CN108398578B - 一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于原子力显微镜的测量技术领域,提供一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,可以实现纳米颗粒与细胞间相互作用的直接测试。该法利用纳米级磁性颗粒与微米级碳球颗粒,将原子力显微镜V形微悬臂与平板探针置于显微镜下,通过滴加颗粒混合分散液、清洗、干燥等过程,得到修饰有磁性纳米颗粒的V形“类锥形针尖”探针。本发明引入微米级碳球作为磁性纳米颗粒的载体,简化实验操作,提高修饰效率,优化修饰效果,实现了对纳米颗粒与细胞间相互作用的直接测试,为细胞对颗粒的摄取、颗粒与细胞间粘附力、细胞存活能力等研究提供进一步的实验验证。
Description
技术领域
本发明属于原子力显微镜的测量技术领域,涉及一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法。
背景技术
磁感应热疗是一种通过磁性颗粒进入细胞在外加交变磁场的作用下产热“烫死”癌细胞的物理治疗手段,具有安全高效、生物相容性好、靶向性高且毒副作用小的特点。在磁感应热疗中使用纳米级磁性颗粒能够高效地“烫死”癌细胞而不损伤正常细胞,提高治疗效果。
研究磁性纳米颗粒与细胞间的相互作用力,有助于进一步明确纳米颗粒的靶向摄取机理,更高效地实现癌细胞的靶向治疗。目前研究纳米颗粒与细胞的相互作用,通常选择通过观察诸如细胞粘附、生存能力、形态、代谢活动、氧化应激和粒子的吸收等特性,但上述特性仅能间接表示其作用关系。原子力显微镜(AFM)是一种先进的表面灵敏技术,能够实时描绘出分子水平上的相互作用,使得对细胞粘附、生存、分化、摄取等过程的定量研究成为可能,在细胞力学方面有着广泛应用。通过修饰有纳米颗粒的AFM探针,可以直接定性和定量测量纳米载体和细胞膜的作用,了解细胞摄取和细胞内纳米颗粒的取向,AFM图像同样可以用来监测细胞表面动态变化的过程。
目前常用的探针修饰技术包括涂层法、胶粘法、喷雾法、溶液沉积法等,然而由于探针针尖曲率半径为纳米级,不易观察,对针尖的修饰通常需要借助大型显微观察及操作设备,对实验条件要求苛刻。同时,探针针尖表面积有限,上述方法无法保证单分散的纳米颗粒精确地附着于针尖处,影响后续成像质量与力曲线的测试。并且,由于颗粒黏附强度有限,不能保证探针的使用强度和重复利用性。基于此,本发明提出一种简单高效的原子力显微镜探针修饰方法,通过引入微米级碳球作为磁性纳米颗粒的载体,增大颗粒与探针的接触面积,使纳米颗粒精确附着于探针最高点,提高颗粒的粘附率;以碳球构造“类锥形针尖”结构,提升修饰效率,简化修饰过程。修饰得到的探针具有足够的强度用于测试,能够实现对纳米颗粒-细胞相互作用的直接实时测试,为细胞对颗粒的摄取、颗粒与细胞间粘附力、细胞存活能力等研究提供进一步的实验验证。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,采用V形微悬臂“类锥形针尖”结构修饰技术,根据流体力学中的圆柱绕流与卡门涡街现象,在V形微悬臂端部的分散液出现涡流,颗粒发生绕动并聚集,同时由于平板探针针尖的诱导作用,导致颗粒向下呈锥形聚集,在V形微悬臂端部形成“类锥形针尖”结构。利用磁性纳米颗粒,以碳球为载体对AFM探针进行修饰。该法操作简单、修饰效果好,使用该探针可以直接测试纳米颗粒与细胞间的相互作用。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,包括以下步骤:
第一步,采用常规方法分别制备合成微米级碳球、磁性纳米颗粒,微米级碳球的粒径为0.5μm~10μm,磁性纳米颗粒的粒径为10nm~100nm。
所述的制备微米级碳球的常规方法包括微乳液法、水热法、溶剂热法或溶胶-凝胶法中的一种;所述的制备磁性纳米颗粒的常规方法包括水热法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、机械球磨法、物理气相沉积法中的一种。所述的磁性纳米颗粒包括锌、钴、镍、锰、铬、铝、钆等元素中的一种或两种及以上掺杂的铁氧体。
第二步,配制微米级碳球-磁性纳米颗粒的混合分散液
