CN108388766B - 一种品种间分子差异鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种品种间分子差异鉴定的方法，属于物种鉴定领域。所述方法包括：所述方法包括：根据公式：

Description

一种品种间分子差异鉴定的方法
技术领域
本发明涉及品种鉴定领域，特别涉及一种品种间分子差异鉴定的方法。
背景技术
植物新品种指具有特异性、一致性和稳定性的植物群体，其中，特异性指至少有一个性状与其它品种不同，一致性是指在同一品种内植物具有相同的性状，稳定性指品种在遗传与繁殖过程中，保持性状不变。植物新品种在判断时以性状为判断依据，因而，在判定新品种时，性状测试是品种鉴定的金标准。然而，性状测试的周期较长，不利于品种权的及时授权与品种权案件的及时判决。分子标记可快速鉴定品种，弥补性状测试的缺陷。通过全面比对两个品种在基因组上的每个分子标记位点，可以准确评估两个品种间的分子差异，但基于成本和运算能力等因素的限制，使得目前的分子标记鉴定品种的国家标准与行业标准中都只要求检测基因组上部分分子标记位点(检测位点)，若检测位点中具有差异基因型的标记位点(观察到的差异位点)的数量低于国家标准与行业标准中规定的阈值标准，则判定为相同或相似品种；否则，判定为不同品种。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
在分子标记在鉴定过程中，由于只检测部分分子标记位点，使得在检测时存在抽样误差，而现有的检测方法中并没有对检测结果的抽样误差与准确性进行评价，这使得分子标记的鉴定结果缺乏可靠性评估，影响了其在品种授权、法院判决与市场执法中的权威性与结论的可应用性。
发明内容
为了解决现有技术中分别标记结果的可靠性评估问题，本发明实施例提供了一种品种间分子差异鉴定的方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种品种间分子差异鉴定的方法，所述方法包括：根据公式：
Figure GDA0003190197660000021
计算品种A与品种B为相同品种的概率P，其中，N为检测位点的数目，指在鉴定所述品种A与所述品种B中，采用的分子标记的鉴定标准中规定的需要检测的分子标记位点的数目；x为观察到的差异位点的数目，指在所述检测位点中具有差异基因型的标记位点，且x观察；n为阈值标准，指所述分子标记的鉴定标准中规定的划分相同品种和不同品种的所述观察到的差异位点的数目，且n阈值；t为期望的所述差异位点的数目，指排除了所述检测位点在基因组上的抽样误差后，所述品种A与所述品种B间真实的所述差异位点的数目；
若接受所述品种A与所述品种B为相同品种的概率保障为1-α，那么：
当P≥1-α时，则判定所述品种A与所述品种B为相同品种或近似品种；
当P≤α时，则判定所述品种A与所述品种B为不同品种。
具体地，根据公式
Figure GDA0003190197660000022
计算t值，其中，M为共同检出位点的数目，即所述品种A与所述品种B中均成功获得了基因分型的检测位点的数目，m为M个所述共同检出位点中，观察到的所述差异位点的数目。
具体地，通过AmpSeq-SSR获得所述检测位点。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的方法，根据公式
Figure GDA0003190197660000023
可以计算两个品种为相同品种的概率，从而克服了现有的品种分子标记鉴定标准中，品种鉴定结论无概率保障的问题，辅助品种分子鉴定标准在品种权授权、品种打假与维权以及品种权案件中法院判决。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供了一种品种间分子差异鉴定的方法，该方法包括：根据公式：
Figure GDA0003190197660000024
计算品种A与品种B为相同品种的概率P，其中，N为检测位点的数目，指在鉴定品种A与品种B中，采用的分子标记的鉴定标准中规定的需要检测的分子标记位点的数目；x为观察到的差异位点的数目，指在检测位点中具有差异基因型的标记位点，且x≤N；n为阈值标准，指分子标记的鉴定标准中规定的划分相同品种和不同品种的观察到的差异位点的数目，且n≤N；t为期望的差异位点的数目，指排除了检测位点在基因组上的抽样误差后，品种A与品种B间真实的差异位点的数目；
