CN108409663B - 微管抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微管抑制剂及其制备方法和用途，属于化学药物领域。本发明所要解决的是现有的微管抑制剂CA‑4顺式构象容易转变为反式构象，从而导致生物活性急剧下降的问题，其技术方案是提供了式Ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体。实验结果表明，本发明化合物在卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、非小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞等肿瘤细胞中均展示出很强的体外抗增殖活性，并且在体内能够显著抑制肿瘤进展，安全性良好。
Description
技术领域
本发明涉及微管抑制剂及其制备方法和用途，属于化学药物领域。
背景技术
微管由α-和β-微管蛋白二聚体组成，是细胞骨架中重要组成部分。微管具有广泛而重要的作用，包括细胞分裂，信号传导，细胞流动性，细胞形态的维持和细胞内囊泡运输等等。因此，微管已成为极具吸引力的抗肿瘤药物的靶点。α-和β-微管蛋白二聚体的组装和拆解是一个动力学平衡过程。许多能够破坏这种平衡的分子被开发成微管抑制剂。这些微管抑制剂主要通过结合β-微管蛋白中3个结合位点中的某一个而发挥作用。比如紫杉醇通过结合紫衫烷位点而作为微管稳定剂，长春新碱结合长春新碱位点作为微管减稳剂。这些化合物都已经批准作为抗癌药物用于临床。然而，它们的的临床效果常常受限于ABC转运蛋白的表达，如P-糖蛋白(P-gp)，多药耐药蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等，这些都是目前已知的导致药物耐药的主要机制。广泛的研究表明，靶向秋水仙碱结合位点的微管抑制剂或许能够逃避这些耐药机制，从而提高临床疗效。
在所有结合秋水仙碱结合位点的微管抑制剂中，Combretastatin A-4(CA-4)是典型代表并且受到广泛研究，其结构如下所示：
CA-4最早于1998年被Pettit从南非Combretum caffrum树皮中分离得到。通过紧密的结合秋水仙碱结合位点和阻断细胞周期于G2/M期，CA-4对大量的癌症细胞系展示出很强的细胞毒性，包括多药耐药细胞。目前CA-4的磷酸盐(CA-4P)和丝氨酰胺衍生物(AVE8062)正在进行临床试验，并且表现出良好的治疗前景。构效关系研究(SARs)表明，双键的顺式构型和A环(即3,4,5-三甲氧基苯基模块)是生物活性所必须的。然而，在储存和代谢过程中，CA-4的顺式构象容易转变为反式构象，从而导致生物活性急剧下降，因此，维持顺式构型对CA-4类似物的生物学活性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供微管抑制剂及其制备方法和用途，以解决现有的微管抑制剂CA-4顺式构象容易转变为反式构象，从而导致生物活性急剧下降的问题。
本发明提供了式Ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体：
R1为烷基、芳基或取代的芳基；
R2为烷氧基或烷基取代的巯基；
R3、R4、R5、R6独立地选自-H或卤素；
R7为-H或3,4,5-三甲氧基苯基；
R8为-H、-NH2或3,4,5-三甲氧基苯基；
其中，R7为-H时，R8为3,4,5-三甲氧基苯基；R7为3,4,5-三甲氧基苯基时，R8为-H或-NH2。
进一步地，R1为C1～C6烷基、苯基或取代的苯基。
优选地，所述取代的苯基中，取代基为卤素或C1～C6烷氧基。
优选地，R1为甲基、丁基、对氟苯基或对甲氧苯基。
优选地，所述丁基为叔丁基。
最优选地，R1为甲基。
进一步地，R2为C1～C6烷氧基或C1～C6烷基取代的巯基。
优选地，R2为甲氧基、乙氧基或甲基取代的巯基。
最优选地，R2为乙氧基或甲基取代的巯基。
进一步地，R3、R4、R5、R6独立地选自-H或-F。
优选地，R3、R4、R5、R6只有一个为-F。
进一步优选地，R3为-F，R4、R5、R6为-H。
进一步地，R7、R8独立地选自-H或3,4,5-三甲氧基苯基，其中，R7为-H时，R8为3,4,5-三甲氧基苯基，R7为3,4,5-三甲氧基苯基时，R8为-H。
优选地，R7为3,4,5-三甲氧基苯基，R8为-H。
进一步地，所述化合物选自：
本发明提供了所述化合物、其药学上可接受的盐或其晶体的制备方法，包括如下步骤：
a、3,4,5-三甲氧基苯甲酸经酯化，得到化合物2:
其中，R为烷基；
b、化合物2在碱存在下与乙腈反应，得到化合物3:
c、化合物3与SM-1反应，关环形成吡唑环类化合物4:
d、化合物4经溴代，得到化合物5:
e、化合物5经Suzuki偶联反应，得到产物6:
或者，还包括如下步骤：
f、产物6经过脱氨基反应，得到产物7：
或者，所述的制备方法包括如下步骤：
Ⅰ、化合物8与化合物9通过Suzuki偶联反应，得到化合物10：
Ⅱ、化合物10经溴代，得到化合物11：
Ⅲ、化合物11经Suzuki偶联反应，得到产物12：
优选地，R为C1～C6烷基。
进一步优选地，R为甲基。
进一步地，步骤b所述的碱为NaH。
进一步地，步骤c的反应溶剂选自乙醇、四氢呋喃、冰醋酸、乙腈、二氯甲烷、乙醇：冰醋酸体积比1：1的混合物、四氢呋喃：冰醋酸体积比1：1的混合物或乙腈：冰醋酸体积比1：1的混合物。
进一步地，步骤c化合物3与SM-1的摩尔比为1：(1～3)。
优选地，步骤c化合物3与SM-1的摩尔比为1：2。
进一步地，步骤c反应温度为100℃。
其中，步骤c反应加酸加碱均可。若步骤c不以冰醋酸为溶剂时，可加入碱如：三乙胺、碳酸钠、碳酸钾和氢化钠。以冰醋酸为溶剂，反应速度、产率最高。
进一步地，步骤e取化合物5、
碱和Pd催化剂，在保护气氛下反应。
进一步地，步骤e化合物5与
的摩尔比为1：(2～5)。
优选地，步骤e化合物5与
的摩尔比为1：4。
进一步地，步骤e化合物5与碱的摩尔比为1：(1.5～4)。
优选地，步骤e化合物5与碱的摩尔比为1：3。
优选地，步骤e所述Pd催化剂选自PdCl2(PPh3)2、Pd(PPh3)4、Pd(OAc)2中一种或两种以上。
进一步地，步骤e化合物5与PdCl2(PPh3)2的摩尔比为1：0.05。
进一步地，步骤e的反应溶剂选自丙酮、乙腈、四氢呋喃、甲苯、DMF、1,2-二甲氧基乙烷中一种或两种以上。
优选地，步骤e所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢化钠、氢氧化钡、碳酸铯中一种或两种以上。
优选地，步骤e的反应温度为80℃。
优选地，步骤e所述保护气氛为氮气。
进一步地，步骤Ⅲ取化合物11、
Na2CO3和Pd(PPh3)4，在保护气氛下反应。
进一步地，步骤Ⅲ化合物11与
的摩尔比为1：2。
进一步地，步骤Ⅲ化合物11与Na2CO3的摩尔比为1：(3～7)。
优选地，步骤Ⅲ化合物11与Na2CO3的摩尔比为1：6。
优选地，步骤Ⅲ化合物11与Pd(PPh3)4的摩尔比为1：0.05。
进一步地，步骤Ⅲ的反应溶剂选自四氢呋喃、甲苯、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃：水体积比1：1的混合物或四氢呋喃：水体积比2：1的混合物。
优选地，步骤Ⅲ的反应温度为70℃。
优选地，步骤Ⅲ所述保护气氛为氮气。
本发明提供了所述化合物、其药学上可接受的盐或其晶体在制备微管抑制剂类药物中的用途。
进一步地，所述药物抑制微管蛋白聚合。
进一步地，所述药物作用于微管蛋白β-亚单位的秋水仙碱位点。
本发明提供了所述化合物、其药学上可接受的盐或其晶体在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
进一步地，所述的药物是治疗和/或预防卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、宫颈癌的药物。
进一步地，所述药物是以所述化合物、其药学上可接受的盐或其晶体为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地，所述的制剂是口服制剂。
术语定义：
本发明中提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。
术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C1～C6烷基的实例包括甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。除非另外指明，否则烷基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。在一些实施方案中，所述C1～C6烷基是被卤素(氟、氯、溴、碘)取代的C1～C6烷基。在C1～C6烷基被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。
术语“芳基”是指在芳族环系中包含或不包含杂原子的4n+2芳族环系的基团，其中，杂原子独立地选自氮、氧和硫。除非另外指明，否则芳基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。
