CN108367094B

CN108367094B - 肽组合物

Info

Publication number: CN108367094B
Application number: CN201580085228.8A
Authority: CN
Inventors: 菅沼雄也; 小塩达也; 横井秀典
Original assignee: Mikron Corp
Current assignee: Mikron Corp
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2035-12-10
Also published as: NZ743237A; RU2018124983A3; EP3388089A4; KR20180085014A; JP6134081B1; EP3388089A1; RU2018124983A; US10702606B2; WO2017098627A1; RU2740185C2; CN108367094A; AU2015416589A1; AU2015416589B2; US20180344861A1; EP3388089B1; HK1257745A1; KR102429287B1; JPWO2017098627A1

Abstract

本发明提供能够同时实现优异的保存稳定性和透明性的肽组合物。本发明的肽组合物是配合自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水而成的，pH为4.5～6.6。

Description

肽组合物

技术领域

本发明涉及一种肽组合物。

背景技术

近年来肽组合物用于各种用途。例如，已知使用了具有自组装能力的肽的肽凝胶，由于该肽凝胶具有优异的力学强度和透明性，因此用于各种用途(例如，专利文献1)。

肽组合物为了调节为对应用途的pH，有时包含缓冲剂。例如，公开了在制备用于心脏组织的保护和再生的组合物时，为了设为生理学上可接受的pH而可以使用可接受的缓冲液(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4620804号

专利文献2：日本专利第5558104号

发明内容

然而，本发明人经过研究知道了以往的肽组合物有时在保存稳定性上存在问题。具体而言，在对使用碳酸钠等缓冲剂调节了pH的肽组合物进行保存时，有时pH经时地变化。此外，在包含C末端羧基被酰胺化的肽的肽组合物中，随着该pH变化有时发生该酰胺基的水解，当C末端的氨基酸残基为碱性氨基酸残基时，其倾向大。

上述酰胺基可以作为肽的C末端的保护基团而发挥作用。在保存过程中，当作为保护基团的酰胺基脱离而分解为羧基时，破坏肽的期望的特性。另外，通过分解而产生的副产物成为杂质，还可能降低品质。此外，肽所包含的酰胺基从生理活性的体现和具有特定结构的分子集合体的形成的观点上考虑也是重要的官能团。特别是关于具有自组装能力的肽(以下称为自组装肽)，是对于分子集合体的形成、即自组装能力重要的官能团。由于肽分子内的电荷的数量或配置与自组装能力相关，因此例如通过C末端的酰胺基变化为其他官能团(例如，羧基)，从而能够影响自组装能力。具体而言，即使是相同序列的自组装肽，当C末端为酰胺基的情况下，可能得到透明的肽组合物，而当C末端为羧酸的情况下，可能破坏组合物的透明性。

本发明是为了解决上述课题而完成的，其目的在于，提供一种能够同时实现优异的保存稳定性和肽组合物的期望的特性(例如，透明性)的肽组合物。

根据本发明，能够提供一种肽组合物。该肽组合物是配合自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水而成的，pH为4.5～6.6。

在一个实施方式中，在上述肽组合物中，上述自组装肽所包含的氨基酸残基的电荷的总和超过0且+3以下。

在一个实施方式中，上述自组装肽的C末端为酰胺基。

在一个实施方式中，上述自组装肽的C末端的氨基酸为碱性氨基酸。

在一个实施方式中，上述缓冲剂为组氨酸、硝酸硫胺、吡啶、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、乙二胺和/或N-甲基吗啉。

在一个实施方式中，上述缓冲剂的浓度为1mM～100mM。

在一个实施方式中，上述肽组合物的可见光透射率为70％以上。

根据本发明的另一方面，可以提供一种上述肽组合物的制造方法。该制造方法包括将自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水进行搅拌。

本发明的肽组合物是配合自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水而成的，pH为4.5～6.6。本发明的肽组合物能够同时实现优异的保存稳定性和期望的特性(例如，透明性)。因此，本发明的肽组合物即使在保存了一定时间的情况下也能够维持品质，并且能够适当地用于各种用途。

