃水浴中固化成凝胶；
3)将步骤2)凝胶经质量分数为1％的京尼平溶液浸泡交联后呈蓝黑色，即得京尼平交联胶原。
进一步，步骤1)所述酸性胶原溶液通过酶解法提取，保持完整的三股螺旋结构，具有生物活性。
进一步，步骤1)酸性二氧化钛纳米晶水溶胶以无机盐为前驱体通过胶溶工艺制得，溶胶呈淡蓝色半透明。
进一步，所述步骤3)京尼平交联反应温度为20～25℃，时间不小于6h。
进一步，所述京尼平交联胶原的制备还包括步骤4):将步骤3)制备的京尼平交联胶原用纯水清洗至表面无京尼平溶液残留。
本发明的有益效果在于：本发明提供的京尼平交联制品伴生色素的处理方法安全、便捷、生物相容性好。并且引入的纳米二氧化钛是一种高效光催化剂，将其制备成水溶胶与含氨基基团的高分子化合物复合，操作简单、生物相容性好、无二次污染。本方法充分利用京尼平交联生物毒性小的优势，在提升结构稳定性的同时解决了伴生色素的显色问题，还为利用可见光制得适配不同肤色的胶原基医用辅料、人工皮肤等提供了研发方向。本发明提供的光照处理方法一方面为交联制品伴生色素在自然光照条件下快速消褪提供了物质基础，另一方面也为直接制备不同颜色的京尼平交联制品提供了模拟太阳光源测试条件。
附图说明
图1表示经实施例1～4所处理京尼平交联胶原凝胶经光照处理后样品照片；
图2表示经实施例5所处理京尼平交联胶原凝胶经光照处理后样品照片；
图3表示经实施例5所处理京尼平交联胶原凝胶微观结构图；
图4表示光响应胶原基变色材料的细胞毒性测试图；
图5表示光响应胶原基变色材料拉伸试验应力-应变曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明,结合凝胶薄膜拉伸强度试验和凝胶薄膜细胞增殖试验进一步说明本发明的有益效果。但这些实施例只是为了说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其包括的步骤如下：
(1)搅拌状态下，在7mg/ml的酸性胶原溶液中按体积比为5％缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶；
(2)调节混合溶液pH值至6～8，倒入6孔板(6ml/孔)并置于35℃水浴中12h固化成凝胶；
(3)凝胶经质量分数为1％的京尼平溶液6ml浸泡交联12h后显蓝黑色；然后用纯水清洗至胶原表面无京尼平溶液残留；
(4)蓝黑色凝胶原经夏季自然光照6h(10:00-16:00)，凝胶颜色变为浅蓝灰色。
实施例2
一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其包括的步骤如下：
(1)搅拌状态下，在7mg/ml的酸性胶原溶液中按体积比为5％缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶；
(2)调节混合溶液pH值至6～8，倒入6孔板(6ml/孔)并置于35℃水浴中12h固化成凝胶；
(3)凝胶经质量分数为1％的京尼平溶液6ml浸泡交联12h后显蓝黑色；然后用纯水清洗至表面无京尼平溶液残留；
(4)蓝黑色凝胶经夏季自然光照12h(7:00-19:00)，凝胶颜色变为浅棕褐色。
实施例3
一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其包括的步骤如下：
(1)搅拌状态下，在5mg/ml的酸性胶原溶液中按体积比为3％缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶；
(2)调节混合溶液pH值至6～8，倒入6孔板(6ml/孔)并置于35℃水浴中12h固化成凝胶；
(3)凝胶经质量分数为1％的京尼平溶液6ml浸泡交联12h后显蓝黑色；然后用纯水清洗至表面无京尼平溶液残留；
(4)蓝黑色凝胶经模拟太阳光光源(模拟太阳光源辐照度1000W/m2，紫外光辐照度30W/cm2)光照6h，凝胶颜色变为浅棕褐色。
实施例4
一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其包括的步骤如下：
(1)搅拌状态下，在5mg/ml的酸性胶原溶液中按体积比为3％缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶；
(2)调节混合溶液pH值至6～8，倒入6孔板(6ml/孔)并置于35℃水浴中12h固化成凝胶；
(3)凝胶经质量分数为1％的京尼平溶液6ml浸泡交联12h后显蓝黑色；然后用纯水清洗至表面无京尼平溶液残留；
(4)蓝黑色凝胶经模拟太阳光光源(模拟太阳光源辐照度1000W/m2，紫外光辐照度30W/cm2)光照12h，凝胶颜色变为浅黄色。
表面形态
记录经过实施例1～4所述处理方法得到的凝胶颜色变化如图1所示,图1显示京尼平伴生色素在纳米二氧化钛和光照作用下京尼平胶原呈现出浅蓝黑色→浅棕褐色→浅黄色的颜色变化规律。由实施例1～4说明本发明可为利用可见光制得适配不同肤色的胶原基医用辅料、人工皮肤等提供了研发方向。
实施例5
一种利用太阳光消退京尼平交联胶原显色的方法，其包括的步骤如下：
(1)搅拌状态下，在7mg/ml的酸性胶原溶液中按体积比为5％缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶；
(2)调节混合溶液pH值至6～8，倒入6孔板(6ml/孔)并置于35℃水浴中12h固化成凝胶；
(3)凝胶经质量分数为1％的京尼平溶液6ml浸泡交联4h后显浅蓝黑色；然后用纯水清洗至表面无京尼平溶液残留
(4)浅蓝黑色凝胶经夏季自然光照6h(10:00-16:00)连续两天共计12h，凝胶颜色变为乳白色。
表面形态
记录经过实施例5所述处理方法得到的凝胶颜色变化,如图2所示，图2显示京尼平伴生色素在纳米二氧化钛和光照作用颜色直接消退为乳白色，通过实施例5可验证本发明解决了京尼平交联过程伴生的蓝黑色素消退问题。
将实施例5所得变色凝胶冷冻干燥后切片，取断面用SEM观察其内部微观结构,基本如图3所示。图3显示胶原凝胶内部呈现均匀的空洞结构，未有明显的相分离，说明胶原凝胶与纳米二氧化钛水溶胶混合均匀。