若接受品种A与品种B为相同品种的概率保障为1-α，那么：
当P≥1-α时，则判定品种A与品种B为相同品种或近似品种；
当P≤α时，则判定品种A与品种B为不同品种。
当α＜P＜1-α时，则无法准确判定所述品种A与所述品种B之间的关系。这是因为判定品种A与品种B之间的关系的概率保障P的值都没有达到阈值，因此没有把握准确判定。
下面简单介绍一下概率P的原理，具体如下：
根据品种分子鉴定的行业标准或国家标准，若x＜n，则判定品种A和品种B为相似或相同品种，否则，品种A和品种B为不同品种。品种A和品种B为相同品种的概率为P＝∑0≤t＜n P(t|x)，其中，P(t|x)为观察到的差异位点的数目为x的条件下，期望的差异位点的数目为t的条件概率。那么，根据贝叶斯公式，
Figure GDA0003190197660000031
其中，x服从于实验次数为N且发生概率为
Figure GDA0003190197660000032
的二项分布，即
Figure GDA0003190197660000033
因而，按二项分布的展开式，那么，
Figure GDA0003190197660000034
这里，设定t值服从均匀分布，理由如下：差异大的品种可以根据性状直接判定为不同品种，大多数情况下不需要利用分子标准进行鉴定。也就是说，多数情况下，利用分子标准鉴定的品种差异不大，期望的差异位点的数目t值接近于相同品种和不同品种的阈值标准n，且t值与n值之间的差值大小接近随机事件，这导致t值的分布服从于以n为平均值的平缓的正态分布，由此，可用t值的均匀分布代替正态分布。根据公式(1)，利用均匀分布代替正态分布，α＜P＜1-α的可能性略有增加，而P≥α和P≤1-α的可能性略有减少。也就是说，当品种间差异不大时，使用均匀分布，鉴定结论不明确的情况略有增加，但给出的明确的鉴定结论更加可靠。当品种间差异明显时，t值与n值之间的差值较大，根据公式(1)计算的P值与α值之间的差值大。此时，t值服从于均匀分布的设定会缩小P值与α值之间的差值，但由于t值与n值之间的差值较大，基本不会影响品种分子鉴定结论的正确率。事实上，后面的验证实验表明：差异大的品种间的关系判定全部得到了验证，表明均匀分布的假定基本不会影响差异大的品种间关系判定的准确率。总之，设定t值服从于均匀分布，确保了鉴定结论的准确性。
当t值服从于均匀分布时，
Figure GDA0003190197660000041
在水稻品种间分子标记的鉴定标准(标准号：NY/T 1433-2014)中，规定的检测位点N＝48个，阈值标准n＝2。为验证本发明实施例提供的方法是否正确，共选择了8个水稻品种，利用AmpSeq-SSR(超高通多重PCR标记)的方法为每个水稻品种分别鉴定了3205个分子标记检测位点，品种的具体名称、SSR位点选取、检测方法与检测结果见Li L,Fang Z,ZhouJ,Chen H,Hu Z,Gao L,et al.An accurate and efficient method for large-scaleSSR genotyping and applications.Nucleic Acids Res.2017；45(10):e88.Epub 2017/02/12。3205个分子标记检测位点的抽样量较大，因此，在没有抽样误差时，两个水稻品种间的期望的差异位点的数目t可以近似估计为
Figure GDA0003190197660000042
其中，M为共同检出位点的数目，即品种A与品种B中均成功获得了基因分型的检测位点的数目，m为共同检出位点中，观察到的差异位点的数目。根据水稻分子标记的鉴定标准，n＝2，t＜n品种A与品种B为相同或相似品种，否则为不同品种。
从两个品种共同检测位点中随机抽取N＝48个检测位点，获得每次抽样中观察到的差异位点的数目，即x值。根据公式(2)计算P值，并与设定的1-α的值比较，判定两品种是否为相同或相似品种，并验证判定结论是否正确。
按上述方法，这8个水稻品种两两进行组合，共有28种组合方式，并对每种组合方式中的3205个分子标记的分型结果进行了10000次N＝48个检测位点的随机抽样，每一次随机抽样相当于利用水稻分子标记鉴定的行业标准(标准号：NY/T 1433-2014)对每一对品种进行一次鉴定。利用公式(2)所示的概率模型，根据每次随机抽样结果判定品种组合间的关系，并验证判定结论的正确性，验证结果列于表1。