术语“烷氧基”是指基团-OR，其中R是被取代或未被取代的烷基。C1～C6烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。在一些实施方案中，R是被卤基(氟、氯、溴、碘)取代的烷基。所述C1～C6烷氧基在R被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。
术语“烷基取代的巯基”是指基团R-S-，其中R是上文所定义的烷基。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
本发明的某些实施方式中，本发明包括了同位素标记的化合物，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入本发明化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即2H,3H、13C、14C、15N、17O、18O、35S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的本发明化合物及其立体异构体，以及该化合物、立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。
本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。
本发明提供了一类结构新颖的CA-4类似物，它是通过用吡唑环替代CA-4原来的双键结构，并对吡唑环和B环进行恰当修饰得到的。体外抗肿瘤细胞增殖实验表明，本发明化合物在卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、非小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞等肿瘤细胞中均展示出很强的体外抗增殖活性，其中，化合物7a3表现出最佳的抗肿瘤细胞增殖活性。体内实验进一步证明，化合物7a3能够显著抑制肿瘤进展，并且没有明显的毒性，安全性良好。
此外，优选出的化合物7a3与微管蛋白的共晶结构解析证明，本发明化合物的作用靶点为微管蛋白β-亚单位的秋水仙碱位点。本发明为临床提供了一类微管抑制剂类药物。
附图说明
图1为试验例1中本发明化合物对肿瘤细胞的体外增殖抑制曲线图；
图2为试验例2中本发明化合物7a3对SK-OV-3细胞周期的影响图；
图3为试验例3中本发明化合物7a3对SK-OV-3细胞凋亡的影响图；
图4为试验例4中划痕实验结果图；
图5为试验例5中Transwell迁移图；
图6为试验例6中本发明化合物7a3抑制微管蛋白聚合图；
图7为试验例7中免疫荧光染色图；
图8为试验例8中X-射线晶体学分析T2R-TTL-7a3复合物结构图；
图9为试验例9中化合物7a3和CA-4的UHPLC-ESI-MS/MS谱图；
图10为试验例9中本发明化合物7a3的标准曲线图；
图11为试验例9中本发明化合物7a3的小鼠血浆药物浓度-时间曲线图；
图12为试验例10中化合物7a3对小鼠肿瘤体积和体重的影响图；
图13为试验例10中小鼠重要脏器H&E染色图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明提供了式Ⅰ所示的化合物、其药学上可接受的盐或其晶体：
R1为烷基、芳基或取代的芳基；
R2为烷氧基或烷基取代的巯基；
R3、R4、R5、R6独立地选自-H或卤素；
R7为-H或3,4,5-三甲氧基苯基；
R8为-H、-NH2或3,4,5-三甲氧基苯基；
其中，R7为-H时，R8为3,4,5-三甲氧基苯基；R7为3,4,5-三甲氧基苯基时，R8为-H或-NH2。
本发明首次合成并通过药效实验评价上述基于CA-4的类似物。药效实验结果表明，上述化合物通过用吡唑环替代CA-4原来的双键结构，并对吡唑环和B环进行恰当修饰，不仅可以解决CA-4顺式构象容易转变为反式构象的问题，而且还很好地保留了CA-4的抗肿瘤活性。其中，优选的类似物7a3进一步通过结构生物学的技术和方法确证其作用靶点为微管蛋白秋水仙碱位点，并且具有显著的体内抗肿瘤效果。
实施例1本发明化合物的合成
1.合成方案的总体描述
本发明通过5步化学反应合成1,4-取代-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基吡唑类似物6a1-6d4(合成路线1)。首先初始原料3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯化后，得到化合物2；接着以氢化钠为碱，乙腈-四氢呋喃为溶剂，回流反应得到的化合物3；再进一步与相应的肼(甲基肼，叔丁基肼，对氟苯肼和对甲氧基苯肼)反应，关环形成吡唑环类化合物4a-4d；接下来，经过NBS(N-Bromosuccinimide，N-溴代丁二酰亚胺)的溴化反应，得到重要中间体5a-5d；然后通过Suzuki反应，即以Cs2CO3为碱，PdCl2(PPh3)2为催化剂，1,2-乙二醇二甲醚(DME)为溶剂，80℃下反应过夜后，得到目标化合物6a1-6d4。接着以化合物6a2-6a4为原料，经过一步脱氨基反应(合成路线2)，得到目标化合物7a2-7a4。合成路线3展示了A环从C3转至C5位的合成路线，即化合物8(3,4,5-三甲氧基溴化苯)与化合物9(1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸)在Na2CO3和Pd(PPh3)4的作用下，发生Suzuki反应，得到化合物10；进一步溴化反应(NBS)得到化合物11；最终，在Suzuki反应条件下，生成目标化合物12a2-12a4。
合成路线1.化合物6a1-6d4的合成。试剂和条件：(a)浓硫酸,CH3OH,65℃,24h,100％；(b)CH3CN-THF(1:1),NaH,80℃,5h,77％；(c)R1-NHNH2,AcOH-EtOH(1:1),100℃,12h,78-87％；(d)NBS,DMF,0℃,3h,84-89％；(e)R2PhB(OH)2,Cs2CO3,PdCl2(PPh3)2,DME,80℃,12h,31-47％。
合成路线2.化合物7a2-7a4的合成。试剂和条件：(a)亚硝酸正丁酯,THF,65℃,3h,82-90％。
合成路线3.化合物12a2-12a4的合成。试剂和条件：(a)Na2CO3,Pd(PPh3)4,THF-H2O(2:1),70℃,12h,95％；(b)NBS,DMF,0℃,3h,86％；(c)ArB(OH)2,Na2CO3,Pd(PPh3)4,THF-H2O(2:1),70℃,12h,60-63％.
2.具体合成方法和化合物结构解析
3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯(2)
量取10mL浓盐酸，在室温下滴加到化合物1，即3,4,5-三甲氧基苯甲酸(1.00g,47.2mmol)的甲醇(100mL)溶液中。65℃回流24h后，TLC检测，反应完成。待冷却至室温后，浓缩，加入乙酸乙酯100mL，用饱和碳酸氢钠水溶液调pH至7，然后分液，分出有机相后，剩余水相再用乙酸乙酯萃取两次，每次100mL，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得化合物2。得10.8g，产率为100％，熔点76-77℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.23(s,2H),3.84(s,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ166.7,152.9,142.2,125.1,106.8,60.9,56.2,52.2.HRMS(ESI)calcd for C11H14O5[M+Na]+249.0739,found 249.0734.
3,4,5-三甲氧基苯甲酰基乙腈(3)
称取化合物2(10.0g,44.2mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入干燥的CH3CN和THF(v:v＝1:1,160mL)，室温搅拌下加入NaH(60％,1.80g,44.2mmol)后，反应在80℃回流，5h后TLC检测反应完成。接着反应液倒入100mL冰水中，用2M的HCl调节pH至2，混合液用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机相后，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩后，经柱层析纯化后得到化合物3，浅黄的固体。得8.00g，产率为77.2％，熔点为134-136℃。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.24(s,2H),4.77(s,2H),3.86(s,6H),3.76(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ171.0,153.0,142.9,124.3,107.4,61.0,56.3,45.8,29.7.HRMS(ESI)calcd for C12H13NO4[M]+235.0845,found235.0845.