虽然得到上述效果的理由不明确，但推测如下。即，在以往的肽组合物中，在保存期间，由气化等原因缓冲剂的含量逐渐减少而弱化缓冲作用。其结果，组合物的pH变化，并且对于pH稳定性小的肽，发生分解(例如，C末端酰胺基的分解)。对此，本发明中，通过选择上述特定的缓冲剂，从而能够抑制经时的pH变化。其结果，能够将组合物的pH控制在不容易发生肽的分解的特定的pH范围。此外，利用上述特定的缓冲剂，例如还能够起到维持自组装肽组合物的期望的特性(例如，透明性)的效果。

另外，在肽组合物中使用容易气化的缓冲剂的情况下，还存在固定的pH下的制备困难，每批都产生波动的课题。通过使用上述缓冲剂，从而肽组合物的pH的控制变得容易，并且也能够抑制肽组合物的每批的品质的波动。

具体实施方式

本发明的肽组合物是配合肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水而成的组合物，其pH为4.5～6.6。通过使用这种缓冲剂，从而能够提供能够同时实现优异的保存稳定性和期望的特性(例如，透明性)的肽组合物。

肽组合物的pH为4.5～6.6，优选为4.6～6.5，更优选为5.0～6.0。通过肽组合物的pH在上述的范围内，从而能够进一步提高肽组合物的保存稳定性。此外，即使被使用的肽在其结构内包含酰胺基的情况下，也能够抑制酰胺基的分解而能够发挥优异的保存稳定性。此外，在使用C末端的氨基酸为碱性氨基酸且C末端为酰胺基的肽的情况下，尤其能够发挥本发明的效果。其原因是，在上述范围以外的pH的情况下，碱性氨基酸的侧链的氮原子参与，可能发生C末端酰胺基的分解反应，并且生成C末端羧酸的肽。

肽组合物的可见光透射率优选在70％以上，更优选在85％以上，进一步优选在90％以上，特别优选在95％以上。只要肽组合物的可见光透射率在上述的范围内，则也能够很好地用于要求透明性的用途。本说明书中，可见光透射率为波长380nm～780nm的光线透射率，例如，通过使用分光光度计(具体而言，Thermo Fisher Scientific社制，制品名：Nano Drop 2000)进行测定。

A.自组装肽

本发明的肽组合物所包含的肽为自组装肽。自组装肽从其特性考虑期待应用于再生医疗和细胞培养等各种领域。本发明的肽组合物中，自组装肽能够良好地维持其自组装性。因此，不仅在保存期间，在应用于期望的用途后也能够保持适当的功能。

在本说明书中，“自组装肽”是指在溶剂中介由肽分子彼此的相互作用而自发性地组装的肽。作为相互作用，没有特别限定，例如，可举出氢键、离子间相互作用、范德华力等静电相互作用、疏水性相互作用等。在自组装肽中，特别优选为介由β折叠结构而自组装的肽。该β折叠结构最具代表性的是具有亲水性相对高的面和亲水性相对低的面。一般情况下，当将自组装肽溶解到水等溶剂中而制备组合物时，通过上述的肽分子彼此的相互作用，组合物成为凝胶的情况较多。关于β折叠结构的形成的确认，例如，可以通过如下方法进行，即通过圆二色测定法测定肽组合物的摩尔椭圆率，并对216nm的摩尔椭圆率成为负值的情况进行确认。此外，还可以使用FT-IR的分析，通过对由于在1620cm^-1附近出现的β折叠而产生的峰、或由于在1690cm^-1附近出现的反平行β折叠而产生的峰进行检测而确认。

本发明中，同时使用自组装肽和缓冲剂。因此，优选具有与肽使用的缓冲剂配对的离子。如后述的那样，作为缓冲剂，优选使用通过对在缓冲剂分子中承担缓冲作用的氮原子的电子对未附加质子的状态(这时上述氮原子的形式电荷为±0)与对上述氮原子的电子对附加了质子的状态(这时上述氮原子的形式电荷为正电荷)的变化而显示出缓冲作用的缓冲剂。因此，优选在对氮的电子对附加了质子的状态下具有配对离子(阴离子)的肽的形态，例如，肽的盐酸盐、肽的三氟乙酸盐、肽的甲磺酸盐等盐(优选与酸(例如，pKa＜3的强酸)形成的盐)的形态。应予说明，还可以将在对氮的电子对附加了质子的状态下具有配对离子的肽和不具有配对离子的肽组合使用。