室温下,将微米级碳球加入溶剂中,每10mL溶剂对应1~50mg微米级碳球,超声分散得到分散液;再将磁性纳米颗粒加入分散液中,超声分散得到混合分散液。所述的微米级碳球与磁性纳米颗粒的质量比为1:0.5~5。所述的溶剂包括甲醇、无水乙醇、正己烷、二氯甲烷、丙酮中的一种。
第三步,对探针进行修饰
将V形微悬臂与平板探针放置于同一光学显微镜下,平板探针置于V形微悬臂下方,二者不可接触且上下相距1~50μm,并保证平板探针针尖位置正对V形微悬臂端部;采用滴管将第二步中得到的混合分散液适量滴入平板探针针尖与V形微悬臂端部相对处,V形微悬臂端部可修饰得到“类锥形针尖”结构,得到修饰后的探针。所述的混合分散液的体积在5~300μL之间。
第四步,清洗、干燥探针
采用清洗液清洗已修饰的探针后,干燥处理6~24h,得到已修饰磁性纳米颗粒的AFM探针,干燥环境包括冷冻干燥、超临界二氧化碳干燥、高温真空干燥、室温自然干燥中的一种。
所述的清洗液包括无水乙醇、75%乙醇、生理盐水、去离子水、双氧水中的一种或两种以上。
采用原子力显微镜测试细胞-纳米颗粒相互作用力,步骤如下:
1)制备细胞样品:将密度为1×106个/mL的细胞悬液接种于盖玻片上,培养至对数生长期,使用2.5%戊二醛固定,制成可用于测试的细胞样品。
2)原子力显微镜实验:使用已修饰探针,在接触模式下进行成像,选取10个测试点进行力-位移曲线的测试。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提出的原子力显微镜探针修饰方法,通过引入微米级碳球作为磁性纳米颗粒的载体,增大颗粒与探针的接触面积,提高颗粒的粘附率和粘附强度,同时提高修饰效率,简化修饰过程。修饰得到的探针具有足够的强度用于原子力测试,测试所得细胞-磁性纳米颗粒相互作用对细胞对颗粒的摄取、细胞与颗粒间粘附力、细胞存活能力等研究提供进一步的实验验证。
附图说明
图1为V形微悬臂与平板探针放置关系示意图;
图2(a)为平板探针结构图;图2(b)为V形微悬臂结构图;
图3为修饰后V形微悬臂表面形貌图(SEM);
图4为修饰后V形微悬臂“类锥形针尖”最高点磁性纳米颗粒分布图;
图5为原子力显微镜测得细胞-磁性纳米颗粒的力-距离曲线。
图中:1操作平台;2V形微悬臂;3平板探针;4混合分散液。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1是实施例中针尖修饰操作示意图,将V形微悬臂与平板探针如图放置,滴加分散液使颗粒聚集达到修饰目的。图3是实施例1中修饰后的V形探针表面形貌图;从图3中我们可以看出,表面附着磁性纳米颗粒的碳球在V形悬臂尖端聚集,形成“类锥形针尖”,能够作为探针针尖用以测量磁性纳米颗粒与细胞的相互作用。
实施例1
a)颗粒的合成:使用微乳液法制备微米级碳球。使用水热法制备锰锌铁氧体磁性纳米颗粒。
b)微米级碳球-纳米颗粒混合分散液的配制:取2mg尺寸约为1μm的碳球颗粒加入到10mL甲醇中,用超声波清洗振荡仪超声分散10min以保证碳球均匀分散在甲醇中。随后取1mg磁性纳米颗粒加入到上述分散液中,再次使用超声波清洗振荡仪超声分散30min,以确保磁性纳米颗粒与碳球充分接触且均匀附着,得到均匀的混合分散液。
c)修饰探针:准备V形微悬臂与平板探针,将其置于光学显微镜下,V形微悬臂与平板探针上下距离10μm,如图1所示。通过镜下观察,用滴管吸取10μL混合分散液,在V形微悬臂端部滴加。待液体中的颗粒通过涡流作用聚集在悬臂尖端,形成类针尖状。
d)对探针进行清洗与干燥:使用去离子水对上述探针清洗三遍,将其置于真空干燥箱中干燥12h。
e)对已修饰的探针进行形貌观察:使用扫描电子显微镜对V形微悬臂“类锥形针尖”结构进行观察,确定针尖最高处位置。使用环境扫描电子显微镜对最高处表面磁性纳米颗粒的包覆情况进行观察。
基于已修饰磁性纳米颗粒的AFM探针进行的细胞-纳米颗粒作用实验,其具体步骤如下:
1)制备细胞悬液:取处于对数生长期的人宫颈癌细胞(Hela),经消化、离心、重悬,制成密度为1X106,个/mL的细胞悬液。
2)细胞培养与固定:将细胞悬液接种于盖玻片上,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养24h。使用磷酸缓冲液对已培养的细胞进行冲洗,并使用质量分数为2.5%的戊二醛溶液于4℃、避光环境下进行细胞固定。
