CN108368152A

CN108368152A - 固相肽合成中的改进

Info

Publication number: CN108368152A
Application number: CN201680062118.4A
Authority: CN
Inventors: 乔纳森·M·柯林斯
Original assignee: CEM Corp
Current assignee: CEM Corp
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2018-08-03
Also published as: EP3365352A4; EP3365352A1

Abstract

公开了一种在固相肽合成中的脱保护的改进方法。特别地，将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化酸的混合物中，并且在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤。此后，利用真空吸力来降低容器中的环境压力从而在没有任何排出步骤的情况下除去脱保护组合物，并且不会另外不利地影响容器中的剩余的物料或在SPPS循环中的后续步骤中引起问题。

Description

固相肽合成中的改进

技术领域

本发明涉及固相肽合成(“SPPS”)中的改进。

背景技术

肽为连接的氨基酸链，而氨基酸反过来又是大部分生物体的基本结构单元。肽还是蛋白质的前体；即，氨基酸的长复合链。肽和蛋白质对于人类和动物生命是必要的，并且它们驱动、影响或控制各种自然过程。

仅作为一个实例，最近已经鉴定肽在某些癌症中可以“锁定”肿瘤特异性突变并且因此用作肿瘤特异性疫苗(例如，SAMPSON,JH ET AL.An epidermal growth factorreceptor variant III-targeted vaccine is safe and immunogenic in patientswith glioblastoma multiforme.Mol.Cancer Ther.2009；8:2773-2779；Li G,SlDDHARTHAM,WONG AJ.The epidermal growth factor variant III peptide vaccine fortreatment of malignant gliomas.Neurosurg.Clin.N.Am.2010；21:87-93；Li G,WONGAJ.EGF receptor variant III as a target antigen for tumorimmunotherapy.Expert Rev.Vaccines 2008；7:977-985)。

结果，肽和蛋白质的研究以及合成肽和蛋白质的能力在生物科学和医学中具有重大意义。

在概念上，固相合成是相对简单和直接的。将氨基酸通过酸侧的连接基团连接至固相颗粒，并且连接至胺侧的保护基团。将保护基团除去从而使第二酸(并且特别是其酸基)可以偶联至在原酸上的胺基。第二(以及随后的)酸起初也是受保护的，因此通常的顺序为脱保护、偶联、并且重复直至完成期望的肽，其后将完成的肽从固相树脂裂解。

固相肽合成起源于1963年，当时R.B.Merrifield发表了使用固相法合成四酸链(R.B.MERRIFIELD；Solid Phase Peptide Synthesis.I.The Synthesis of aTetrapeptide；J.Am.Chem.Soc,1963,85(14),pp 2149-2154)。

当时，普遍认识到的是有机反应可以以该方式进行，但是认为Merrifield法将难以适应任何实际纯度的较长的肽序列。具体地，认为Merrifield的建议，即在偶联和脱保护步骤之间的分离步骤可以仅通过洗涤来进行并且无需中间体的鉴定，不太可能提供长期的成功。在肽合成中，两个问题是特有的：(1)不需要的副产物的合成；和(2)基于来自前一步骤或循环的未除去的酸的存在，一部分不期望的序列的合成。特别地，新近添加的(“活化的”)酸的残余物在偶联步骤之后倾向于残留，并且因此必须以某种方式除去。

然而，如由CHAN AND WHITE,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis(OxfordUniversity Press 2000)总结的，洗涤步骤提供可接受的纯度，并且这些洗涤步骤和避免详细表征中间体的通用的简化性为SPPS法提供了速度和效率优势(例如，第1页)。

因此，如本领域普遍公知的，SPPS脱保护步骤典型地通过以下来进行：将有机碱添加至受保护的酸中、然后将反应容器排空—SPPS的优势之一为有机化合物可以犹如它们为固体一样处理—然后洗涤脱保护的链。在大多数情况下，洗涤重复五次对于除去可能产生不同的序列或不期望的副产物的任何物质是典型的且令人满意的。然后进行偶联步骤，随后是另一排出步骤和另一重复洗涤，其中再次洗涤五次是典型的。