化合物4a-4d的通用合成方法
称取化合物3(2.00g,8.51mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入冰醋酸(25mL)和乙醇(25mL)，室温搅拌下加入相应的肼类化合物(17.0mmol，分别为甲基肼、叔丁基肼，对氟苯肼和对甲氧基苯肼)。接着反应在100℃回流过夜，12h后TLC检测反应完成，反应液冷却至室温后，浓缩除去溶剂，剩余物溶于50mL乙酸乙酯中，接着有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL×3)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩后，柱层析纯化，得到化合物4a-4d。
1-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(4a)
通过化合物3与甲基肼通过上述方法制备，得到化合物4a，浅黄色固体，1.94g，产率为86.6％，熔点为168-169℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.91(s,2H),5.69(s,1H),5.21(s,2H),3.80(s,6H),3.65(s,3H),3.55(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.3,149.7,145.6,137.7,129.6,102.6,88.6,60.9,56.2,34.6.HRMS(ESI)calcd for C13H17N3O3[M+H]+264.1348,found 264.1344.
1-叔丁基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(4b)
通过化合物3与叔丁基肼通过上述方法制备，得到化合物4b，浅黄色固体，2.23g，产率为85.8％，熔点为95-97℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.90(s,2H),5.77(s,1H),4.91(s,2H),3.80(s,6H),3.66(s,3H),1.57(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.3,153.3,129.3,113.9,106.2,102.8,91.3,61.1,56.5,56.1,29.4,29.2.HRMS(ESI)calcdfor C16H23N3O3[M+H]+306.1818,found 306.1821.
1-(4-氟苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(4c)
通过化合物3与对氟苯肼通过上述方法制备，得到化合物4c，浅黄色固体，2.27g，产率为77.7％，熔点为121-122℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.66(dd,J＝8.9,5.0Hz,2H),7.34(t,J＝8.8Hz,2H),7.00(s,2H),5.92(s,1H),5.40(s,2H),3.82(s,6H),3.68(s,3H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ163.0,160.5,153.4,151.4,146.0,138.2,134.4,128.8,126.4,126.3,116.5,116.3,103.0,88.2,60.9,56.3.HRMS(ESI)calcd for C18H18FN3O3[M+H]+344.1410,found 344.1409。
1-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(4d)
通过化合物3与对甲氧基苯肼通过上述方法制备，得到化合物4d，浅黄色固体，2.41g，产率为79.8％，熔点为176-177℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.51(d,J＝8.9Hz,2H),7.06(d,J＝8.9Hz,2H),6.99(s,2H),5.89(s,1H),5.26(s,2H),3.82(s,6H),3.81(s,3H),3.67(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ159.2,153.4,151.0,146.1,131.0,129.0,126.3,114.7,103.0,87.6,60.9,56.3,55.6.HRMS(ESI)calcd for C19H21N3O4[M+H]+356.1610,found 356.1604.
化合物5a-5d的通用合成方法
称取相应的化合物4a-4d(1.00g,1equiv)于50mL圆底烧瓶中，加入DMF(10mL)溶解，在冰浴搅拌下加入NBS(1.1equiv)的DMF(5mL)溶液，反应在0℃反应3h后，TLC检测反应完成。用油泵旋蒸除去溶剂，加入乙酸乙酯20mL，接着有机层依次用水(20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，柱层析纯化的化合物5a-5d。
4-溴-1-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(5a)
通过化合物4a通过上述方法制备，得到化合物5a，浅黄色固体，1.16g，产率为89.2％，熔点为168-169℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,2H),5.48(s,2H),3.80(s,6H),3.68(s,3H),3.63(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.1,146.1,143.7,138.0,128.01,104.4,104.1,60.9,56.1,35.4.HRMS(ESI)calcd for C13H16BrN3O3[M+H]+342.0453,344.0433,found 342.0450,344.0437.
4-溴-1-叔丁基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(5b)
通过化合物4b通过上述方法制备，得到化合物5b，浅黄色固体，1.07g，产率为84.9％，熔点为122-123℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.04(s,2H),5.03(s,2H),3.80(s,6H),3.68(s,3H),1.58(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.1,144.2,143.0,137.9,128.4,104.6,60.9,60.0,56.1,29.0.HRMS(ESI)calcd for C16H22BrN3O3[M+H]+384.0923,386.0902,found 384.0917,386.0903.
4-溴-1-(4-氟苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(5c)
通过化合物4c通过上述方法制备，得到化合物5c，浅黄色固体，1.03g，产率为83.7％，熔点为140-142℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.63-7.57(m,2H),7.23-7.16(m,4H),3.92(s,6H),3.88(s,3H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ163.2,160.7,153.2,147.9,143.80,138.4,134.4,127.4,126.0,125.9,116.7,116.5,104.8,60.9,56.2.HRMS(ESI)calcd for C18H17BrFN3O3[M+H]+422.0516,424.0495,found 422.0510,424.0493.
4-溴-1-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(5d)
通过化合物4d通过上述方法制备，得到化合物5d，浅黄色固体，1.05g，产率为85.4％，熔点为162-164℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.50(d,J＝8.9Hz,2H),7.19(s,2H),7.01(d,J＝9.0Hz,2H),3.92(s,6H),3.88(s,3H),3.85(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ159.4,153.1,147.43,143.8,128.2,131.2,127.7,125.8,114.8,104.8,75.9,60.9,56.2,55.6.HRMS(ESI)calcd for C19H20BrN3O4[M+H]+434.0715,436.0695,found 434.0713,436.0705.
化合物6a1-6d4的通用合成方法
称取相应的化合物5a-5d(50.0mg,1equiv)于25mL圆底烧瓶中，依次加入相应的芳基苯硼酸(4equiv，即对甲氧基苯硼酸，3-氟-4-甲氧基苯硼酸，对乙氧基苯硼酸和对甲巯基苯硼酸)，Cs2CO3(3equiv)和PdCl2(PPh3)2(0.05equiv)，这些固体混合物用氮气置换后，加入干燥去除空气的1,2-二甲氧基乙烷(DME，5mL)。反应在80℃下进行，12h后TLC检测，反应基本完成，停止反应。旋蒸浓缩除去溶剂，加入10mL乙酸乙酯溶解后，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析纯化，得到目标化合物6a1-6d4。
1-甲基-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6a1)
通过化合物5a和对甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6a1，浅黄色固体，22.4mg，产率为41.5％，HPLC纯度为99.4％，熔点为145-147℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.10(d,J＝8.6Hz,2H),6.95(d,J＝8.7Hz,2H),6.59(s,2H),4.95(s,2H),3.75(s,3H),3.63(s,3H),3.62(s,3H),3.53(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.6,152.9,146.8,143.4,137.5,131.3,128.6,125.4,114.4,104.7,104.3,60.9,55.9,55.4,34.6,29.7.HRMS(ESI)calcd for C20H23N3O4[M+H]+370.1767,found 370.1761.
1-甲基-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6a2)
通过化合物5a和3-氟-4-甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6a2，浅黄色固体，25.6mg，产率为45.3％，HPLC纯度为95.9％，熔点为160-162℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.15(t,J＝8.9Hz,1H),6.99(dd,J＝12.7,1.9Hz,1H),6.91(d,J＝8.2Hz,1H),6.58(s,2H),5.09(s,2H),3.83(s,3H),3.63(s,6H),3.56(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.7,152.9,151.2,147.1,146.4,146.3,143.1,137.5,128.9,126.7,126.6,126.0,125.9,117.6,117.5,113.9,113.9,104.8,103.2,60.9,56.4,55.9,34.6,29.0.HRMS(ESI)calcd for C20H22FN3O4[M+H]+388.1673,found 388.1669.