表1 品种间关系鉴定结论与结论的验证
Figure GDA0003190197660000051
Figure GDA0003190197660000061
1根据水稻品种行业标准和期望的差异位点数t的值判定。
从表1可以看出：每个品种组合有4295至10000(42.95％-100％)次随机抽样，在1-α＝0.95的概率保障下，明确判定表1中的水稻品种均为不同品种，品种间关系落入了绿区。把表1中的t值与水稻分子标记鉴定的行业标准(标准号：NY/T 1433-2014)中的判定阈值n＝2比较，获得每一对品种组合间关系的参考值。品种组合间关系的参考值与判定结论比较表明，所有(100％)判定结论均是正确的，表明我们发明的植物品种鉴定新方法的准确率高。
2017年8月3日，根据西瓜品种“美丰”与“欣美”间观察到的差异位点的数目x＝7个，合肥市中级人民法院判决“美丰”与“欣美”间不构成品种权侵权；根据“美丰”与“辉煌818煌之间、“美丰”与“兴隆188隆之间观察到的差异位点的数目x均为0个，判决它们之间构成品种权侵权。但败诉方认为西瓜分子鉴定标准(标准号：NY/T 2472-2013)只检测了N＝28个位点，质疑判决的可靠性，案件判决与争议见http://mp.weixin.qq.com/s/TQMdQBvYL-9P-HPEndT-oA。
在西瓜分子鉴定标准中，相同品种与不同品种的阈值标准n＝3，根据公式(2)，当x＝7时，为相同品种的概率P＝2.49×10-3≤α＝0.05。因此，“美丰”与“欣美”在0.95的概率保障为不同品种，不构成侵权的判决是可靠的。当x＝0时，P＝0.96≥1-α＝0.95，因此，“美丰”与“辉煌818煌，“美丰”与“兴隆188隆在0.95的概率保障下为相同品种或相似品种，构成侵权判决也是可靠的。因此，败诉方质疑的理由并不充分。
本发明实施例提供的方法，可以计算两个品种为相同品种的概率，从而克服了现有的品种分子标记鉴定标准中，品种鉴定结论无概率保障的问题，辅助品种分子鉴定标准在品种权授权、品种打假与维权以及品种权案件中法院判决。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种品种间分子差异鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括：根据公式：
Figure FDA0003190197650000011
计算品种A与品种B为相同品种的概率P，其中，N为检测位点的数目，指在鉴定所述品种A与所述品种B中，采用的分子标记的鉴定标准中规定的需要检测的分子标记位点的数目；x为观察到的差异位点的数目，指在所述检测位点中具有差异基因型的标记位点，且x≤N；n为阈值标准，指所述分子标记的鉴定标准中规定的划分相同品种和不同品种的所述观察到的差异位点的数目，且n≤N；t为期望的所述差异位点的数目，指排除了所述检测位点在基因组上的抽样误差后，所述品种A与所述品种B间真实的所述差异位点的数目；
若接受所述品种A与所述品种B为相同品种的概率保障为1-α，那么：
当P≥1-α时，则判定所述品种A与所述品种B为相同品种或近似品种；
当P≤α时，则判定所述品种A与所述品种B为不同品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当α＜P＜1-α时，则无法准确判定所述品种A与所述品种B之间的关系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据公式
Figure FDA0003190197650000012
计算t值，其中，M为共同检出位点的数目，即所述品种A与所述品种B中均成功获得了基因分型的检测位点的数目，m为所述共同检出位点中，观察到的所述差异位点的数目。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过AmpSeq-SSR获得所述检测位点。
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