最近(例如，US 20120041173；其内容全部并入本文以作参考)，已经认识到添加用于下一循环的脱保护碱将清除从前一循环剩余的活化酸，因此减少或省去洗涤循环的次数对于确保纯度和避免不需要的序列是必要的。

插入本领域公知的一点，随着合成更长的肽序列，改进、加速或省去任意SPPS步骤以几何级数变得有利。在这一点上，微波辅助技术在其约十年前引入之后已经在本领域中得到广泛接受(例如，共同转让的美国专利No.7393920，其内容同样地引入本文以供参考)。微波技术已经将循环时间从几小时缩短至几分钟，因此在SPPS中以及在依赖于SPPS的研究或商业中提供了多种优势。

在例如微波辅助固相肽合成等较新的技术可以称为典型或常规的情况下，添加脱保护碱的步骤通常通过以相对低的浓度添加足够体积来进行，这将覆盖反应容器中所排出的树脂和在偶联步骤之后所连接的肽，从而确保发生清除和脱保护反应二者。

然而，这样做造成热减速(thermal slow down)(可以这样说)，因为在室温(例如，25°)下添加所述体积的稀释的有机碱溶液，而偶联步骤刚好已经在升高的温度(其中约90℃的温度是示例性的(虽然不是限制性的))下进行了。如在正常传热情况下所期望的，这降低了容器中的组分的总体温度，然后必须重新加热来达到下一脱保护和偶联循环所需的反应温度。

虽然这些特征仅在最严格的意义上是不利的，但是当SPPS循环中的步骤增强、加速、或仅仅变得不必要时，总体优势始终是存在的。随着肽链长度增加，这样的改进变得越来越有利(并且常规方法变得更不利)。因此，当使用SPPS合成包含10、20、或更多的酸的肽时，在常规有机固相反应(即，只需要几个、或许只有单一固相步骤的那些反应)中无意义的、可成比例地保持的速度优势变得越来越重要。

发明内容

在一方面，本发明为固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化酸的混合物中，并且在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的所述脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤。

在另一方面，本发明为固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括通过在反应容器中合并受保护的氨基酸和液体有机碱使所述受保护的氨基酸脱保护，并且在脱保护步骤期间或之后，利用真空吸力(vacuum pull)来降低所述容器中的环境压力从而在没有任何中间排出步骤的情况下除去所述液体有机碱。

在另一方面，本发明为固相肽合成(SPPS)中的脱保护的方法，其中改进包括在至少约60℃的温度下使受保护的氨基酸脱保护，同时提供使碱蒸发离开反应容器的路径。

在另一方面，本发明为用于微波辅助固相肽合成的系统。在这方面，该系统包括设置为将微波辐射引导至微波谐振腔中的微波源、所述谐振腔中的透微波反应容器、和连接至所述反应容器的真空源。

在另一方面，本发明为固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化酸的混合物中，并且在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的所述脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤，并且此后利用真空吸力来降低容器中的环境压力从而在没有任何排出步骤的情况下除去所述脱保护组合物。

在另一方面，本发明为固相肽合成中的脱保护的方法，其包括如下步骤：将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化氨基酸的混合物中；在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的所述脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤地除去前一循环偶联溶液的体积的至少50％；并且所述偶联溶液至少为30℃。

