CN108409860A - 抗人白细胞介素-4受体α单克隆抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

抗人白细胞介素-4受体α单克隆抗体、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体领域，更具体地，本发明公开了一种重组抗人hIL‑4Rα单克隆抗体、其制备方法和应用。本发明的抗人hIL‑4Rα单克隆抗体能够特异性与人hIL‑4Rα结合，本发明的抗体具有良好的抑制hIL‑4和hIL‑13诱导的各种细胞系增殖等的效果，可应用于制备治疗免疫介导的炎症反应的疾病的药物。

Description

抗人白细胞介素-4受体α单克隆抗体、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗人白细胞介素-4受体α单克隆抗体、其制备方法和应用。
背景技术
当机体受抗原刺激时，体内的抗原特异性淋巴细胞会识别抗原并发生活化、增殖、分化等应答，并最终清除入侵的抗原。T细胞和B细胞是主要的效应细胞。针对不同类型的抗原，T细胞可通过1)直接杀伤靶细胞2)分泌不同类型的细胞因子，扩大和增强免疫应答来发挥免疫效应。研究表明，在过敏性哮喘等过敏性疾病中，白细胞介素(interlukin，IL)-4、IL-5、IL-9和IL-13等Th2型细胞因子介导了主要的病理发展。
哮喘是一种最常见的呼吸道疾病，通常表现为呼吸道炎症、支气管高反应性和支气管壁的结构改变(呼吸道重构)。基因背景和包括过敏原及呼吸系统病毒等环境因素的刺激等诱发了哮喘的发生，主要的病理表现为反复喘息、气短、胸闷和咳嗽。哮喘是一种异质性的疾病，可分为外源性(过敏性)和内生性(非过敏性)哮喘两种。在过敏性哮喘中，发现Th2型细胞因子在支气管中的异常高表达，同时已经证实Th2细胞因子全面介导了炎症反应的发生和发展并促进了呼吸道的病理改变等，是抗哮喘的理想靶点。这些细胞因子促进了包括嗜酸性粒细胞和肥大细胞等炎症细胞的活化和向炎症位点的趋化。嗜酸性粒细胞的成熟主要由IL-5介导；而IL-4和IL-13则靶向B细胞，使其分泌的抗体由IgM向IgE转化，同时通过诱导杯状细胞增生、将支气管成纤维细胞转化成肌成纤维细胞、胶原蛋白沉积和呼吸道平滑肌细胞增殖等诱导支气管重构；IL-9则招募肥大细胞并促进其成熟。IL-4和IL-13均可以通过结合IL-4受体-α(IL-4Rα)而激活对应的信号通路，因此开发IL-4Rα靶向抗体将能同时阻断IL-4和IL-13的病理反应，有望成为高效、安全的抗哮喘药物。
哮喘在全球有230万患者，而且预期在今后的几十年中，患病率仍将升高。当前哮喘通过渐进式治疗来减轻症状并控制风险。吸入式皮质激素是中度哮喘的标准疗法，而严重患者会加上长效β拮抗剂，对于最严重的患者，可能还需要额外的控制药物。这些治疗会导致免疫系统紊乱，同时其他副作用也不低。尽管如此，仍有5％-10％的患者目前无药可治。作为一种严重影响生存质量的慢性疾病，哮喘亟需安全、高效的治疗药物。抗体药物由于特异性强，脱靶效应较低，而且通常具有较长的半衰期，可延长给药周期，在慢性疾病治疗中具有显著优势。
综上所述，研制高效特异的IL-4受体阻断抗体阻断IL-4信号通路将为哮喘等过敏性疾病的治疗带来新的选择。过敏性疾病的慢性疾病及较难根治的特征决定了病人需要长期用药，而抗体药物复杂的生产工艺使得大分子药物的平均价格远远高于小分子药物，因此研发具有更高生物学活性的药物将能降低给药剂量，缩减用药成本，提高药物的可及性。筛选获得具有更高生物学活性的抗IL-4R抗体一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以通过特异性阻断IL-4和IL-13与细胞表面IL-4受体α结合从而阻断IL-4/IL-13信号传导的单克隆抗体，其阻断IL-4/IL-13介导的生物学活性的效率更高，即本发明的重组抗人IL-4Rα单克隆抗体，从而完成了本发明。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗人IL-4Rα单克隆抗体。
本发明的第二个目的在于提供编码所述抗人IL-4Rα单克隆抗体的核苷酸分子。
本发明的第三个目的在于提供包含所述核苷酸分子的表达载体。
本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的在于提供一种制备所述抗人IL-4Rα单克隆抗体的方法。
本发明的第六个目的在于提供包含所述抗人IL-4Rα单克隆抗体的组合物。
本发明的第七个目的在于提供所述抗人IL-4Rα单克隆抗体的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种抗人IL-4Rα单克隆抗体，所述抗人IL-4Rα单克隆抗体包含：(1)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和(2)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
优选的，所述抗人IL-4Rα单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述抗人IL-4Rα单克隆抗体为人源化的抗人IL-4Rα单克隆抗体，所述人源化的抗人IL-4Rα单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
优选的，所述抗人IL-4Rα单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明的第二个方面提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如上所述的抗人IL-4Rα单克隆抗体。