1-甲基-4-(4-乙氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6a3)
通过化合物5a和对乙氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6a3，浅黄色固体，23.7mg，产率为42.3％，HPLC纯度为98.3％，熔点为180-182℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(d,J＝8.6Hz,2H),6.59(s,2H),4.93(s,2H),4.02(q,J＝7.0Hz,2H),3.63(s,3H),3.62(s,3H),3.53(s,6H),1.32(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ157.8,152.8,147.0,143.2,137.3,131.2,128.9,125.5,115.0,104.6,104.4,63.5,60.9,55.81,34.6,29.7,14.8.HRMS(ESI)calcd for C21H25N3O4[M+H]+384.1923,found 384.1925。
1-甲基-4-(4-甲巯基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6a4)
通过化合物5a和对甲巯基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6a4，浅黄色固体，26.4mg，产率为46.9％，HPLC纯度为98.8％，熔点为170-172℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.27(d,J＝8.3Hz,2H),7.11(d,J＝8.3Hz,2H),6.57(s,2H),5.07(s,2H),3.63(s,6H),3.54(s,6H),2.46(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ152.9,147.2,143.0,137.4,136.7,130.4,130.4,129.0,127.1,104.8,104.0,60.9,55.8,34.6,16.0.HRMS(ESI)calcdfor C20H23N3O3S[M+H]+386.1538,found 386.1536.
1-叔丁基-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6b1)
通过化合物5b和对甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6b1，浅黄色固体，21.2mg，产率为39.6％，HPLC纯度为98.2％，熔点为149-151℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.12(d,J＝8.7Hz,2H),6.97(d,J＝8.7Hz,2H),6.59(s,2H),4.42(s,2H),3.76(s,3H),3.62(s,3H),3.54(s,6H),1.64(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.4,152.8,145.0,142.7,137.1,131.6,129.8,126.0,114.3,106.2,104.7,60.8,59.1,55.7,55.3,29.3.HRMS(ESI)calcd for C23H29N3O4[M+1]+412.2231,found 412.2227.
1-叔丁基-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6b2)
通过化合物5b和3-氟-4-甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6b2，浅黄色固体，19.7mg，产率为35.3％，HPLC纯度为98.2％，熔点为124-126℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.16(t,J＝8.9Hz,1H),7.01(dd,J＝12.6,1.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),6.57(s,2H),4.56(s,2H),3.83(s,3H),3.62(s,3H),3.56(s,6H),1.63(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.7,152.9,151.2,146.4,145.1,142.7,137.3,129.4,126.9,126.3,126.3,118.0,117.8,113.9,113.8,104.8,60.8,59.2,56.4,55.8,29.3.HRMS(ESI)calcd for C23H28FN3O4[M+1]+430.2142,found 430.2146.
1-叔丁基-4-(4-乙氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6b3)
通过化合物5b和对乙氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6b3，浅黄色固体，18.9mg，产率为34.2％，HPLC纯度为97.2％，熔点为131-132℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.09(d,J＝8.6Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,2H),6.59(s,2H),4.40(s,2H),4.03(q,J＝6.9Hz,2H),3.61(s,3H),3.53(s,6H),1.63(s,9H),1.32(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ156.8,151.8,144.0,141.8,136.1,130.6,128.7,124.7,113.9,105.3,103.7,62.5,59.8,54.7,28.7,28.4,13.8.HRMS(ESI)calcd for C24H31N3O4[M+H]+426.2393,found 426.2391.
1-叔丁基-4-(4-甲巯基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6b4)
通过化合物5b和对甲巯基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6b4，浅黄色固体，20.8mg，产率为37.4％，HPLC纯度为96.9％，熔点为152-154℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.28(d,J＝9.0Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),6.68(s,2H),3.80(s,3H),3.66(s,6H),2.49(s,3H),1.73(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ152.8,145.2,142.7,137.2,136.6,130.7,130.6,129.5,127.1,105.9,104.9,60.8,59.2,55.8,29.4,16.0.HRMS(ESI)calcd for C23H29N3O3S[M+H]+428.2008,found 428.2003.
1-(4-氟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6c1)
通过化合物5c和对甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6c1，浅黄色固体，16.5mg，产率为31.1％，HPLC纯度为96.4％，熔点为164-166℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.75-7.70(m,2H),7.40-7.33(m,2H),7.18(d,J＝8.7Hz,2H),6.99(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(s,2H),4.98(s,2H),3.77(s,3H),3.64(s,3H),3.55(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ163.2,158.7,149.0,143.2,135.4,126.1,126.0,125.2,116.6,116.3,103.9,60.9,55.8,55.4,55.2.HRMS(ESI)calcd for C25H24FN3O4[M+1]+450.1824,found480.1825.
1-(4-氟苯基)-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6c2)
通过化合物5c和3-氟-4-甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6c2，浅黄色固体，17.8mg，产率为32.3％，HPLC纯度为98.8％，熔点为147-149℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.71(dd,J＝8.9,4.9Hz,2H),7.37(t,J＝8.8Hz,2H),7.19(t,J＝8.9Hz,1H),7.09(dd,J＝12.5,1.9Hz,1H),6.99(d,J＝8.4Hz,1H),6.66(s,2H),5.13(s,2H),3.85(s,3H),3.65(s,3H),3.58(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ162.0,159.5,152.7,151.9,150.27,148.1,145.6,145.5,142.2,136.8,133.5,127.3,125.1,125.1,125.0,116.7,116.5,115.6,115.4,112.9,112.9,104.0,101.7,59.9,55.4,54.9.HRMS(ESI)calcdfor C25H23F2N3O4[M+1]+468.1729,found 472.1730.
1-(4-氟苯基)-4-(4-乙氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6c3)
通过化合物5c和对乙氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6c3，浅黄色固体，19.2mg，产率为35.1％，HPLC纯度为98.5％，熔点为147-148℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(dd,J＝8.9,5.0Hz,2H),7.36(t,J＝8.8Hz,2H),7.16(d,J＝8.6Hz,2H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H),6.67(s,2H),4.96(s,2H),4.04(q,J＝6.9Hz,2H),3.64(s,3H),3.55(s,6H),1.33(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ162.9,160.4,158.0,152.9,149.1,143.2,137.6,134.8,131.3,128.8,126.0,125.9,125.2,116.5,116.3,115.1,104.9,104.0,63.6,60.9,55.8,29.7,14.8.HRMS(ESI)calcd for C26H26FN3O4[M+H]+464.1986,found 464.1982.
1-(4-氟苯基)-4-(4-甲巯基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6c4)
通过化合物5c和对甲巯基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6c4，浅黄色固体，18.9mg，产率为34.4％，HPLC纯度为97.8％，熔点为166-167℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.69(dd,J＝8.8,4.8Hz,2H),7.30(d,J＝8.3Hz,2H),7.26(s,2H),7.21(t,J＝8.5Hz,2H),6.75(s,2H),3.83(s,3H),3.67(s,6H),2.50(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ160.5,152.9,149.2,143.1,137.7,137.0,134.6,130.4,129.9,128.5,127.1,126.1,126.0,116.6,116.3,105.1,103.6,60.9,55.9,29.7,15.9.HRMS(ESI)calcdfor C25H24FN3O3S[M+H]+466.1601,found 466.1599.
1-(4-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6d1)
通过化合物5d和对甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6d1，浅黄色固体，18.4mg，产率为34.7％，HPLC纯度为98.9％，熔点为133-134℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.57(d,J＝8.9Hz,2H),7.18(d,J＝8.7Hz,2H),7.08(d,J＝9.0Hz,2H),6.98(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(s,2H),4.83(s,2H),3.82(s,3H),3.77(s,3H),3.63(s,3H),3.55(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ159.1,158.5,152.8,148.5,143.2,137.5,131.5,131.3,128.9,125.9,125.6,114.7,114.4,105.0,103.3,60.9,55.8,55.6,55.4,29.7.HRMS(ESI)calcd for C26H27N3O5[M+H]+462.2023,found 462.2025.