细胞毒性
京尼平作为天然交联剂最大的优点是细胞毒性小，最大的缺点是伴生色素的产生。本发明在提供消褪伴生色素的方案中引入了相对安全的纳米二氧化钛水溶胶及光催化反应，保证交联制品的生物相容性是交联制品能用于生物医用领域需优先考虑的问题。Cell Counting Kit简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的高灵敏度快速检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性橙黄色的甲臜产物(formazan)。反应后颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖、细胞毒性、肿瘤药敏试验以及细胞因子活性等检测。
实验步骤：
1)细胞培养
人成纤维细胞HFF-1细胞培养于含青、链霉素(各1U/mL，0.1mg/mL)15％FBS的DMEM培养基中，放置在37℃、5％CO2、相对湿度为100％的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长，经过传代培养用于后续实验。用96孔板进行材料与细胞共培养，先将未经光照处理的凝胶薄膜与实施例1、2、3制得的凝胶薄膜分别放入孔内，铺平。再以1000个/孔铺板，实验组(1)中加入实施例1制得的凝胶薄膜，实验组(2)中加入实施例2制得的凝胶薄膜，实验组(3)中加入实施例3制得的凝胶薄膜，对照组不加入凝胶薄膜，继续培养1、3、5、7天进行测试。
2)CCK-8法检测法
(1)将96孔板移入培养箱中培养(37℃，5％CO2)，培养适当时间(1/3/5/7天)。
(2)每孔加入10μL CCK-8溶液，于培养箱内孵育1-4h。
(3)用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
(4)同时设置空白孔(培养基、CCK)。
3)活力计算
细胞活力(％)＝[A(实验组)-A(空白组)]/[A(对照组)-A(空白组)]×100％
细胞抑制率(％)＝[A(对照组)-A(实验组)]/A(对照组)＝1-细胞活力
A(实验组)：具有经过处理的细胞、CCK溶液的吸光度值
A(空白组)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度值
A(对照组)：具有未经过处理的细胞、CCK溶液的吸光度值
4)实验结果如图4所示，由图4的测试结果可以看出，本发明提供的消褪京尼平交联伴生色素的方法并未显示明显的细胞毒性，人成纤维细胞增殖生长良好、存活率高，交联时间、纳米二氧化钛水溶胶添加量以及光照反应时间并未改变胶原材料本身的生物相容性。
力学强度
胶原是动物所有结缔组织-皮、腱、韧带、软骨等的主要蛋白成分，为结缔组织提供必要的强度支撑，但由可溶性胶原制得的材料强度通常很低，因此一定的力学强度是胶原基生物医用材料能够广泛应用的必要条件。本发明采用动态热机械分析仪(DMA)的拉伸模式进行测试，试样尺寸8.76*5*0.5mm，忽略夹头对试样自由横向收缩的影响，采用动态应力扫描模式，即在30℃、测试频率1.0Hz，拉伸速度0.2000N/min条件下，测量材料动态应变随应力的变化，图5展示了实施例5测得的京尼平交联胶原薄膜拉伸试验应力-应变曲线，拉伸过程中薄膜显示弹性形变，拉伸强度2.94N，断裂伸长率1.35％，拉伸模量4.94MPa，相比未交联胶原薄膜模量1.99MPa提升2倍多，光照时间对拉伸强度影响不大，说明本发明提供的消褪京尼平交联伴生色素的方法未明显破坏分子间交联，引入二氧化钛水溶胶以及光照反应不影响京尼平交联提升制品机械强度。
综合以上具体实施例及测试分析可验证，本发明提供的京尼平交联制品伴生色素的处理方法安全、便捷、生物相容性好。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，将京尼平交联胶原在太阳光或模拟太阳光下照射4～12小时；
所述京尼平交联胶原的制备包括如下步骤：
1）搅拌状态下，在5～7mg/ml的酸性胶原溶液中缓慢滴入0.1mol/L的酸性二氧化钛纳米晶水溶胶，所述酸性二氧化钛纳米晶水溶胶与酸性胶原溶液的体积占比为3%～5%；
2）用2mol/L的NaOH水溶液调节步骤1）混合溶液pH值至6～8，倒入模具并置于25～40℃水浴中固化成凝胶；
3）将步骤2）凝胶经质量分数为1%的京尼平溶液浸泡交联后呈蓝黑色，即得京尼平交联胶原。
2.根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，所述模拟太阳光的光源辐照度为1000W/m2，紫外光辐照度为30W/cm2。
3.根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，将京尼平交联胶原在太阳光或模拟太阳光下12小时，京尼平交联胶原消褪成乳白色。
4.根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，所述京尼平交联胶原浸没于水中进行照射以防脱水。
5.根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，步骤1）所述酸性胶原溶液通过酶解法提取，保持完整的三股螺旋结构，具有生物活性。
6.根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，步骤1）酸性二氧化钛纳米晶水溶胶以无机盐为前驱体通过胶溶工艺制得，溶胶呈淡蓝色半透明。
7. 根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，所述步骤3）京尼平交联反应温度为20～25℃，时间不小于6 h。
8. 根据权利要求1所述一种利用太阳光改变京尼平交联胶原显色的方法，其特征在于，所述京尼平交联胶原的制备还包括步骤4): 将步骤3）制备的京尼平交联胶原用纯水清洗至表面无京尼平溶液残留。
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