此外，认为：一般情况下，自组装肽通过与盐组合，从而肽的电荷被由盐生成的电荷(离子)屏蔽，肽分子彼此朝向组装方向。因此，有时为了使肽进一步组装而添加盐。但是在另一方面，由于盐的原因而肽过于接近无序，结果大多情况下还引起肽的凝聚。肽的凝聚能够带来由白色混浊引起的透明性的降低、作为凝胶组合物的机械稳定性的降低(具体而言，变脆、脱水)。对此，本发明中，在肽组合物的pH中，特别优选使用肽所包含的氨基酸残基的电荷的总和成为正的自组装肽。当使用电荷的总和为正的肽的情况下，在与包含一个以上氮原子的缓冲剂进行组合时，组合物中的肽之间维持适度的静电排斥，肽不容易凝聚。缓冲剂也在水中生成电荷，但本发明的组合物具有期望的缓冲作用和透明性，并且对于机械处理的稳定性高，因此即使经过多次的搅拌、混合等处理也能够维持作为凝胶组合物的机械稳定性。

上述自组装肽所包含的氨基酸残基的电荷的总和在该肽所包含的组合物(即，本发明的肽组合物)中，优选为超过0且+3以下，更优选为+1～+3。以此方式，通过组合物中来自该氨基酸残基的侧链的正电荷与负电荷不被抵消，从而保持凝胶形成中适合的静电引力和斥力的平衡，其结果能够形成透明且稳定的凝胶。

上述自组装肽的电荷可以通过PROTEIN CALCULATOR v3.4的网站(http：//protcalc.sourceforge.net/)上可利用的程序进行计算。

本发明中使用的自组装肽优选为C末端具有酰胺基(C末端羧基被酰胺化)。由于酰胺基是电子离域而产生的官能团，因此是比较难分解的稳定的官能团，可以作为保护基团使用。但是，在酸性条件和碱性条件下分解、或者即使在接近中性的pH下也可能产生分解。本发明中，通过使用以下的B项中叙述的pKa为3.5～7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂，并且制成pH4.5～6.6的组合物，从而即使是C末端具有酰胺基的肽，也能够成为保存稳定性优异的肽组合物。

一个实施方式中，自组装肽的C末端的氨基酸优选为精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸，更优选为精氨酸或赖氨酸，进一步优选为精氨酸。当使用C末端的氨基酸为碱性氨基酸且C末端为酰胺基的肽的情况下，碱性氨基酸的侧链的氮原子参与，引起C末端酰胺基的分解反应，可能生成C末端羧酸的肽。因此，在这种肽中特别是保存稳定性可能成为问题，而根据本发明，能够很好地发挥保存稳定性和期望的效果的兼顾效果。

作为自组装肽，例如，可以优选使用日本特开2010-280719号公报中记载的自组装肽。该公报其全部记载作为参考引用到本说明书中。该自组装肽以7位疏水性氨基酸残基为中心，由每隔一个残基在N末端方向和C末端方向在对称的位置具有碱性氨基酸残基(1、5、9和13位)和酸性氨基酸残基(3和11位)的13残基的氨基酸序列组成。即，特征在于，不是交替地具有亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。此外，另一个特征在于，该自组装肽不具有等比例的亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基。此外，另一个特征在于，该自组装肽以7位的疏水性氨基酸残基为中心，在规定的对称的位置具有4个碱性氨基酸残基和2个酸性氨基酸残基，并且N末端和C末端的氨基酸残基均为碱性氨基酸残基。

具体而言，可举出由下述的氨基酸序列组成的自组装肽。

氨基酸序列：a₁b₁c₁b₂a₂b₃db₄a₃b₅c₂b₆a₄

(上述氨基酸序列中，a₁～a₄表示碱性氨基酸残基；b₁～b₆表示非电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，但是，其中的至少5个为疏水性氨基酸残基；c₁和c₂表示酸性氨基酸残基；d表示疏水性氨基酸残基)。