1-(4-甲氧基苯基)-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6d2)
通过化合物5d和3-氟-4-甲氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6d2，浅黄色固体，19.3mg，产率为35.0％，HPLC纯度为99.6％，熔点为135-136℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.57(d,J＝8.9Hz,2H),7.09(dd,J＝12.2,1.9Hz,1H),7.06–6.96(m,4H),6.76(s,2H),3.90(s,3H),3.85(s,3H),3.83(s,3H),3.68(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ159.2,153.7,152.9,151.3,148.6,146.4,146.3,143.3,137.7,131.2,128.6,126.0,117.7,117.5,114.7,113.9,113.9,105.1,102.2,60.9,56.4,55.9,55.6.HRMS(ESI)calcd for C26H26FN3O5[M+1]+480.1929,found 480.1935.
1-(4-甲氧基苯基)-4-(4-乙氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6d3)
通过化合物5d和对乙氧基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6d3，浅黄色固体，17.5mg，产率为32.0％，HPLC纯度为95.9％，熔点为123-125℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.57(d,J＝8.9Hz,2H),7.16(d,J＝8.6Hz,2H),7.08(d,J＝9.0Hz,2H),6.96(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(s,2H),4.82(s,2H),4.04(q,J＝6.9Hz,2H),3.82(s,3H),3.64(s,3H),3.55(s,6H),1.33(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.0,156.8,151.8,147.5,142.2,136.5,130.4,130.3,127.9,124.9,124.4,114.0,113.7,103.9,102.3,62.5,59.8,54.80,54.6,28.7,13.8.HRMS(ESI)calcd for C27H29N3O5[M+H]+476.2185,found476.2185.
1-(4-甲氧基苯基)-4-(4-甲巯基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-氨基-1H-吡唑(6d4)
通过化合物5d和对对甲巯基苯甲酸通过上述方法制备，得到化合物6d4，浅黄色固体，17.9mg，产率为32.6％，HPLC纯度为97.3％，熔点为149-150℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.56(d,J＝8.9Hz,2H),7.30(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(d,J＝8.2Hz,2H),7.08(d,J＝8.9Hz,2H),6.64(s,2H),4.95(s,2H),3.82(s,3H),3.64(s,3H),3.56(s,6H),2.48(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.1,151.8,147.7,142.2,136.6,135.7,130.2,129.4,129.2,127.7,126.1,125.0,113.7,104.1,101.9,59.9,54.8,54.6,28.7,15.0.HRMS(ESI)calcd for C26H27N3O4S[M+H]+478.1801,found 478.1799.
化合物7a2-7a4的通用合成方法
取0.5mL亚硝酸正丁酯于25mL圆底烧瓶中，加入1mLTHF,65℃回流30min后，加入相应的化合物6a2-6a4(20.0mg),反应继续回流3h后，TLC检测反应完全。停止反应，浓缩除去溶剂，加入水和乙酸乙酯各10mL分液，剩余水相再用乙酸乙酯萃取(3×10mL)，合并有机溶剂，用无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，制备TLC纯化得到目标化合物7a2-7a4。
1-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑(7a2)
通过化合物6a2通过上述方法制备，得到化合物7a2，浅黄色固体，16.2mg，产率为83.7％，HPLC纯度为96.6％，熔点为156-158℃。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.42(s,1H),7.06(dd,J＝12.3,2.1Hz,1H),7.00(ddd,J＝8.4,2.1,1.1Hz,1H),6.91(t,J＝8.6Hz,1H),6.73(s,2H),3.97(s,3H),3.89(s,3H),3.86(s,3H),3.73(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.4,153.1,150.9,148.2,146.5,137.8,130.3,128.4,126.3,126.2,124.7,124.7,119.4,116.6,116.4,113.4,113.4,105.4,60.9,56.4,56.0,39.0.HRMS(ESI)calcd for C20H21FN2O4[M+H]+373.1564,found 373.1560.
1-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(4-乙氧基苯基)-1H-吡唑(7a3)
通过化合物6a3通过上述方法制备，得到化合物7a3，浅黄色固体，17.2mg，产率为89.8％，HPLC纯度为99.5％，熔点为153-154℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.40(s,1H),7.21(d,J＝8.6Hz,2H),6.85(d,J＝8.2Hz,2H),6.75(s,2H),4.03(q,J＝7.0Hz,2H),3.96(s,3H),3.84(s,3H),3.70(s,6H),1.41(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ157.9,153.0,148.2,137.4,130.2,130.1,129.0,125.5,120.5,114.4,105.2,63.5,60.9,55.9,39.0,14.8.HRMS HRMS(ESI)calcd for C21H24N2O4[M+H]+369.1814,found 369.1815.
1-甲基-3-(3,4,5-甲氧基苯基)-4-(4-甲巯基苯基)-1H-吡唑(7a4)
通过化合物6a4通过上述方法制备，得到化合物7a4，浅黄色固体，16.8mg，产率为99.1％，HPLC纯度为99.1％，熔点为161-163℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.38(s,1H),7.19-7.12(m,4H),6.66(s,2H),3.92(s,3H),3.78(s,3H),3.64(s,6H),2.41(s,3H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.0,148.3,136.8,137.7,136.8,130.3,130.0,129.2,128.6,126.7,120.2,105.4,60.9,55.9,39.0,16.0.HRMS(ESI)calcd for C20H22N2O3S[M+H]+371.1429,found 371.1425.
1-甲基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吡唑(10)
称取化合物8(1.02g，8.10mmol)，化合物9(2.57g，24.3mmol)，Na2CO3(2.57g，24.3mmol)和Pd(PPh3)4(93.6mg，0.081mmol)于100mL圆底烧瓶中，再加入混合溶剂THF(30mL)和水(15mL)，氮气保护，在70℃反应12h后，TLC检测反应完全，停止反应，旋蒸除去有机溶剂，加入乙酸乙酯30mL溶解，依次用水(30mL)和饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，柱层析纯化得化合物10。得950mg，浅黄色固体，产率为94.5％，熔点为101-103℃.1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.51(d,J＝1.6Hz,1H),6.60(s,2H),6.28(d,J＝1.6Hz,1H),3.94-3.86(m,12H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.4,143.7,138.5,138.3,126.0,106.3,106.0,61.0,56.3,37.4.HRMS(ESI)calcd for C13H16N2O3[M+H]+249.1239,found 249.1239.
4-溴-1-甲基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吡唑(11)
称取化合物10(900mg，3.62mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入12mLDMF溶解，0℃下加入NBS(708mg，3.98mmol)的DMF(8mL)溶液，继续反应3h后，TLC检测反应完全，停止反应，用油泵旋蒸除去有机溶剂，加入乙酸乙酯30mL溶解，依次用水(30mL)和饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，柱层析纯化得化合物11。得1.02g，浅黄色固体，产率为86.1％，熔点为79-80℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.53(s,1H),6.60(s,2H),3.93(s,3H),3.90(s,6H),3.84(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.4,141.3,139.2,138.8,123.6,107.1,93.4,60.9,56.3,38.4.HRMS(ESI)calcd for C13H15BrN2O3[M+Na]+349.0164,351.0143,found 349.0164,351.0145.