本发明的上述和其它目的和优势及其实现的方式基于结合附图的以下详细说明将变得更清楚。

附图说明

图1为SPPS合成的常规步骤的示意图。

图2为常规SPPS肽合成的改进的形式的示意图。

图3为本发明的第一实施方案的示意图。

图4为说明本发明的热优势的图。

图5为本发明的第二实施方案的示意图。

图6为用于进行本发明的方法的仪器的示意图。

图7为用于进行本发明的仪器的部分的第二示意图。

具体实施方式

图1为在固相肽合成期间重复的常规循环的示意图并且概括地表示为20。如其中所述，将要添加的下一酸21以受保护的方式添加至在22处示意性地图示的反应容器中。通过在二甲基甲酰胺(DMF)中以约20体积％的浓度添加有机碱来在容器22中进行脱保护步骤23。有用的有机碱包括但不限于哌啶(C₅H₁₁N；CAS No 110-89-4)、吡咯烷(C₄H₉N；CAS No123-75-1)和4-甲基哌啶(C₆H₁₃N；CAS No.626-58-4)。如相关箭头的位置所示，在下一酸之前添加脱保护溶液28。

然后将脱保护溶液排出(步骤24)，其后将洗涤液(例如，甲醇或异丙醇)添加至容器中用于重复进行的洗涤步骤25，五次重复是典型的。然后在第二排出步骤26中除去洗涤溶液，使偶联步骤27发生。然后在第三排出步骤30中除去偶联组合物，随后是第二洗涤步骤31，再次重复五次。

将理解的是，图1是示意性的，并且还有可以添加的关于一个SPPS循环的许多细节，但是图1说明了技术人员足以理解它和本发明的概念。特别地，技术人员已经认识到，图1表示的循环既不是将树脂连接至第一酸的步骤，也不说明将完成的肽从树脂裂解。

图2说明了在背景技术中提及的改进的常规方法并且概括地表示为32。特别地，可以省略最后的洗涤步骤31，这是因为在偶联步骤27之后余下的任何过量的酸将被在下一循环的开始时添加的脱保护溶液(碱)猝灭。显然地，这要求应该在将下一酸21添加至容器22之前添加脱保护溶液。

图3说明了本发明的第一实施方案，其中改进包括将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化酸的混合物中，并且在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤的情况下进行。

在高浓度下使用小体积节省物理空间(仅需要一个小瓶)，避免了制备溶液的需要，并且节省溶剂。该方法还提供热优势(图3)。

在请求保护的发明的示例性形式中，为了该目的，将有机碱用作脱保护组合物，哌啶、吡咯烷酮或4-甲基哌啶是典型的(虽然不一定是排他的)。当然，将理解的是，提供脱保护功能而不另外干扰该方法中的其它步骤、生长中的肽链或仪器的另外的有机碱也将是合适的。

在大多数示例性实施方案中，可以净添加哌啶、吡咯烷或4-甲基哌啶；即作为有机液体并且不在溶液中。在其它情况下，哌啶、吡咯烷或4-甲基哌啶可以作为典型地在DMF中的至少约50体积％的有机碱的高度浓缩的溶液来添加。

作为进一步的优势，高浓度允许以成比例小的体积添加有机碱，基于偶联溶液的体积，约1:20和1:3之间的比例是合适的。当净添加时，可以以基于偶联溶液的体积约1:5的体积比添加哌啶、吡咯烷酮或4-甲基哌啶。在这样的情况下，脱保护溶液的小体积典型地小于2mL，并且通常小于一毫升。在示例性情况下，将约0.4和1.0mL之间的哌啶添加至偶联溶液、生长中的肽链和任何过量的活化酸的约3.8和4.2mL之间的混合物中。

将比例表示为百分比，脱保护溶液的小体积为偶联溶液、生长中的肽链和任何过量的活化酸的混合物的体积的20％以下。

图4说明了通过本发明提供的热优势，其在各SPPS循环中提供另外的时间优势。如图4所示，根据公知的和相对简单的关系(例如，温度的下降将与所添加的较冷的液体的质量成正比)，如果在约90℃的温度下进行偶联步骤，常规使用室温(例如25℃)洗涤将具有降低容器中的肽和树脂的温度的预期的热效应。因此，当在偶联之后进行洗涤或排出步骤时，将需要一些时间间隔从而使反应组合物回到90°偶联温度。