3)使用原子力显微镜测试:将已修饰的探针安装在原子力显微镜上,细胞样品置于样品台。选择接触模式进行实验,扫描范围为30×30(μm),成像后选取任意10个点进行力-位移曲线测量,记录实验数据,处理实验数据得到力-距离曲线。
实施例2
a)颗粒的合成:使用溶剂热法制备微米级碳球。使用共沉淀法制备钴铁氧体磁性纳米颗粒。
b)微米级碳球-纳米颗粒混合分散液的配制:取1mg尺寸约为5μm的碳球颗粒加入到10mL丙酮中,用超声波清洗振荡仪超声分散10min以保证碳球均匀分散在丙酮中。随后取3mg磁性纳米颗粒加入到上述分散液中,再次使用超声波清洗振荡仪超声分散30min,以确保磁性纳米颗粒与碳球充分接触且均匀附着,得到均匀分散的混合分散液。
c)修饰探针:准备V形微悬臂与平板探针,将其置于光学显微镜下,V形微悬臂与平板探针上下距离35μm。通过镜下观察,用滴管吸取10μL混合分散液,在V形微悬臂端部滴加。待液体中的颗粒通过涡流作用聚集在悬臂尖端,形成类针尖状。
d)对探针进行清洗与干燥:使用无水乙醇对上述探针清洗三遍,将其置于冷冻干燥箱中干燥24h。
e)对已修饰的探针进行形貌观察:使用扫描电子显微镜对V形微悬臂“类锥形针尖”结构进行观察,确定针尖最高处位置。使用环境扫描电子显微镜对最高处表面磁性纳米颗粒的包覆情况进行观察。
基于已修饰磁性纳米颗粒的AFM探针进行的细胞-纳米颗粒作用实验,其具体步骤如下:
1)制备细胞悬液:取处于对数生长期的人胃癌细胞(MGC-803),经消化、离心、重悬,制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。
2)细胞培养与固定:将细胞悬液接种于盖玻片上,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养24h。使用磷酸缓冲液对已培养的细胞进行冲洗,并使用质量分数为2.5%的戊二醛溶液于4℃、避光环境下进行细胞固定。
3)使用原子力显微镜测试:将已修饰的探针安装在原子力显微镜上,细胞样品置于样品台。选择接触模式进行实验,扫描范围为30×30(μm),成像后选取任意10个点进行力-位移曲线测量,记录实验数据,处理实验数据得到力-距离曲线。
实施例3
a)颗粒的合成:使用水热法制备微米级碳球。使用气相沉积法制备锌钴铬铁氧体磁性纳米颗粒。
b)微米级碳球-纳米颗粒混合分散液的配制:取5mg尺寸约为0.5μm的碳球颗粒加入到10mL正己烷中,用超声波清洗振荡仪超声分散10min以保证碳球均匀分散在正己烷中。随后取5mg磁性纳米颗粒加入到上述分散液中,再次使用超声波清洗振荡仪超声分散30min,以确保磁性纳米颗粒与碳球充分接触且均匀附着,得到均匀分散的混合分散液。
c)修饰探针:准备V形微悬臂与平板探针,将其置于光学显微镜下,V形微悬臂与平板探针上下距离5μm。通过镜下观察,用滴管吸取10μL混合分散液,在V形微悬臂端部滴加。待液体中的颗粒通过涡流作用聚集在悬臂尖端,形成类针尖状。
d)对探针进行清洗与干燥:使用75%乙醇、去离子水对上述探针清洗三遍,将其置于室温条件下自然干燥20h。
e)对已修饰的探针进行形貌观察:使用扫描电子显微镜对V形微悬臂“类锥形针尖”结构进行观察,确定针尖最高处位置。使用环境扫描电子显微镜对最高处表面磁性纳米颗粒的包覆情况进行观察。
基于已修饰磁性纳米颗粒的AFM探针进行的细胞-纳米颗粒作用实验,其具体步骤如下:
1)制备细胞悬液:取处于对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞(3T3-L1),经消化、离心、重悬,制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。
2)细胞培养与固定:将细胞悬液接种于盖玻片上,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养24h。使用磷酸缓冲液对已培养的细胞进行冲洗,并使用质量分数为2.5%的戊二醛溶液于4℃、避光环境下进行细胞固定。