化合物12a2-12a4的通用合成方法
称取化合物11(100mg，0.307mmol)，相应的苯硼酸(0.614mmol，分别为3-氟-4-甲氧基苯硼酸，对乙氧基苯硼酸和对甲巯基苯硼酸)，Na2CO3(195mg,1.84mmol)和Pd(PPh3)4(17.3mg，0.015mmol)于25mL圆底烧瓶中，再加入混合溶剂THF(4mL)和水(2mL)，氮气保护，在70℃反应12h后，TLC检测反应完全，停止反应，旋蒸除去有机溶剂，加入乙酸乙酯10mL溶解，依次用水(5mL)和饱和食盐水(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，制备TLC纯化的化合物12a2-12a4。
1-甲基-4-(3-氟-4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吡唑(12a2)
通过化合物11和3-氟-4-甲氧基苯硼酸通过上述方法制备，得到化合物12a2，米白色固体，65.2mg，产率为59.9％，HPLC纯度为99.2％，熔点为136-138℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.74(s,1H),6.96–6.83(m,3H),6.49(s,2H),3.93(s,3H),3.86(s,3H),3.82(s,3H),3.80(s,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.8,153.4,151.0,146.4,146.2,140.4,138.9,136.3,125.4,125.4,124.5,123.0,123.0,120.0,115.1,114.9,113.5,113.5,107.3,61.0,56.4,56.3,37.0.HRMS(ESI)calcd for C20H21FN2O4[M+H]+373.1564,found 373.1561.
1-甲基-4-(4-乙氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吡唑(12a3)
通过化合物11和对乙氧基苯硼酸通过上述方法制备，得到化合物12a3，米白色固体，67.8mg，产率为63.1％，HPLC纯度为98.6％，熔点为148-149℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.68(s,1H),7.12(d,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.50(s,2H),3.99(q,J＝7.0Hz,3H),3.92(s,3H),3.80(s,3H),3.78(s,6H),1.39(t,J＝7.0Hz,3H).13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ157.5,153.5,138.4,137.0,128.4,125.7,125.1,120.7,114.5,107.4,63.4,61.0,56.3,37.4,14.8.HRMS(ESI)calcd for C21H24N2O4[M+H]+369.1814,found 369.1809.
1-甲基-4-(4-甲巯基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-吡唑(12a4)
通过化合物11和对甲巯基苯硼酸通过上述方法制备，得到化合物12a4，米白色固体，66.5mg，产率为61.2％，HPLC纯度为99.3％，熔点为165-166℃。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.73(s,1H),7.13(s,4H),6.50(s,2H),3.93(s,3H),3.79(s,9H),2.45(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ153.6,139.9,138.6,137.0,136.1,129.7,127.5,126.8,125.5,120.3,107.3,61.0,56.3,37.3,16.0.HRMS(ESI)calcd for C20H22N2O3S[M+H]+371.1429,found 462.2025.
以下通过药效实验证明本发明的有益效果。
试验例1体外抗肿瘤细胞增殖实验
1.1.实验方法
目标化合物溶解于DMSO(10mg/mL)作为储备液，临用前用培养基稀释至相应的浓度。体外实验用的细胞为：SK-OV-3(人类卵巢癌细胞),MDA-MB-231(人类乳腺癌细胞),CT26(小鼠结肠癌细胞),MCF-7(人类乳腺癌细胞),A549(人类非小细胞肺癌和HeLa(人类宫颈癌细胞)。
细胞铺于96孔板，每孔100微升，密度为(3-5)×105细胞/毫升，铺好的细胞在细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育过夜，然后加入配置好的不同梯度浓度的的药液，每孔100微升，继续在细胞培养箱中孵育，每隔24h观察细胞生长情况。72h后加入CCK-8并孵育适当时间后，在酶标仪上检测各孔的OD值。最后利用数据软件GraphPad Prism 6分析绘制相应的肿瘤生长抑制曲线(纵坐标为细胞活力，横坐标为药物为药物浓度)，并计算药物抑制细胞增殖的IC50(抑制半数细胞增殖所需要的药物浓度)。
1.2.实验结果
利用CCK-8实验方法，首先在SK-OV-3(人类卵巢癌细胞)和MDA-MB-231(人类乳腺癌细胞)中评价本发明化合物6a1-6d4,7a2-7a4和12a2-12a4的体外抗肿瘤细胞增殖活性，测试结果见表1：
表1.化合物6a1-6d4,7a2-7a4和12a2-12a4对SK-OV-3和MDA-MB-231的体外抗增殖活性
aIC50定义为抑制半数细胞增殖时的药物浓度。数据以平均值±SEM的形式展现，实验至少重复三次。
从以上实验结果可以看出，本发明化合物展示出中等到较强的体外抗肿瘤细胞增殖的活性，这说明本发明通过用吡唑环替代CA-4原来的双键结构，并对吡唑环和B环进行恰当修饰，不仅可以解决CA-4顺式构象容易转变为反式构象的问题，而且还很好地保留了CA-4的抗肿瘤活性。
为进一步验证本发明化合物的抗肿瘤活性，选取IC50值较小的化合物7a2,7a3,12a2和12a3对另外四种肿瘤细胞进行测试，这4个细胞为：HeLa(人类宫颈癌细胞),A549(人类非小细胞肺癌),CT26(小鼠结肠癌细胞)和MCF-7(人类乳腺癌细胞)，测试结果见表2和图1。
表2.化合物7a2，7a3，12a2和12a3对多种肿瘤细胞的体外抗增殖活性
aIC50定义为抑制半数细胞增殖时的药物浓度。数据以平均值±SEM的形式展现，实验重复三次。
结果表明，化合物7a2,7a3,12a2和12a3在宫颈癌细胞、非小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞中均展示出良好的体外抗增殖活性，其IC50在28.8到187.3nM范围。在所有测试的化合物中，7a3表现出最佳的抗肿瘤细胞增殖活性。
基于体外抗肿瘤细胞增殖活性研究，初步总结本发明化合物的构效关系如下：
总体而言，化合物6a1-6d4表现出中等强度的抗肿瘤细胞增殖活性，其IC50属于微摩尔级别。在这16个化合物中，6a3和6a4(N1位甲基取代)表现出更好的活性，其IC50分别为0.338-0.438μM(SK-OV-3)和0.490-0.748μM(MDA-MB-231)。若将N1位的甲基换成更大的取代基，如叔丁基，对氟苯基和对甲氧基苯基，则化合物的活性显著降低(6a4与6b4，6c4和6d4比较)。而当同时在B环引入对甲巯基后，活性仅有轻微降低(6a3与6b3，6c3和6d3比较)。在B环引入对甲氧基和3-氟-4-甲氧基的化合物仅表现出最低限度的活性，且不会随着N1位取代基的改变而有较大的变化(6a1-6a2与6b1-6b2，6c1-6c2和6d1-6d2比较)。基于以上结果表明N1位甲基取代和B环对乙氧基取代或对甲巯基取代对其体外抗增殖活性有利(6a3和6a4)。
化合物7a2-7a4的体外抗增殖活性明显要比含有氨基取代的类似物强，其IC50为0.017-0.155μM(SK-OV-3)和0.031-0.307μM(MDA-MB-231)(与6a2-6a4比较)，特别是7a2，其活性比相应的6a2强887倍。这些结果表明脱氨基对增强类似物的体外抗增殖活性具有重要的意义。