然而，在本发明中，添加小体积(质量)的浓碱将大幅减轻温度下降的程度，因此使得更容易且更快地使组合物返回至所需的偶联温度。在图4中，常规热曲线由实线34表示，由本发明提供的热曲线由虚线35表示。当然，将理解的是，图4是示意性的，并非按比例绘制，并且是说明性的而不是任何特定混合物的精确的轨迹。

图5说明了本发明的另一方面，其中改进包括：通过在反应容器中合并受保护的氨基酸和液体有机碱使受保护的氨基酸脱保护，然后在脱保护步骤期间或之后利用真空吸力来将容器中的环境压力降低至低于大气压力从而在没有任何中间排出步骤的情况下除去液体有机碱。

通常，并且如可以通过合适的资源确认的，哌啶的沸点约为106℃并且DMF的沸点约为153℃。结果，哌啶的蒸气压在任何给定的温度下将高于DMF的蒸气压。因此，现在已经发现的是，从容器抽适度的真空可以选择性地除去哌啶并且完全避免排出步骤。图5通过示出脱保护步骤23、随后是蒸发步骤36、随后是(除了有机碱以外的液体的)排出步骤、然后是偶联步骤27示意性地说明了这一点。4-甲基哌啶的沸点为123℃，提供类似的优势。

或者表达为，哌啶的蒸气压在25℃下约为4mm Hg，在50℃下约为39mm Hg，并且在60℃下约为55mm Hg。对于吡咯烷，蒸气压在25℃下约为8.4mm Hg并且在60℃下约为102mmHg。因此，将温度升高至60℃大幅促进期望的蒸发。

与液体和蒸气压的公知的原理一致，该方法可以进一步包括通过在容器22中加热合并的受保护的氨基酸和液体有机碱来加速脱保护步骤，然后进一步通过在加热容器内容物的同时抽真空36来加速除去步骤。当使用如本文中(和别处)所述的微波辅助方法，微波辐射可以用于加速脱保护步骤和加速真空除去步骤二者。

在示例性方法中，压力可以降低至低于大气压力、或以温度表示，脱保护步骤可以通过如下进行：将组合物加热至至少约60℃，并且在一些情况下加热至约81℃和99℃之间，其后可以将容器内容物加热至约90°和110°之间从而加速真空除去步骤。在功能上，真空和施加的微波功率应该提供预期的增强的蒸发而不会另外不利地影响容器中的剩余的物料或在SPPS循环中的后续步骤中引起问题。

可以将整个SPPS循环中的这两种改进合并，从而在另一方面，改进包括以下步骤：将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联步骤的任何过量的活化酸的混合物中，并且在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的脱保护组合物的添加之间没有任何中间排出步骤的情况下进行。此后，利用真空吸力来降低容器中的环境压力从而在没有任何排出步骤的情况下除去脱保护组合物。

以该方式合并两种改进通过图1和图5之间的差异来说明并且可以使该循环避免洗涤步骤和两个排出步骤二者。如背景技术中所述，随着更长的肽链的合成，在单个循环中的任何这样的优势将以几何级数倍增。

图6和7为用于进行本文中所述改进系统的选定部分的示意性说明。最基本的，该系统包括设置为将微波辐射引导至微波谐振腔41中的以二极管40示出的微波源，以及作为连接至谐振腔41中的反应容器22的泵42示出的真空源。虽然将微波源以二极管(IMPATT二极管是示例性的)示出，但是磁控管是与速调管一样类似可接受的源，这些物品中的每一个都是本领域技术人员公知的并且可以为了方便、设计或成本的目的根据需要选择，而无需过度的实验。

图6还示出来自源40的微波辐射被典型地引导通过对谐振腔41提供支持的波导43。真空泵42沿着管线44从容器22抽吸并且通常包括在其它方面是常规的(例如，使用液氮的冷阱)且设置在容器和真空泵42之间的阱45。在没有阱45的情况下，真空泵需要能够在仍然如预期那样操作的同时处理蒸发的碱和溶剂。