3)使用原子力显微镜测试:将已修饰的探针安装在原子力显微镜上,细胞样品置于样品台。选择接触模式进行实验,扫描范围为30×30(μm),成像后选取任意10个点进行力-位移曲线测量,记录实验数据,处理实验数据得到力-距离曲线。
本专利提出的以上实施例只对技术方案进行说明,而不进行限制。
Claims (10)
1.一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于以下步骤:
第一步,采用常规方法分别制备合成微米级碳球、磁性纳米颗粒,所述的微米级碳球的粒径为0.5μm~10μm,磁性纳米颗粒的粒径为10nm~100nm;
第二步,配制微米级碳球-磁性纳米颗粒的混合分散液
室温下,将微米级碳球加入溶剂中,每10mL溶剂对应1~50mg微米级碳球,超声分散得到分散液;再将磁性纳米颗粒加入分散液中,超声分散得到混合分散液;所述的微米级碳球与磁性纳米颗粒的质量比为1:0.5~5;
第三步,对探针进行修饰
将V形微悬臂与平板探针放置于同一光学显微镜下,平板探针置于V形微悬臂下方,二者不可接触,并保证平板探针针尖位置正对V形微悬臂端部;采用滴管将第二步中得到的混合分散液适量滴入平板探针针尖与V形微悬臂端部相对处,V形微悬臂端部能够修饰得到“类锥形针尖”结构,得到修饰后的探针;所述的混合分散液的体积在5~300μL之间;
第四步,清洗、干燥探针
采用清洗液清洗已修饰的探针后,干燥处理后得到已修饰磁性纳米颗粒的AFM探针。
2.根据权利要求1所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,第三步所述的V形微悬臂与平板探针上下距离1~50μm。
3.根据权利要求1或2所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,第四步所述的干燥时间6~24h,干燥环境包括冷冻干燥、超临界二氧化碳干燥、高温真空干燥、室温自然干燥中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,所述的制备微米级碳球的常规方法包括微乳液法、水热法、溶剂热法或溶胶-凝胶法中的一种;所述的制备磁性纳米颗粒的常规方法包括水热法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、机械球磨法、物理气相沉积法中的一种。
5.根据权利要求3所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,所述的制备微米级碳球的常规方法包括微乳液法、水热法、溶剂热法或溶胶-凝胶法中的一种;所述的制备磁性纳米颗粒的常规方法包括水热法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、机械球磨法、物理气相沉积法中的一种。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,所述的磁性纳米颗粒包括锌、钴、镍、锰、铬、铝、钆元素中的一种或两种及以上掺杂的铁氧体。
7.根据权利要求3所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,所述的磁性纳米颗粒包括锌、钴、镍、锰、铬、铝、钆元素中的一种或两种及以上掺杂的铁氧体。
8.根据权利要求4所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,所述的磁性纳米颗粒包括锌、钴、镍、锰、铬、铝、钆元素中的一种或两种及以上掺杂的铁氧体。
9.根据权利要求1或2或5或7或8所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,第二步所述的溶剂包括甲醇、无水乙醇、正己烷、二氯甲烷、丙酮中的一种;第四步所述的清洗液包括无水乙醇、75%乙醇、生理盐水、去离子水、双氧水中的一种或两种以上。
10.根据权利要求6所述的一种使用磁性纳米颗粒修饰原子力显微镜探针的方法,其特征在于,第二步所述的溶剂包括甲醇、无水乙醇、正己烷、二氯甲烷、丙酮中的一种;第四步所述的清洗液包括无水乙醇、75%乙醇、生理盐水、去离子水、双氧水中的一种或两种以上。
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