本发明也同时探索A环从吡唑环的C3移到C5位前后的活性变化，结果表明，两者具有相当的体外抗细胞增殖活性(12a2-12a4与7a2-7a4比较)，说明A环取代位置的改变对体外抗增殖活性的影响很小。
试验例2细胞周期实验
2.1.实验方法
收集对数生长期的SK-OV-3细胞铺板于6孔板中，细胞密度为5×105个细胞/孔，在细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育过夜。加入刚稀释的7a3溶液，浓度为40，80和160nM，以二甲基亚砜(DMSO)为空白对照。继续孵育24h后，收集细胞，离心(3000rpm，3min)，去除上清，细胞再用预冷的PBS洗涤1次(约1mL)。用预冷的70％乙醇(1mL)固定，温度为4℃。固定过夜后(>12h)，再次离心(3000rpm，3min)，去除上清，细胞用预冷的PBS洗涤1-2次，然后用碘化丙啶(PI)于37℃染色30min。最后用流式细胞仪检测细胞的周期分布情况，并用NovoExpress软件分析数据。
2.1.实验结果
本发明采用流式细胞术检测7a3对SK-OV-3细胞周期的影响。药物作用时间为24h，未经7a3处理的细胞作为空白对照(二甲基亚砜)。结果见图2，其中，图2B直方统计图数据以平均值±SEM的形式呈现，*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001(表明显著不同于对照，t-检验)。
实验结果表明，对于二甲基亚砜处理的细胞，G0/G1期和G2/M期的比例分别为67.79％和14.12％。而经7a3处理后(40,80和160nM)，G2/M期的细胞明显增加(分别增加到24.59％,34.65％和64.79％)。这些结果表明，7a3显著抑制细胞周期于G2/M期。
试验例3细胞凋亡实验
3.1.实验方法
收集对数生长期的SK-OV-3细胞铺板于6孔板中，细胞密度为2.5×105细胞/孔，在细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育过夜。加入刚稀释的7a3溶液，浓度为40，80和160nM，以二甲基亚砜(DMSO)为空白对照。继续孵育48h后，收集细胞，离心(3000rpm，3min)，去除上清，细胞用预冷的PBS洗涤1次(约1mL)，然后在室温下加入Annexin V-FITC和PI，孵育20min后，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，并用NovoExpress软件分析数据。
3.2.实验结果
本发明利用流式细胞术检测7a3诱导细胞杀伤的作用模式。药物处理48h后，收集细胞，双染碘化丙啶(PI)和荧光标记的Annexin-V。PI染色DNA，只能渗透进入死细胞，Annexin-V能高选择性的结合磷脂酰丝氨酸(PS)。双染PI和Annexin-V能区分活细胞(Annexin-V-/PI-)，早期凋亡细胞(Annexin-V+/PI-)，晚期凋亡细胞(Annexin-V+/PI+)和坏死细胞(Annexin-V-/PI+)。
实验结果表明，经二甲基亚砜处理后，凋亡细胞(Annexin-V阳性)比例为4.90％。而在给定浓度(40,80和160nM)下，7a3显著增加凋亡细胞的比例(分别增加至8.00％，23.72％和56.82％)(图3)。这些结果表明，7a3可能通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗细胞增殖的活性。
试验例4划痕实验
4.1.实验方法
收集对数生长期的SK-OV-3细胞铺板于6孔板中，细胞密度为5×105细胞/孔，在细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育12h。用枪头在贴壁细胞中划出若干划痕，然后用PBS小心洗涤孔板两次，以除去悬浮细胞和多余的碎片。显微镜下观察划痕情况并拍照，作为0h对照。接着加入含1％胎牛血清的培养基和7a3的培养基溶液(80和160nM)，以二甲基亚砜为空白对照，继续在培养箱中孵育。分别于加药后12h和24h取出，用显微镜观察划痕的闭合情况并拍照。
4.2.实验结果
本发明采用划痕实验来检测7a3抑制肿瘤细胞迁移的潜能。实验结果表明，与空白对照组(二甲基亚砜处理)相比，7a3(80和160nM)显著抑制细胞迁移。加药24h后，空白对照组的划痕闭合百分比为79.5±2.8。而在7a3处理组(80和160nM)中，划痕闭合百分比显著降低(分别为44.3±4.0和32.1±0.9)(图4)。划痕实验结果表明，7a3显著抑制肿瘤细胞的迁移。
试验例5 Transwell实验
5.1.实验方法
收集对数生长期的SK-OV-3细胞铺板于6孔板中，细胞密度为5×105细胞/孔，在细胞培养箱(37℃，5％CO2)孵育12h。加入刚用培养基稀释的7a3(25，50和100nM)溶液，以二甲基亚砜(DMSO)作为空白对照。继续孵育24h，消化细胞，PBS洗涤两次。用无血清的DMEM培养基铺细胞于Transwell小室上层，密度为5000细胞/室，体积为500μL。同时加入500μL的含10％胎牛血清的DMEM培养基于Transwell小室的下层。细胞继续在培养箱中孵育24h后，用甲醇固定细胞，并用结晶紫染色。根据着色深浅，适时用荧光显微镜观察迁移细胞情况并拍照。
5.2.实验结果
本发明进一步采用Transwell实验来检测7a3抑制肿瘤细胞的潜能。实验结果表明，与空白对照组(二甲基亚砜处理)相比，7a3(25,50和100nM)显著抑制细胞的迁移。加药处理24h后，空白对照组中迁移细胞的平均数目为50.7±2.5，而7a3(25，50和100nM)处理组中迁移细胞的平均数目显著降低(分别为27.3±2.1，21.7±2.5和18.3±2.1)(图5)。Transwell实验进一步结果表明，7a3显著抑制肿瘤细胞的迁移。
试验例6微管聚合实验
6.1.实验方法
微管蛋白购买于Cytoskeleton，使用时将其溶解于专用缓冲液(80mM PIPES,2mMMgCl2，pH 6.9)，配成3mg/mL的微管蛋白溶液，4℃保存待用。往384孔板中加入用该缓冲液稀释的7a3溶液(2.5,10和40μM)，以二甲基亚砜作为空白对照。临时用UP水配置GTP溶液作为母液，浓度为100mM。取适量微管蛋白，加入少量GTP至其终浓度为1mM，混匀后快速加入至各孔中。快速放入酶标仪中，在340nm下检测各孔样品的OD值，每隔1分钟重复检测一次，总共30分钟(实验前需预先调节好仪器)。根据OD值绘制微管聚合曲线。
6.2.实验结果
微管蛋白聚合后，在340nm处的光密度值(OD值)会增大，当微管聚合抑制剂存在时，微管聚合受阻，OD值降低。本发明通过测定微管蛋白聚合过程中OD值得的变化，从而检测7a3对微管聚合的抑制活性。在微管蛋白聚合初始，加入不同浓度(2.5，10和40μM)的7a3溶液，以二甲基亚砜(1％，v/v)为空白对照，检测OD值随时间的变化。结果见图6(每隔1分钟监测微管的聚合情况，持续30分钟，监测波长为340nm)。
实验结果表明，在此给定浓度下，7a3显著抑制微管蛋白聚合，并且具有浓度依赖性。与空白对照相比，7a3在2.5,10和40μM时的微管蛋白聚合抑制百分比分别为30.5％，60.4％和85.3％。这些结果与7a3的体外抗增殖活性具有很好的相关性，表明7a3通过抑制微管的聚合进而抑制肿瘤细胞的增殖。
试验例7免疫荧光实验
7.1.实验方法
收集对数生长期的SK-OV-3细胞铺于96孔板中，细胞培养箱孵育过夜。加入不同浓度的7a3溶液(10,100和1000nM)，并以二甲基亚砜作为空白对照。细胞继续孵育24h后，用甲醇固定，并用5％BSA/PBS封闭45min。接着孵育一抗(mouse,monoclonal1:1000,Sigma-Aldrich,Milano,Italy)，4℃过夜。细胞用PBS洗涤三次后，孵育荧光标记的二抗(1:2000,Invitrogen,Milano,Italy)。孵育1h后，细胞用PBS洗涤两次，再用DAPI(1:10000,Sigma,Milano,Italy)复染。用共聚焦激光扫描显微镜(A1R/A1,Nikon,Japan))观察细胞内微管的组装情况。
7.2.实验结果
本发明进一步在细胞水平检测7a3对微管组装的作用。SK-OV-3细胞与7a3(10，100和1000nM)和二甲基亚砜(空白对照)孵育24h后，先染上FITC(绿色荧光)标记的抗β-微管蛋白抗体和DAPI(蓝色荧光)，再用共聚焦激光扫描显微镜观察分析。结果见图7，微管和未组装的微管蛋白以绿色展示，DNA以蓝色展示。