如图6中示意性地说明的，在示例性实施方案中，谐振腔41可以在由微波源40产生的微波频率下支持单模微波辐射。设置温度探头46(对此，光纤装置是示例性)来读取谐振腔41中的反应容器22的温度。与处理器47(其可以在整个系统的内部或外部)结合，测量的温度可以用于驱动源并且因此以最有利的方式增加、减少或以其他方式调节微波辐射进入谐振腔。

作为进一步的示意性细节，微波源40由概括地表示为50的电源驱动，在优选的实施方案中所述电源可以为美国专利No.6288379中所述的开关电源(和相关的方法)，其内容全部并入本文以作参考。电源和二极管40之间的基本电路同样地在51处示意性地说明。所需类型的基本电路是相关领域的技术人员公知的，不需要在本文中详细地描述，并且可以由技术人员建立和操作而无需过度的实验。

图7示意性地说明了用于进行本发明的方法的系统的几个附加的细节。在图7中，再次将容器表示为22，并且图7进一步说明容器22包括过滤装置52(典型地，由玻璃制成)和喷头53。过滤装置52允许液体从反应容器22排出并且喷头53将组合物输送至反应容器22。其它等效的固定装置可以由技术人员选择而无需过度的实验。

特别地，图7说明了连接至用于示意性目的示为锥形瓶的多个供应瓶55的氮气供应源54。多个计量回路由管线56、57和58示意性地示出并且将氮气供应源连接至供应瓶55；然后将相应的管线60、61和62连接至公用管线63，公用管线63到达喷头53用于向容器22的输送。单独的管线63从源54向容器22中的液体和树脂提供氮气，从而搅拌(鼓泡)容器22的内容物以在脱保护、偶联和裂解反应期间进行适当的混合和循环。

氮气在这些情况下是有帮助的，这是因为它相对便宜、可广泛获得、并且对进行的反应和对仪器或系统中的设备是呈惰性的。因此将理解的是，包括稀有气体的其它惰性气体可以用于该目的，但是在大多数情况下将仅仅是更昂贵并且不是可广泛获得的。在功能意义上，任何会避免在化学上干扰正在进行的反应或仪器的气体都将是合适的。

以与图6的图示一致的方式，氮气供应源和计量回路可以连接至处理器47从而处理器47可以控制其中组合物从容器55向反应容器52分配的方式。虽然没有示出，技术人员将认识到简单的示意性管线连接(64和65)实际上是配管(tubes)(管道(pipes))、阀和用于那些管线的控件的组合；例如，实际上管线64表示管线58中的阀或歧管(用于该管线的控制器)与处理器47之间的连接。相同的关系适用于在氮气供应源54和处理器47之间的管线65。

实验(预先)

材料和方法

试剂

所有Fmoc氨基酸得自Novabiochem(San Diego，CA)并且包含以下侧链保护基团：Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Arg(Pbf)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)和Tyr(tBu)。N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐氮氧化物(N-[(1H-Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminiu m hexafluorophosphate Noxide,HBTU)、N-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)也得自Novabiochem。二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)、可力丁(TMP)、哌啶、哌嗪、三氟乙酸(TFA)、苯硫基甲烷、1,2-乙二硫醇(EDT)和苯酚得自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。二氯甲烷(DCM)、Ν,Ν-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、无水乙醚、乙酸、HPLC级水和HPLC级乙腈得自VWR(West Chester，PA)。

SPHERITIDE^TM树脂：使用SPHERITIDE^TM树脂(CEM Corporation；Matthews，NC；USA)制备三苯甲基接头。SPHERITIDE^TM树脂由与多官能羧酸交联的聚-e-赖氨酸组成。