优选的，所述核苷酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述核苷酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。
优选的，所述表达载体为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF或pCHO 1.0。
更优选的，所述表达载体为pCHO 1.0。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。
优选的，所述宿主细胞为COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1。
更优选的，所述宿主细胞为CHO。
本发明的第五个方面提供了一种制备如上所述的抗人IL-4Rα单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达抗人IL-4Rα单克隆抗体；
b)分离并纯化a)所述的抗人IL-4Rα单克隆抗体。
本发明的第六个方面提供了一种组合物，所述组合物含有如上所述的抗人IL-4Rα单克隆抗体和药学上可接受的载体。
本发明的第七个方面提供了如上所述的抗人IL-4Rα单克隆抗体在制备治疗免疫介导的炎症反应的药物中的应用。
优选的，所述免疫介导的炎症反应包括：哮喘，过敏，特应性皮炎，慢性鼻窦炎，嗜酸性粒细胞性食道炎，鼻息肉，银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，哮喘，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。
本发明的有益效果：
本发明的抗IL-4Rα单克隆抗体能够特异性与人IL-4Rα结合，具有良好的抑制IL-4/IL-13诱导的各种细胞系如TF-1细胞的增殖等的效果，可应用于制备治疗免疫介导的炎症反应的疾病的药物。
附图说明
图1为优选鼠源的抗人IL-4Rα单克隆抗体对人IL-4诱导的TF-1细胞增殖抑制结果。
图2为人源化的抗人IL-4Rα单克隆抗体抑制外周血来源B细胞IgE分泌的实验结果。
具体实施方式
本发明中，任何合适的表达载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF及pCHO 1.0之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
本发明中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，COS，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明；也可以为含有上述表达载体的原核细胞，可以为DH5α，BL21(DE3)，TG1之一。
本发明中公开的抗人IL-4Rα单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗人IL-4Rα单克隆抗体；分离和纯化所述的抗人IL-4Rα单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的重组蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
本发明公开的人源化的抗人IL-4Rα单克隆抗体是通过以下方法得到的：利用实验室制备的IL-4Rα抗原免疫Balb/c小鼠，在多次免疫小鼠滴度较高后取小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合并筛选出具有抑制IL-4功能活性的杂交瘤细胞株。更具体地，本发明的发明人通过大量实验，首先分别表达了IL-4Rα胞外段抗原、及IL-4和IL-13。在此基础上利用不同的佐剂与IL-4Rα抗原混合免疫小鼠，然后进一步将上述小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞株sp2/0融合，融合后的杂交瘤利用IL-4Rα胞外段抗原筛选出阳性细胞株，在验证其对IL-4/IL-13与IL-4Rα结合的阻断并确实抑制IL-4/IL-13的功能后获得目标细胞株。将目标分子进行人源化改造后，将轻链和重链基因同时克隆到真核表达载体pCHO 1.0中。将此表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离或纯化人源化的抗人IL-4Rα单克隆抗体。
进一步的，可以使用本领域的常规技术，例如PCR诱变进一步改变鼠源的亲本抗体来产生抗体的嵌合或人源化形式或其他变异形式。本发明的亲本抗体可以在例如CDR结构域内被诱变来产生变异抗体，可筛选其目的性质的存在，例如结合亲和力(更低的KD)、IC50、特异性、优先结合等等。优选的，变异抗体中目的性质是相对于亲本抗体中性质的改善。优选氨基酸替代变异抗体，并且亲本抗体分子的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被去除且在它的位置上插入不同的残基。用于替代诱变的最感兴趣的位点是一个或更多个CDR区，但是也考虑FR改变。优选保守的氨基酸替代，也可引入非保守氨基酸改变并用获得的变异抗体筛选目的性质。
本发明的发明人对上述的抗人IL-4Rα单克隆抗体进行了体外、体内生物学实验，结果表明此抗体能很好地与IL-4Rα结合。