实验结果表明，空白对照组的细胞保持正常的微管组织形态，微管从中央区域向细胞周围扩展。而经7a3(10，100和1000nM)处理后，细胞内微管的聚合和纺锤体的形成处于混乱状态，细胞有丝分裂受阻，形成非正常的有丝分裂纺锤体。该研究结果表明7a3显著抑制肿瘤细胞内微管的组装。
试验例8微管蛋白-7a3复合物的晶体结构
8.1.实验方法
(1)蛋白的表达纯化和结晶
相关蛋白的表达纯化和结晶参照文献：Y.Wang,Y.Yu,G.B.Li,S.A.Li,C.Wu,B.Gigant,W.Qin,H.Chen,Y.Wu,Q.Chen,J.Yang,Mechanism of microtubulestabilization by taccalonolideAJ,Nat.Commun.8(2017)15787，参见文章第6页方法部分(Methods：“Protein expression and purification”和“Crystallization”)。
(2)X-ray数据的获取和结构解析
T2R-TTL-7a3复合物晶体送样至上海光源(SSRF)，在光束BL19U1下获得晶体的衍射数据，并用HKL2000程序包进行索引、集成和缩放。以数据库中的T2R-TTL结构(PDB：4I55)作为探究模型，进行分子替换，从而解析T2R-TTL-7a3复合物的结构。接着依次用PHASER程序执行旋转和翻译功能，用COOK手动建立模型，用PHENIX程序的phenix.refine模块精致结构模型，用PROCHECK程序验证模型质量。
8.2.实验结果
本发明进一步采用X-射线晶体学在近原子水平研究7a3与微管蛋白作用机制，并提供可用的结构优化信息。本发明成功解析T2R-TTL(由a/β-微管蛋白，tathmin样蛋白RB3和微管酪氨酸激酶组成)与7a3共晶结构，分辨率为
晶体学数据上传至PBD数据库，编码为5Z4U。详细的数据收集和结构解析数据见表3，X-射线晶体学分析T2R-TTL-7a3复合物的结构图见图8。
表3.数据收集和结构解析
实验结果表明，7a3结合在微管蛋白秋水仙碱位点(图8B)，并且均为疏水作用，主要表现为与L240,A248,K252,N256,V316,K350和A352等的相互作用(没有发现氢键作用)(图8C)。研究进一步发现7a3与微管蛋白结合后，与附近二级结构单元发生空间碰撞，阻断微管蛋白由曲线到直线的构象变化，从而抑制微管的组装，此结果与秋水仙碱的作用模式相似(图8D)。此外，研究表明7a3与秋水仙碱(PBD编码为4O2B)和CA-4(PBD编码为5LYJ)具有相同的结合位置，并且与它们能够重叠完好(图8E)。
X-射线晶体学研究表明7a3通过作用于微管蛋白秋水仙碱位点从而抑制微管的聚合。
试验例9药物代谢动力学实验
9.1实验方法
购买12只8周龄的雄性C57小鼠(18-22g)，饲养在标准的条件下。7a3溶于含5％(v/v)二甲基亚砜的橄榄油中，剂量为50mg/kg，腹腔注射100μL。在指定时间点通过颌下静脉压迫取血约40-50μL，每个时间点3只小鼠。时间点为0,5min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,12h和24h。离心(3000rpm，4℃，15min)后取15μL血浆保存于-80℃待用。
以CA-4为内标，用色谱乙腈配置7a3和CA-4母液，浓度为5mg/mL。2倍梯度配制7a3的梯度浓度(750到0.01ng/mL，共17个浓度梯度)用作制备标准曲线的工作液，同时配制1200ng/mL的IS工作液。准备17个EP管，各加入血浆15μL，60μL梯度浓度的工作液和15μL IS工作液，涡旋混匀后，离心，取上清液(终浓度为：500到0.01ng/mL，IS为200ng/mL)约70μL用于LC/MS/MS分析，制备标准曲线。
样品分析的色谱条件为：
仪器：LC–MS/MS 8050 system,Shimadzu Corporation；
色谱柱：Acquity BEH C18 column(50mm×2.1mm×1.7μm)；
流动相A为含0.025％甲酸的水，流动相B为含0.025％甲酸的乙腈；
流动相比例的梯度变化为：0-0.8min，25-50％的B；0.8-3.8min，50-90％的B；3.8-4.0min，95％的B；4.0-4.2min，95-25％的B；4.2-6.0min，25％B；
质谱为阳离子ESI模式，并用多反应检测模式(MRM)定量；用LabSolutions LCMSVer.5.6软件(Shimadzu,Japan)获得和分析数据，用WinNolin 5.1 software(Pharsight)软件计算药动学参数(非隔室模型)。
9.2.实验结果
本发明开展7a3的药物代谢动力学研究。C57雄性小鼠腹腔给药，剂量为50mg/kg，收集血样后，采用LC/MS/MS技术进行分析。用MRM模式进行7a3的定量分析，具体为7a3:m/z369.05/339.00 CE:25V，369.05/336.00 CE:22V,369.05/306.80 CE:28V；IS(CA-4)m/z317.05/285.90 CE:19V，317.05/284.80 CE:12V,317.05/165.10 CE:40V，其中CE为碰撞能量。7a3和IS(CA-4)的保留时间分别为3.113min和2.825min(图9)。
通过加权线性回归绘制IS的峰面积比例，从而建立7a3的标准曲线。该方法在0.01to 500ng/mL浓度范围内具有良好的线性，相关系数为r2>0.999(Y＝0.0123349X+0.0247413,r＝0.9993726)(图10)。7a3的主要PK参数通过非隔室模型计算得到，见表4。
表4. 7a3的血浆药动学参数(50mg/kg，单一剂量，腹腔注射)
a参数:t1/2，半衰期；Kel,单位时间内的药物消除；tmax，达到最大血药浓度的时间；Cmax，最大血药浓度；AUC，药是曲线下面积；AUMC，第一矩曲线下面积；MRT，平均滞留时间。
结果表明：7a3在0.25h达到峰浓度(Cmax＝882±71ng·mL-1)，然后在4h内快速下降，12h后检测不到7a3(图11)。7a3的消除半衰期为1.65h，药物血浆浓度-时间曲线下面积为AUC0-24h:1139±121和AUC0-inf:1166±129h·ng·mL-1。
试验例10体内动物实验
10.1.实验方法
购买6周龄的Balb/c裸鼠(18-20g，Hfkbio)饲养与标准条件下收集SK-OV-3细胞，细胞悬液加基质胶混匀，上背侧皮下接种，接种量为107细胞/只。待肿瘤体积长到约200mm3，小鼠平均分成3组，每组6只。7a3和CA-4溶于含5％(v/v)二甲基亚砜的橄榄油中，经腹腔注入小鼠体内(100μL)，分别作为实验组，剂量为50mg/kg。含5％(v/v)二甲基亚砜的橄榄油作为空白对照。每隔一天给药一次，总共给药3次。
肿瘤体积用电动的卡尺测量，每隔3-4天测定一次，同时给小鼠称重，并观察小鼠的活动情况和体表特征。肿瘤体积的计算方法为：1/2×长×宽×宽。当肿瘤长到1500mm3后，处死小鼠，收集重要脏器，包括心、肝、脾、肺和肾等组织，做H&E染色。动物实验符合四川大学生物治疗国家重点实验室动物保护和伦理委员会的有关规定。
10.2.实验结果
本发明进一步评价7a3的体内抗肿瘤效果。
实验结果表明，相对于空白对照，7a3治疗组的肿瘤体积显著降低(62.8％，P<0.05，图12A)，并且其治疗效果显著优于CA-4。在整个治疗期间，没有发生明显的体重变化(图12B)。重要脏器(心、肝、脾、肺和肾)的H&E染色结果表明，7a3给药后不会对重要脏器造成明显的病理变化(图13)。
以上结果表明，7a3(50mg/kg)显著抑制肿瘤进展，并且没有明显的毒性。
Claims (3)
1.化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、宫颈癌的药物中的用途；所述化合物选自：
2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述药物是以所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是：所述的制剂是口服制剂。
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