由上述氨基酸序列表示的自组装肽由于能够形成透明性和力学强度优异的凝胶，因此能够很好地用于各种用途。另一方面，如上所述，由于末端具有碱性氨基酸残基，因此有改善保存稳定性的余地。通过使用该自组装肽作为本发明的肽组合物所包含的肽，能够提供保持上述的优异的特性且保存稳定性也优异的肽组合物。

能够很好地用于本发明的自组装肽并不限定于上述例示的肽。作为能够很好地用于本发明的自组装肽的具体例，可以举出包括上述例示的肽在内的以下的肽。

n-RLDLRLALRLDLR-c(序列号1)

n-RLDLRLSLRLDLR-c(序列号2)

n-RLALRLDLRLDLR-c(序列号3)

n-KRLDLNLRLDLRK-c(序列号4)

上述自组装肽可以通过任意的适当的制造方法制造。例如，可举出Fmoc法等固相法或液相法等的化学合成方法、基因重组表达等分子生物学方法。这些制造方法(特别是化学合成方法)可以包括使用酸的纯化工序和/或脱保护工序。在这种制造方法中，由于很难将酸从肽完全去除，因此得到的肽中可能混有极少量的酸，因此溶解到水中时可能示出低于理论值的pH(例如，pH≤4.0)。使用了这种肽的肽组合物通过后述的缓冲剂被调节为期望的pH的同时能够赋予缓冲作用。

构成上述自组装肽的氨基酸可以为L-氨基酸，也可以为D-氨基酸。此外，可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸。从能够以低价格入手，并且肽合成容易的方面考虑，优选为天然氨基酸。

本发明中使用的自组装肽可以为进行了任意的修饰的肽(以下称为修饰肽)。该修饰肽具有肽所期望的特性(例如，自组装能力)，并且在不影响肽组合物的保存稳定性的范围内可以实施任意的修饰。进行修饰的部位可以为肽的N末端氨基，也可以为C末端羧基，还可以为两者。

作为上述修饰，例如，可举出N末端的乙酰化、C末端的酰胺化等保护基团的导入；烷基化、酯化或卤化等官能团的导入；加氢；单糖、二糖、低聚糖、或多糖等糖化合物的导入；脂肪酸、磷脂、或糖脂等脂质化合物的导入；DNA的导入；具有其他生理活性的化合物等的导入。修饰可以只进行1种，也可以组合2种以上进行。例如，可以对肽的N末端进行乙酰化，对C末端进行酰胺化。如上所述，从能够在包含C末端具有酰胺基的自组装肽的肽组合物中很好地获得本发明的效果的方面考虑，可以优选使用C末端导入酰胺基作为保护基团的修饰肽。

上述修饰根据其种类等可以通过任意的适当的方法进行。

构成自组装肽的氨基酸残基数没有特别限定。从很好地发挥自组装能力的观点考虑，该氨基酸残基数优选为2～200，更优选为2～20，进一步优选为6～20，特别优选为12～20，最优选为13～15。

根据目的等，肽组合物的自组装肽的含量可以设定为任意的适当的值。本发明的肽组合物例如以0.01w/w％～10w/w％、优选为0.1w/w％～3.0w/w％、更优选为0.5w/w％～3.0w/w％、进一步优选为0.5w/w％～2.5w/w％、最优选为1.0w/w％～2.0w/w％的浓度包含自组装肽。

B.缓冲剂

在本发明中使用pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂。通过使用这种缓冲剂，能够同时实现肽组合物的保存稳定性和期望的特性(例如，透明性)。其中，使用C末端具有酰胺基的肽作为自组装肽的情况下，能够进一步发挥本发明的效果。酰胺基可以作为肽的C末端的保护基团使用。已知酰胺基在酸性条件和碱性条件下分解。此外，即使在中性条件下也难以完全抑制酰胺基的分解。因此，有时在保存过程中作为保护基团的酰胺基脱离而分解为羧基，影响肽的期望的特性。此外，由分解而产生的副产物成为杂质，也可能降低品质。在本发明的肽组合物中，通过使用pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂，从而能够将肽组合物长时间地维持在能够抑制肽的分解的pH。因此，能够得到可以同时实现保存稳定性和期望的特性的肽组合物。另外，在肽组合物中使用缓冲剂的情况下，由于缓冲剂的气化等原因，难以在固定的pH下进行制备，还存在每批产生波动的课题。本发明中使用的缓冲剂难以因气化等原因而从肽组合物中其含量减少。因此，肽组合物能够维持经时稳定的pH。通过使用上述缓冲剂，从而容易控制肽组合物的pH，并且也能够抑制每批的品质的波动。