CEM LIBERTY^TM自动微波肽合成仪

LIBERTY^TM系统(CEM Corporation，Matthews，NC)为能够完全自动合成包括多达12种不同的肽的裂解的连续肽合成仪。LIBERTY^TM系统使用已经广泛地用于有机合成工业的单模微波反应器DISCOVER^TM。LIBERTY^TM合成仪使用标准的30毫升(ml)玻璃烧结的反应容器用于0.025-1.0毫摩尔(mmol)合成。反应容器的特征在于用于输送所有试剂的喷头和用于控制微波功率输送的光纤温度探头。该系统利用多达25种氨基酸的储备溶液和可以执行以下功能的7个试剂端口：主洗涤、二次洗涤、脱保护、封端(capping)、活化剂、活化剂碱和裂解。该系统使用氮气压力用于所有试剂的转移且在合成期间提供惰性环境。氮气鼓泡在脱保护、偶联和裂解反应期间用于混合。该系统使用计量的样品回路用于所有氨基酸、活化剂、活化剂碱和裂解溶液的精确的输送。LIBERTY^TM合成仪由外部的计算机控制，其允许每个循环中的各步骤的完整的控制。

肽合成：VYWTSPFMKLIHEQCNRADG-NH2

在0.152g Spheritide^TM树脂(0.66meq/g替代物)上使用CEM LIBERTY^TM自动微波肽合成仪在各种条件下合成包含全部20个氨基酸的模型肽。使用新鲜的试剂分两个阶段进行脱保护，每次使用(i)在DMF中的80％哌啶或(ii)纯净的哌啶。在各情况下，将0.8mL的哌啶添加至由于前一酸的添加而剩余的4.0mL的偶联溶液中。在50W下30s的初始脱保护(对于常规合成，在0W下5min)之后是在50W下的3-min脱保护(对于常规合成，在0W下15min)，最高温度为80℃。

在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的哌啶的添加之间没有进行排出步骤。

在脱保护之后，通过施加真空将反应容器中的环境压力降低至低于大气压力来除去哌啶。通过在50W下施加微波功率3分钟来增强除去。

在溶解在DMF中的5倍摩尔过量的0.2M Fmoc-保护的氨基酸的存在下用以下各种类型的活化来进行偶联反应：(i)HBTU:DIEA:AA(0.9:2:1)；(ii)HBTU:HOBt:DIEA:AA(0.9:1:2:1)；(iii)PyBOP:DIEA:AA(0.9:2:1)；(iv)HBTU:NMM:AA(0.9:2:1)；和(v)HBTU:TMP:AA(0.9:2:l)，缬氨酸的双偶联。偶联反应在40W下进行5min(对于常规合成，在0W下30min)，最高温度为80℃。在后续实验中，将半胱氨酸和组氨酸的偶联条件改变为在0W下2min、随后在40W下4min，最高温度为50℃。裂解使用10mL的试剂K(TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT；82.5/5/5/5/2.5)进行180min。裂解后，将肽沉淀出来并且使用冰冷的无水乙醚洗涤。

肽分析

在LC-MS分析之前，将所有肽溶解在10％乙酸溶液中并且冻干。肽产物的分析HPLC使用Waters Atlantis dC18柱(3μm，2.1×100mm)在214nm下进行。以0.5mL/min的流速在60min内通过5-60％溶剂B(溶剂A＝在水中的0.05％TFA；溶剂B＝在乙腈中的0.025％TFA)的梯度洗脱来实现分离。使用具有电喷雾离子化的LCQ Advantage离子阱质谱仪(ThermoElectron，San Jose，CA)进行质量分析。由C.A.T.GmbH&Co.(Tuebingen,Germany)使用涉及肽在6N DCl/D2O中的水解的发表的GC-MS方法(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,ERHAED GROSS编辑)进行氨基酸的外消旋化分析。