具体地说，本发明的发明人对上述的抗人IL-4Rα单克隆抗体进行亲和力检测、阻断IL-4/IL-13与IL-4Rα结合的实验分析、体外细胞功能检测等实验，实验结果表明，本发明公开的抗人IL-4Rα单克隆抗体可以结合细胞表面的IL-4Rα，阻断IL-4/IL-13与IL-4Rα之间的信号传导，抑制了炎症反应的发生。本发明公开的上述抗人IL-4Rα单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗人IL-4Rα单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述抗人IL-4Rα单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述抗人IL-4Rα单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使抗人IL-4Rα单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。
上述制剂为包含抗人IL-4Rα单克隆抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗免疫介导的炎症反应效果明显。具体地说，对免疫介导的炎症反应的预防和/或治疗有效，可以作为抗炎症药物使用。
本发明所指的免疫介导的炎症反应，包括但不限于：哮喘，过敏，特应性皮炎，慢性鼻窦炎，嗜酸性粒细胞性食道炎，鼻息肉，银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。除了上述的炎症相关疾病外，还可用于多发性硬化，克罗恩病，结肠炎，溃疡性结肠炎，系统性红斑狼疮，移植物抗宿主病等。这里不再一一列举。
本发明所称的抗免疫介导的炎症反应药物，指具有抑制和/或治疗免疫介导的炎症反应的药物，可以包括伴随免疫介导的炎症反应相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的炎症反应伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止炎症反应的转移。
本发明中抗人IL-4Rα单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1可溶性IL-4Rα胞外段Fc标签和Flag标签抗原、阳性抗体Dupilumab及IL-4、IL-13的制备
人IL-4Rα胞外段抗原序列来自于UniProt(UniProtKB-P24394)，由生工生物公司按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成N端第26-232位氨基酸片段，将序列亚克隆到pUC57载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-hIL4Rα-ECD。人IgG1的恒定区序列根据Secukinumab的序列(参见WHO Drug Information Vol.23，No.4，2009.P342)合成。将序列亚克隆到pUC57载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-IgG1-CH。通过PCR法将hIL4Rα-ECD和hFc(人的Fc片段)进行拼接得到hIL4Rα-ECD-hFc片段。以pUC57-hIL4Rα-ECD为模板，通过PCR法将Flag标签(DYKDDDDK)插入到hIL4Rα-ECD片段的C端得到hIL4Rα-ECD-Flag片段。利用EcoRI和HindIII双酶切hIL4Rα-ECD-hFc、hIL4Rα-ECD-Flag片段，并构建至pTT5表达载体(实验室保存)上，获得pTT5(hIL4Rα-ECD-hFc)，pTT5(hIL4Rα-ECD-Flag)，然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行转染。
通过PEI法分别将pTT5(hIL4Rα-ECD-hFc)、pTT5(hIL4Rα-ECD-Flag)载体转染至HEK293E细胞系(实验室保存)。利用含3mM的丙戊酸的Freestyle293培养基(购自Gibco公司)培养5天后，利用Protein A亲和层析柱(购自Pharmacia公司)从细胞培养上清中纯化抗原蛋白。纯化得到的蛋白用于以下的小鼠免疫及进一步分析与研究。
Dupilumab(IgG4，κ)的氨基酸序列来自who.int(参见WHO Drug InformationVol.26，No.4，2012.P412)，经过密码子优化后全基因合成核苷酸序列，克隆到pTT5表达载体，测序验证确认获得了正确的克隆载体标记为pTT5(Dupilumab)。将pTT5(Dupilumab)载体瞬时转染至HEK293E细胞系，利用含3mM的丙戊酸的Freestyle293培养基培养5天后，利用Protein A亲和层析柱(购自Pharmacia公司)从细胞培养上清中纯化阳性抗体蛋白。
人IL-4序列来自于UniProt(UniProtKB-P05112)，由生工生物公司按照Cricetulus griseus 的密码子使用偏好进行密码子优化并合成N端第25-153位氨基酸片段，将序列亚克隆到pUC57载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-hIL4。通过PCR法将Flag标签(DYKDDDDK)插入到hIL4片段的C端得到hIL4-Flag片段。利用EcoRI和HindIII双酶切hIL4-Flag片段，并构建至pTT5表达载体(购自Life technologies公司)上，获得pTT5(hIL4-Flag)，然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行转染。