缓冲剂的pKa大于等于3.5且小于7.5，优选为3.8～7.2，更优选为4.5～6.5。当缓冲剂的pKa在上述的范围内时，能够同时实现得到的肽组合物的保存稳定性和期望的特性。此外，通过使用这种缓冲剂，从而容易控制肽组合物的pH，也能够防止每批的品质的波动。应予说明，多级解离的缓冲剂具有多个pKa。在使用这种缓冲剂的情况下，使用多个pKa中的至少一个在上述范围内的缓冲剂。pKa的值可以使用任意的适当的测定装置在室温(23℃左右)进行测定，也可以参照文献中记载的值使用。应予说明，本说明书中参照了以下的文献中记载的值；化学便览基礎编II修订3版，社団法人日本化学会编，1984(乙二胺和组氨酸)、泽田清·大森大二郎，缓冲液其原理与选择方法·制作方法，2009(双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷)、日本公定书協会编，医疗用医药品品质信息集No.23，2005(硝酸硫胺)、Brown，H.C.等，in Braude，E.A.and F.C.Nachod，Determination of Organic Structuresby Physical Methods，1955(吡啶)、Hall，H.K.，Jr.J.A.m.Soc.1957，79，5441(N-甲基吗啉)。

上述缓冲剂包含一个以上氮原子。该缓冲剂为碱性缓冲剂，代表性地可以通过弱碱及其共轭酸显示出缓冲作用。换句话说，该缓冲剂可以通过对氮原子的电子对未附加质子的状态(氮原子的形式电荷±0)和对氮原子的电子对附加了质子的状态(氮原子的形式电荷为正电荷)的变化而显示出缓冲作用。此外，通过将该缓冲剂与其盐进行组合，从而能够得到更合适的缓冲作用。应予说明，本说明书中，关于这种缓冲剂，将对氮原子的电子对附加了质子的状态，即，将共轭酸的pKa作为缓冲剂的pKa而处理。通过使用这种缓冲剂，从而能够防止肽的凝聚，能够得到透明性更高的肽组合物。另外，从其他观点考虑，缓冲剂优选为单分子。此外，从其他的观点考虑，优选为不包含磺酸基的物质。

在一个实施方式中，上述缓冲剂为具有一个以上共轭酸的pKa大于等于3.5且小于7.5、优选为3.8～7.2、更优选为4.5～6.5的碱性官能团的化合物。作为该碱性官能团，例如，可举出氨基或含氮杂环。氨基可以为伯氨基(-NH₂)、仲氨基(-NHR)、叔氨基(-NRR’)中的任一种。此外，该化合物中的上述碱性官能团的数量例如可以为4个以下，优选为3个以下。应予说明，该化合物只要不影响本发明的效果的情况下，还可以进一步具有pKa为小于3.5或7.5以上的酸性或碱性官能团。此外，该化合物的分子量例如可以为50～400，优选为60～350。

作为适合本发明的缓冲剂，具体而言，可举出乙二胺(pKa：7.1(25℃))、组氨酸(pKa：6.0(25℃))、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris，pKa：6.5(20℃))、硝酸硫胺(pKa：4.8)、吡啶(pKa：5.2(20℃))、1-甲基咪唑(pKa：7.1)、N-甲基吗啉(pKa：7.4)等(只记载了大于等于3.5且小于7.5的pKa)。其中，优选为组氨酸和/或双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷。根据这些缓冲剂，能够容易地得到生物相容性高的肽组合物。缓冲剂可以只使用1种，也可以组合2种以上使用。