在另一实施方案中，本发明提出一种新方法，其中偶联和脱保护步骤在相同的溶剂内发生。在该方法中，将浓碱在发生偶联所需的时间段之后直接添加至树脂偶联溶液中。然后在添加碱时立即开始脱保护步骤。因此，脱保护步骤的开始紧接在偶联步骤之后而没有任何时间延迟。此外，由于其可以使用来自偶联反应的溶剂，因此仅需要小体积的碱。这要求以非常小的体积(0.5mL)准确快速输送的碱用精密试剂输送系统。典型地，在溶剂中的碱(哌啶)的20％溶液用于脱保护步骤。过量的碱浓缩物可以增加碱催化的副反应并且因此需要大量的溶剂。这意味着通过将浓碱添加至偶联溶剂中可以从该方法节省大量的溶剂。

为了证明该新方法的有效性，使用改造成在各循环期间进行原位溶剂回收步骤的自动肽合成仪来组装一批24个肽。

材料和方法

使用允许自动原位溶剂回收和基于蒸发的洗涤的Liberty Blue PRIME系统(CEMCorporation；Matthews，NC；USA)合成所有肽。使用CarboMAX^TM，联合90℃下基于AA/DIC/Oxyma(1:2:1)的活化100sec，用10当量的氨基酸在0.05mmol的规模下合成肽。在用DIEA在90℃下非活化加载第一氨基酸5min的情况下，基于技术的ProTide树脂(CEMCorporation；Matthews，NC；USA)用于使用Rink酰胺接头或Cl-TCP(Cl)接头的合成。脱保护步骤在95℃下进行50sec并且通过将0.5mL的50％吡咯烷直接添加至偶联溶液中来引发。在脱保护和偶联步骤之间使用一次l×4mL洗涤。将肽使用RAZOR裂解系统(CEM Corporation；Matthews，NC；USA)在38℃下用TFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)裂解30min。

结果和讨论：

表1中合成的所有肽给出期望的目标作为主峰，标准循环时间为2分钟和58秒。原位溶剂回收过程允许在偶联步骤结束时添加0.5mL的浓吡咯烷(BP87℃)溶液(没有排出)。该设置的优势在于，由于偶联溶液已经处在90℃下，因此在非常接近期望的温度(95℃)下立即进行脱保护。在脱保护过程期间，施加真空并且将吡咯烷蒸发并随后在废物容器中冷凝。这使得在脱保护步骤结束时仅需要一次洗涤步骤(l×4mL)。

表1 24个肽的自动连续批量合成

整个批次的总合成时间：32.6小时

该新方法由以下方面提供标准循环时间(2分钟57秒)的显著的缩短：(a)省去偶联排出时间、(b)省去步骤之间的脱保护输送时间、和(c)省去用于脱保护步骤的升温时间由此允许使用更短的脱保护时间。此外，在各循环期间完全省去脱保护溶剂的情况下，可以节省大量的溶剂。

在附图和说明书中，已经阐述了本发明的优选的实施方案，并且虽然已经采用了特定的术语，但是它们仅在一般性和描述性的意义上使用并且不用于限制的目的，本发明的范围在权利要求中限定。

Claims

1.一种固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括：

将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化酸的混合物中；并且

在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的所述脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在添加所述脱保护组合物的步骤之后将下一次的酸添加至所述偶联溶液和所述生长中的肽链的混合物中。

3.根据权利要求1所述的方法，其包括添加有机碱作为所述脱保护组合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其包括添加选自由哌啶、吡咯烷酮和4-甲基哌啶组成的组的有机碱。

5.根据权利要求4所述的方法，其包括净添加所述有机碱。

6.根据权利要求3所述的方法，其包括基于所述偶联溶液的体积以约1:20和1:3之间的比例添加作为净添加至偶联溶液混合物的液体的有机碱。

7.根据权利要求6所述的方法，其包括基于所述偶联溶液的体积以约1:5的体积比添加选自由哌啶、吡咯烷酮和4-甲基哌啶组成的组的有机碱。

8.根据权利要求1所述的方法，其中脱保护溶液的高浓度为至少50体积％的脱保护组合物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中脱保护溶液的小体积为小于2mL。