通过PEI法将pTT5(hIL4-Flag)载体转染至HEK 293E细胞系。利用含3mM的丙戊酸的Freestyle293培养基(购自Gibco公司)培养5天后，利用Flag亲和层析(购自Sigma公司)从细胞培养上清中纯化得到的蛋白用于以下的分析与研究。
人IL-13序列来自于UniProt(UniProtKB-P35225)，由生工生物公司按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成N端第25-146位氨基酸片段，将序列亚克隆到pUC57载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-hIL13。通过PCR法将6XHis标签插入到hIL13片段的C端得到hIL13-His片段。利用EcoRI和HindIII双酶切hIL13-His片段，并构建至pTT5表达载体(购自Life technologies公司)上，获得pTT5(hIL13-His)，然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行转染。
通过PEI法将pTT5(hIL13-His)载体转染至HEK 293E细胞系(来源)。利用含3mM的丙戊酸的Freestyle293培养基(购自Gibco公司)培养5天后。利用镍柱纯化hIL13-His蛋白。蛋白的定量通过二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法进行，纯化得到的蛋白用于以下的进一步分析与研究。
实施例2hIL-4RαECD-Fc的免疫
100μg/鼠的hIL-4RαECD-Fc抗原在用生理盐水稀释成75μl后，与等体积的弗氏完全佐剂混合，并经超声乳化完全后对4-5周龄的Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018)进行皮下多点注射。三周后，50μg/鼠蛋白同样稀释成75μl后与等体积弗氏不完全佐剂混合，超声乳化完全后对小鼠进行皮下多点免疫，两周后再次重复此免疫。所有小鼠在第三次免疫后一周剪尾取血分离血清，利用包被hIL-4Rα-Fc抗原的ELISA进行血清滴度的检测。对于血清抗体效价＞10000的小鼠，在取血后一周进行冲击免疫：尾静脉注射10μg抗原蛋白/100μl生理盐水/鼠。
滴度的检测通过ELISA方法进行：利用hIL-4RαECD-Fc抗原包被ELISA板，包被浓度为1μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。PBST(含0.5％Tween-20的PBS)洗板2次后拍干。每孔加入含1％BSA的包被液封闭200μl，常温下封闭4小时后拍干，至-20℃冰箱中保存待用。检测时在ELISA板中每孔加入不同浓度的小鼠血清100μl，设2个复孔，室温孵育1.5小时。PBST洗涤3次后拍干。加入用PBST1∶10000倍稀释的HRP标记的兔抗鼠Ig抗体(购自Sigma公司)100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1∶1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H2SO4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。
实施例3杂交瘤融合和筛选
小鼠冲击免疫三天后取脾细胞进行融合。
生长状态良好的杂交瘤sp2/0细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)在37℃、5％CO2孵箱中培养，融合前一天换液。融合与筛选过程如下：取小鼠脾脏，研磨洗涤后计数。按照脾细胞∶sp2/0细胞＝10∶1混合两种细胞，1500rpm离心7分钟。洗去上清液。1分钟内加入1ml PEG(1450)，轻摇90秒，在2.5分钟内加入无血清DMEM培养液(购自Gibco公司)5ml，再一次性加5ml无血清培养液终止反应，静置5分钟，1280rpm离心8分钟。按照一块96孔板两百万个sp2/0细胞的数量均匀接种入96孔板每孔200μl，先用含次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲胺蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的HAT培养基筛选，每3～4天半量换液，第10天改用HT培养基。10天后，待杂交瘤细胞铺满96孔板底部大于10％时，取上清用hIL-4RαECD-Fc抗原包被的酶标板进行ELISA检测。ELISA检测方法同上。挑选出阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养并通过有限稀释法进行亚克隆。获得稳定表达目的抗体的杂交瘤株后进行保种建库。
实施例4鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体对IL-4/IL-13结合hIL-4RαECD-Fc的阻断
用ELISA方法研究鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体对IL-4或IL-13结合hIL-4RαECD-Fc的阻断。hIL-4或hIL-13抗原包被酶标板，封闭后同时加入hIL-4RαECD-Fc和300μl亚克隆中的鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，最终加入HRP-羊抗人IgG抗体进行显色检测。保留能阻断IL-4和与IL-4Rα-ECD-Fc结合的细胞株进入下一轮的亚克隆。