肽组合物中的缓冲剂的浓度只要是肽组合物成为期望的pH的浓度即可。从很好地发挥缓冲作用的观点出发，缓冲剂的浓度优选为1mM～100mM，更优选为5mM～50mM，进一步优选为15mM～50mM，更进一步优选为20mM～50mM，最优选为30mM～50mM。

C.水

作为肽组合物所包含的水，可以使用任意适当的水。例如，可举出蒸留水(例如，注射用水)、去离子水等。

D.添加剂

根据用途等，本发明的肽组合物可以包含除了自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水以外的任意的适合的添加剂。例如，可举出等渗剂；单糖、二糖、低聚糖等糖类等。添加剂可以只添加1种，也可以将2种以上组合而添加。添加剂的浓度可以根据目的、肽组合物的用途等适当地设定。

作为等渗剂，可举出氯化钠、盐化钾、盐化钙、盐化镁等氯化物；葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖；蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖等二糖；甘露糖醇、山梨糖醇等糖醇等。

此外，本发明的肽组合物可以在对上述缓冲剂包含的氮原子的电子对附加了质子的状态下进一步包含具有配对离子的成分。作为这种成分，例如，可举出盐酸、三氟乙酸、甲磺酸等酸(例如，pKa＜3的强酸)和无机化合物或有机化合物的盐(例如，钠盐、除了上述自组装肽以外的肽盐)。

E.肽组合物的制造方法

本发明的肽组合物可以通过任意的适合的制造方法进行制造。该制造方法优选包括将自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水进行搅拌。例如，将自组装肽以成为期望的浓度的方式溶解于水而制备肽水溶液，根据需要进一步添加了任意的适合的添加物后，添加上述缓冲剂使得pH成为4.5～6.6。接着，根据需要将这些用任意的适当的搅拌方法进行搅拌，从而能够得到肽组合物。虽然也取决于肽浓度等，但在一个实施方式中，刚进行上述制备后的肽组合物可能显示出具有流动性的形态(例如，液状或溶胶状的形态)。通过使具有该流动性的形态的肽组合物静置而使自组装肽自组装，从而能够得到失去了流动性的形态(例如，凝胶的形态)的肽组合物。

作为搅拌方法，例如，可以使用螺旋桨、棒、电磁式搅拌器、自转公转式的搅拌装置(还可以并用内部具有凹凸的容器)、超声波均化器、超声波照射器等。应予说明，本说明书中，搅拌包含表示搅拌、搅动、混合、起泡、振动等非静置状态的状态的操作。

此外，将上述缓冲剂溶解到另外的水中而制备缓冲液，也可以用该缓冲液制备肽组合物。另外，还可以将肽、缓冲剂和任意的适当的添加剂投入到水中，然后进行搅拌。投入可以慢慢进行，可以按每个成分进行，也可以进行一次。此外，还可以在肽、缓冲剂和任意的添加剂中投入水，然后将它们进行搅拌。

此外，肽组合物还可以根据需要实施加热处理。在本发明中，通过使用包含氮原子的缓冲剂，从而能够抑制由加热引起的缓冲剂的挥发、分解。因此，得到通过加热的灭菌或杀菌效果，并且即使在加热后也能够将组合物维持在期望的pH，因此对组合物的长期保存特别有利。作为上述加热处理的处理温度，例如为100℃以上，优选为120℃～130℃。此外，作为处理时间，例如为10秒以上，优选为1分钟～30分钟，更优选为15分钟～25分钟。该加热处理可以在加压下进行。作为加热处理的具体例，可举出高压灭菌处理(例如，在121℃、2大气压下处理15分钟～25分钟)。

F.肽组合物的用途

本发明的肽组合物可以同时实现保存稳定性和期望的特性。因此，能够应用于发挥肽组合物具有的特性的各种用途。当本发明的肽组合物包含人工合成的肽的情况下，由于不用担心来自动物的感染症，因此可以优选地用于以人类为对象的用途。作为以人类作为对象的用途的具体例，可举出护肤用品、护发用品等化妆品；用于医药品开发筛选、再生医疗等的细胞培养基材、褥疮制剂、骨填充注入材料、美容整形用注入材料、眼科手术用辅助材料、人工玻璃体、人工晶状体、关节润滑剂、眼药水、药物递送系统(DDS)基材、细胞传递用载体、止血材料、闭塞剤等医药品和医疗设备；润滑用保水剂、干燥剂、用于医疗设备等的涂层剂、液体·气体等的流出防止材料等。