10.根据权利要求1所述的方法，其中脱保护溶液的小体积为小于1mL。

11.根据权利要求1所述的方法，其中脱保护溶液的小体积为约0.4和1.0mL之间，添加至所述偶联溶液、所述生长中的肽链和任何过量的活化酸的混合物约3.8和4.2mL之间。

12.根据权利要求1所述的方法，其中脱保护溶液的小体积为所述偶联溶液、所述生长中的肽链和任何过量的活化酸的混合物的体积的20％以下。

13.一种固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括：

通过在反应容器中合并受保护的氨基酸和液体有机碱而使所述受保护的氨基酸脱保护；和

在脱保护步骤期间或之后，利用真空吸力来降低所述容器中的环境压力从而在没有任何中间排出步骤的情况下除去所述液体有机碱；并且

不会另外不利地影响所述容器中的剩余的物料或在SPPS循环中的后续步骤中引起问题。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括：

通过加热所述容器中的合并的受保护的氨基酸和液体有机碱来加速所述脱保护步骤；和

通过在加热容器内容物的同时抽真空来加速除去步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其包括：

施加微波辐射从而使所述脱保护步骤加热；和

施加微波辐射从而加速真空除去步骤。

16.根据权利要求13所述的方法，其包括将所述容器中的压力降低至低于一个大气压。

17.根据权利要求14所述的方法，其包括：

将所述合并的受保护的酸和液体有机碱加热至约81℃和99℃之间从而加速所述脱保护步骤；和

将所述容器内容物加热至约90℃和110℃之间从而加速所述除去步骤。

18.一种用于微波辅助固相肽合成的系统，其包括：

设置为将微波辐射引导至微波谐振腔中的微波源；

所述谐振腔中的透微波反应容器；和

连接至所述反应容器的真空源。

19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括在所述反应容器和所述真空源之间的阱。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述谐振腔可以在由所述微波源产生的微波频率下支持单模微波辐射。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述反应容器包括：

用于从所述反应容器排出液体的(玻璃)过滤装置；和

用于向所述反应容器输送试剂的喷头。

22.根据权利要求18所述的系统，其进一步包括设置为读取所述谐振腔中的所述反应容器的温度的光纤温度探头(用于控制输送至所述反应容器的微波功率)。

23.根据权利要求21所述的系统，其引入氮气压力，从而转移所有试剂且在肽合成期间提供惰性环境。

24.根据权利要求23所述的系统，其进一步包括与所述反应容器连通的氮源，从而在脱保护、偶联和裂解反应期间使所述反应容器的内容物鼓泡来用于混合。

25.根据权利要求18所述的系统，其进一步包括用于控制在所述系统中进行的每个SPPS循环中的每个步骤的处理器。

26.一种固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括：

在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的所述脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤；并且

此后利用真空吸力来降低容器中的环境压力从而在没有任何排出步骤的情况下除去所述脱保护组合物；并且

27.一种固相肽合成(SPPS)中的脱保护的方法，其中改进包括在至少约60℃的温度下使受保护的氨基酸脱保护，同时提供使碱蒸发离开反应容器的路径。

28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括在低于大气压力的减压下进行脱保护步骤。

29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包括在SPPS循环中的脱保护和偶联步骤之间最多进行一次洗涤步骤。

30.一种固相肽合成中的脱保护的方法，其中改进包括：

将高浓度和小体积的脱保护组合物添加至偶联溶液、生长中的肽链和来自在前的偶联循环的任何过量的活化氨基酸的混合物中；并且

在前一循环的偶联步骤和用于连续循环的所述脱保护组合物的添加之间没有任何排出步骤地除去前一循环偶联溶液的体积的至少50％；并且

所述偶联溶液至少为30℃。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述脱保护浓缩物为有机碱。

32.根据权利要求30所述的方法，其使用Fmoc固相肽化学。

33.根据权利要求30所述的方法，其中脱保护溶液的浓度至少为50体积％。

34.根据权利要求30所述的方法，其中所述脱保护组合物小于所述偶联溶液的体积的1/3。