实施例5鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体对IL-4诱导的TF-1细胞增殖的抑制
将第三轮亚克隆后的杂交瘤细胞株进行扩大无血清培养，然后收集细胞上清利用Protein G(购自GE公司)亲和柱进行抗体纯化。将纯化后的抗体进行定量并验证其功能活性。
TF-1细胞是从人红系白血病病人骨髓中分离培养的细胞因子依赖细胞株。研究表明TF-1细胞在IL-4的刺激下生长良好，因此可成为较好的IL-4信号通路功能验证模型。
取生长状态良好的TF-1细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，计数后与终浓度为20ng/ml的重组hIL-4(购自R&D Systems)重悬成2x105/100μl的细胞悬液，培养基为RPMI1640培养基(购自Gibco公司)含10％胎牛血清(购自Sigma公司)，100U/ml青霉素(购自Gibco公司)和100mg/ml链霉素(购自Gibco公司)，称为RPMI-1640完全培养基。用培养基溶液稀释不同浓度的鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体(20μg/ml-3ng/ml，3倍稀释，9个不同浓度)，每孔100μl，加入至96孔平底细胞培养板中(购自Corning公司)，然后每孔加入100μl的细胞悬液。每组设立2个复孔，37℃，5％CO2中孵育培养72小时。每孔加入20μl的CCK-8溶液(购自Dojindo公司)，继续培养8小时，混匀后利用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值，并计算细胞增殖比率。
分析了候选的10个鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体阻断IL-4诱导的TF-1细胞增殖的功能活性后可以发现，所评测的抗体中大部分效能与阳性抗体Dupilumab相当，挑取多个抗体进行进一步的功能分析与应用，编号为123的抗体对IL-4的功能抑制IC50值为189.26pM，而阳性抗体Dupilumab的IC50值为675.33Pm(见图1)。因此，本发明的鼠源的抗人IL-4Rα单克隆抗体对IL-4Rα的抑制功能强于Dupilumab。
实施例6鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体亲和力的测定
鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体与hIL-4Rα的亲和力通过Biacore T200(GEhealthcare)检测，阳性抗体Dupilumab作为对照。具体实验方法为：利用Amine CouplingKit(GE healthcare)激活CM5传感芯片(GE healthcare)并将ProteinA/G融合蛋白(ThermoPierce)固定于芯片上，标记量为2000RU。以FC3(Flow cell 3)为参照通道，FC4(Flow cell 4)为样品通道。在FC4通道分别捕获鼠源抗体或对照抗体，随后注射不同浓度的hIL-4RαECD-Flag。循环条件为：在FCs所有通道中以50μl/min注射4min分析物，解离时间为20min，以10μl/min速率注射6M盐酸胍(国药集团化学试剂有限公司)30s进行表面再生，然后利用Biacore T200Evaluation Software Ver 1.0计算捕获抗体的信号和无捕获抗体的信号差值及相互作用的亲和力。
实验结果见表1，结果表明本发明的鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体与hIL-4Rα的亲和力高于阳性抗体Dupilumab。
表1、鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体对人hIL-4Rα的亲和力
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(pM)
123 4.327×105 5.172×10-8 0.12
Dupilumab 6.233×105 3.64×10-5 58.40
实施例7鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体序列的测定
使用Trizol(购自上海生工生物)提取各杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA，以Mouse Ig-Primer Set(购自Novagen公司)为引物通过PCR扩增鼠源的抗人hIL-4Rα单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，测序并分析可变区基因序列。根据多种功能实验及序列分析结果，我们最终挑取了123号克隆作为先导抗体，其序列信息如下：重链可变区基因序列全长357bp，编码119个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；轻链可变区基因序列全长336bp，编码112个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析，二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。