在以往的肽组合物中，通过在包含缓冲剂的状态下进行搅拌，从而有时会有由于凝聚和浑浊而破坏透明性的情况、或无法制备期望的形态的肽组合物(例如，凝胶)的情况。然而，在本发明中解决了这种课题，也能够很好地用于要求透明性等的用途。

本发明的肽组合物的pH为4.5～6.6。肽组合物根据其用途，使用时还可以调节为除了上述范围以外的期望的pH。

此外，本发明的肽组合物通过添加物理性力量或刺激，从而能够暂时性地提高流动性。另外，然后过一段时间后流动性再次降低，并且具有返回到添加物理性的力或刺激前的强度的特征。例如，在使用了日本特开2010-280719号公报中记载的自组装肽的组合物可以具有这种物性。因此，可以很好地用于要求这种特性的用途(例如，经过通过注射器等挤出而被应用的用途)。

下面，虽然通过实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不现定于这些实施例。

[实施例1]

通过液相合成法合成，使用了将N末端乙酰化、将C末端酰胺化的序列号1的自组装肽A([CH₃CO]-RLDLRLALRLDLR-[NH₂])的盐酸盐。

将上述肽A盐酸盐和注射用水(扶桑药品工业株式会社制，商品名：注射用水PL“FUSO”)放入玻璃管(vial)内并搅拌，从而得到了肽水溶液。在得到的肽水溶液中加入了组氨酸(和光纯药工业株式会社制，商品名：L-组氨酸，pKa：6.0)作为缓冲剂。接着，添加注射用水，使得肽浓度成为0.5w/w％、组氨酸浓度成为7mM，进一步搅拌而得到了肽组合物1。得到的组合物的pH为5.52。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[表1]

肽A：用液相合成得到的序列号1的肽(氨基酸序列：Ac-RLDLRLALRLDLR-NH₂)

肽B：用固相合成得到的序列号1的肽(氨基酸序列：Ac-RLDLRLALRLDLR-NH₂)

肽C：用固相合成得到的序列号2的肽(氨基酸序列：Ac-RLDLRLSLRLDLR-NH₂)

肽D：用固相合成得到的序列号3的肽(氨基酸序列：Ac-RLALRLDLRLDLR-NH₂)

肽E：用固相合成得到的序列号4的肽(氨基酸序列：Ac-KRLDLNLRLDLRK-NH₂)

(比较例1)

作为缓冲剂使用了碳酸钠(和光纯药工业株式会社制，商品名：碳酸钠，pKa：6.4)，并且以得到的组合物中的缓冲剂的浓度成为5mM的方式进行制备，除此以外，通过与实施例1相同的方法得到了肽组合物C1。得到的组合物的pH为7.42。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例2]

以肽浓度成为1.5w/w％、组氨酸浓度成为31mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例1相同的方法得到了肽组合物2。得到的组合物的pH为6.14。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例2)

以肽浓度成为1.5w/w％、碳酸钠浓度成为13mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例1相同的方法得到了肽组合物C2。得到的组合物的pH为7.12。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例3]

以肽浓度成为2.5w/w％、组氨酸的浓度成为38mM的方式制备肽水溶液，除此以外，通过与实施例1相同的方法得到了肽组合物3。得到的组合物的pH为5.91。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例3)

以肽浓度成为2.5w/w％、碳酸钠浓度成为23mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例1相同的方法得到了肽组合物C3。得到的组合物的pH为7.65。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例4]

将海藻糖·二水合物以得到的组合物中的浓度成为7w/w％的方式进行添加，从而制备组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物4。得到的组合物的pH为6.06。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例5]

使用硝酸硫胺(关东化学株式会社制，商品名：硫胺素硝酸盐，pKa：4.8)作为缓冲剂，以硝酸硫胺浓度成为38mM的方式制备了组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物5。得到的组合物的pH为5.08。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例6]