实施例8抗人hIL-4Rα单克隆抗体的人源化
嵌合抗体(123-chimera，123-Ch)的构建通过截取鼠源123号抗体的重链可变区和轻链可变区，利用overlapping PCR分别与人IgG4的轻重链恒定区(来自Dupilumab抗体)连接而成。
同时根据Kabat法则对鼠源的抗人IL-4Rα单克隆抗体123的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析并确定了3个抗原互补决定区(complementarity-determiningregion，CDR)和4个框架区(frame region，FR)。其中，重链互补决定区的氨基酸序列为CDR1：SYNVH(SEQ ID NO：5)、CDR2：VIWAGGITNYNSALMS(SEQ ID NO：6)和CDR3：VGGYDGDWLAY(SEQ ID NO：7)，轻链互补决定区的氨基酸序列为CDR1’：RASQSVSTSSHSYMH(SEQ ID NO：8)、CDR2’：YASNLES(SEQ ID NO：9)和CDR3’：QHSWEIPYT(SEQ ID NO：10)。
通过在NCBI IgBlast与人IgG胚系序列(Germline)进行同源性比较，选择IGHV4-4*08为重链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-4Rα单克隆抗体123的重链CDR区移植入IGHV4-4*08骨架区，构建成重链的CDR移植抗体。同样地，经过与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV7-3*01为轻链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-4Rα单克隆抗体123的轻链CDR区移植入IGKV7-3*01的骨架区，构建成轻链的CDR移植抗体，所得的抗体定义为123-Gr(123-Grafting)。同时，在此基础上，对一些框架区的氨基酸位点进行了回复突变。在进行回复突变时，将氨基酸序列进行了Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。优选的，对于重链可变区序列，将Kabat编码第2位的V回复为鼠源的A，第27位的G回复为F，第29位的I回复为L，第37位的I回复为V，第48位的I回复为L，第67位的V回复为L，第71位的V回复为K，第73位的T回复为N，第80位的N回复为S，第82位的F回复为V。轻链可变区没有回复突变。上述可变区基因序列由生工生物按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成。将合成的人源化可变区序列与人IgG4恒定区相连，此抗体定义为123的人源化抗体(123-Humanization，123-Hu)。
同时，以此抗体为基础，我们构建了其他的亲和力成熟人源化序列，包括：123-LcR65K(依照Kabat编码系统，进一步将123-Hu轻链上65位的R突变成K)；123-Lc G45R(将123-Hu轻链上45位的G突变成R)及123-Hc K75R(将123-Hu重链上75位的K突变成R)。123-Lc突变序列与123-Hu重链组合成一个抗体基因；123-Hc突变序列与123-Hu轻链组合成一个抗体基因。
利用pTT5载体(购自NRC biotechnology Research Institute)分别构建人源化重链、轻链的瞬时表达载体，将上述轻重链组合利用HEK293系统(购自NRC biotechnologyResearch Institute)进行瞬时转染并表达抗体。HEK293细胞在Free Style 293Expression Medium(购自Gibco公司)培养基中培养，利用PEI转染法将质粒转入细胞5天后收取细胞上清，利用Protein A纯化后获得抗体。
由于此4个抗体中，123-Hu的人源化程度最高，以123-Hu为标准，将其余四个抗体的细胞活性与123-Hu进行了比较，这四个抗体的细胞活性等于或弱于123-Hu，为使目的抗体有最高的人源化比例，在这些抗体中我们选择了123-Hu作为先导抗体分子。
在此基础上，为进一步提高抗体的人源化程度，我们将123-Hu的每一个回复突变位点分别再次突变成人源氨基酸残基。对于重链可变区序列，分别将123-Hu的Kabat编码第48位的L回复为人源的I；或第67位的L回复为V；或第73位的N回复为T。将每一个单点突变后的重链序列与123-Hu的轻链基因组合成一个抗体基因。
再用跟上述同样的条件将抗体分子瞬转、表达、进行细胞活性检测后证实，所有单点突变后的抗体其活性均低于123-Hu，因此，123-Hu是合适的人源化抗体最终目标分子。
最终，123人源化后的重链可变区基因序列全长345bp，编码115个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。与人IgG1恒定区相连后，最终得到445个氨基酸的123-Hu人源化重链(序列如SEQ ID NO：15所示)和214个氨基酸的123-Hu人源化轻链(序列如SEQ ID NO：16所示)。
实施例9人源化的抗人IL-4Rα单克隆抗体对IL-4Rα的亲和力
表达纯化的123-Hu抗体通过Biacore的方法(参见实施例6)进行抗体亲和力的评价。结果显示，人源化后的抗体123-Hu对hIL-4Rα-Flag的亲和力为0.02pM(见表2)，远远高于阳性抗体Dupilumab。
表2、123-Hu对IL-4Rα的亲和力
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(pM)
123-Hu 3.43×105 9.62×10-7 2.8
Dupilumab 8.72×105 4.42×10-5 50.69
实施例10人源化的抗人hIL-4Rα单克隆抗体对外周血来源B细胞的IgE分泌的抑制
在哮喘发病过程中，IL-4和IL-13通过诱导B细胞的IgM向IgE转化，大量分泌IgE，而IgE在跟嗜中性粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞表面的受体结合后，激活免疫应答，使气道变窄并发生炎症反应，从而使哮喘症状加重。因此，抗人hIL-4Rα单克隆抗体的功能活性之一是抑制B细胞的IgE分泌。我们验证了人源化抗人hIL-4Rα单克隆抗体的此活性。
利用Histopaque-1077(购自Sigma公司)从新鲜人外周血(由长海医院提供)中分离获得单个核细胞。用RPMI-1640完全培养基将细胞重悬成5x105/ml的细胞悬液，在96孔细胞培养板中加入100μl细胞悬液，同时加入100μl的20ng/ml的重组hIL-4及不同浓度的抗人hIL-4Rα抗体(20μg/ml-3ng/ml)，37℃，5％CO2条件下孵育培养14天。然后吸取100μl细胞液上清，用ELISA检测其中IgE的含量。
ELISA分析方法如下：采用小鼠抗人IgE包被ELISA板(购自R&D Systems)，包被浓度为2.5μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。PBST洗板2次后拍干。每孔加入含1％BSA的包被液封闭200μl，常温下封闭4小时后拍干，置于-20℃冰箱中保存待用。检测时用培养基配制hIgE标准品(购自R&D Systems)，使其终浓度分别为100ng/ml、33ng/ml、11ng/ml、3.7ng/ml、1.2ng/ml、410pg/ml、130pg/ml及46pg/ml，每孔100μl加入包被好的ELISA板中，每个浓度设2个复孔；细胞上清100μl加入至包被好的ELISA板中，室温孵育1.5小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加生物素化的大鼠抗人IgE(购自R&D Systems，用含1％BSA的PBST稀释1000倍)100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加Streptavidin HRP(购自BDPharmingen，用含1％BSA的PBST稀释1000倍)100μl，室温孵育1小时。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1∶1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2MH2SO4终止液终止反应。立即用酶标仪在450nm波长处测量各孔OD值。结果显示相比于Dupilumab，123-Hu对外周血B细胞IgE分泌的抑制更强，显示了其更好的功能活性(图2)。

Claims (10)

1.一种抗人hIL-4Rα单克隆抗体，其特征在于，所述抗人hIL-4Rα单克隆抗体包含：
(1)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和
(2)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
2.如权利要求1所述的抗人hIL-4Rα单克隆抗体，其特征在于，所述抗人hIL-4Rα单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。
3.如权利要求1所述的抗人hIL-4Rα单克隆抗体，其特征在于，所述抗人hIL-4Rα单克隆抗体为人源化的抗人hIL-4Rα单克隆抗体，所述人源化的抗人hIL-4Rα单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
4.如权利要求3所述的抗人hIL-4Rα单克隆抗体，其特征在于，所述抗人hIL-4Rα单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
5.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1-4中任一项所述的抗人hIL-4Rα单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
7.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1-4中任一项所述的抗人hIL-4Rα单克隆抗体和药学上可接受的载体。
9.如权利要求1-4中任一项所述的抗人hIL-4Rα单克隆抗体在制备治疗免疫介导的炎症反应的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫介导的炎症反应包括：哮喘，过敏，特应性皮炎，慢性鼻窦炎，嗜酸性粒细胞性食道炎，鼻息肉，银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，哮喘，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。
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