使用了吡啶(Nacalai Tesque株式会社制，商品名：吡啶，pKa：5.2)作为缓冲剂，以吡啶浓度成为22mM的方式制备了组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物6。得到的组合物的pH为4.70。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例7]

使用双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(株式会社同仁化学研究所制，商品名：Bis-Tris，pKa：6.5)作为缓冲剂，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物7。得到的组合物的pH为6.51。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例8]

使用乙二胺(关东化学株式会社制，商品名：乙二胺(无水)，pKa：7.1)作为缓冲剂，以乙二胺浓度成为9mM的方式制备了组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物8。得到的组合物的pH为5.85。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例9]

使用N-甲基吗啉(关东化学株式会社制，商品名：N-甲基吗啉，pKa：7.4)作为缓冲剂，以N-甲基吗啉浓度成为17mM的方式制备了组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物9。得到的组合物的pH为6.10。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例4)

使用氨丁三醇(三羟基甲基氨基甲烷)(和光纯药株式会社制，商品名：氨丁三醇“制造专用”，pKa：8.3)作为缓冲剂，以氨丁三醇浓度成为30mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物C4。得到的组合物的pH为8.13。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例10]

使用了通过固相合成法合成且使N末端乙酰化、使C末端酰胺化的作为序列号1的氨基酸序列的自组装肽B([CH₃CO]-RLDLRLALRLDLR-[NH₂])的盐酸盐。

使用了上述肽B的盐酸盐，以组氨酸浓度成为22mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物10。得到的组合物的pH为5.51。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例5)

使用肽B的盐酸盐，并且以碳酸钠浓度成为14mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例2相同的方法得到了肽组合物C5。得到的组合物的pH为6.94。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例11]

使用了通过固相合成法合成且使N末端乙酰化、使C末端酰胺化的作为序列号2的氨基酸序列的自组装肽C([CH₃CO]-RLDLRLSLRLDLR-[NH₂])的盐酸盐。

使用了上述肽C的盐酸盐，并且以组氨酸浓度成为22mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物11。得到的组合物的pH为5.54。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例6)

使用了肽C的盐酸盐，并且以碳酸钠的浓度成为12mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例2相同的方法得到了肽组合物C6。得到的组合物的pH为7.12。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例12]

使用了通过固相合成法合成且使N末端乙酰化、使C末端酰胺化的作为序列号3的氨基酸序列的自组装肽D([CH₃CO]-RLALRLDLRLDLR-[NH₂])的盐酸盐。

使用了肽D的盐酸盐，并且以组氨酸浓度成为22mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例2相同的方法得到了肽组合物12。得到的组合物的pH为5.73。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例7)

使用了肽D的盐酸盐，并且以碳酸钠浓度成为12mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例2相同的方法得到了肽组合物C7。得到的组合物的pH为7.22。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例13]

使用了通过固相合成法合成且使N末端乙酰化、使C末端酰胺化的作为序列号4的氨基酸序列的自组装肽E([CH₃CO]-KRLDLNLRLDLRK-[NH₂])的三氟乙酸盐。

使用了肽E的三氟乙酸盐，并且以组氨酸浓度成为43mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例1相同的方法得到了肽组合物13。得到的组合物的pH为5.51。将得到的肽组合物的组成示于表1。

[实施例14]

使用硝酸硫胺(关东化学株式会社制，商品名：硫胺硝酸盐，pKa：4.8)作为缓冲剂，并且以硝酸硫胺浓度成为5mM的方式制备组合物，除此以外，通过与实施例13相同的方法得到了肽组合物14。得到的组合物的pH为4.56。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例8)

使用了肽E的三氟乙酸盐，并且以碳酸钠浓度成为3mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例1相同的方法得到了肽组合物C8。得到的组合物的pH为7.42。将得到的肽组合物的组成示于表1。

(比较例9)

使用柠檬酸钠(和光纯药工业株式会社制，商品名：柠檬酸钠、pK₁：3.1，pK₂：4.8，pK₃：6.4)作为缓冲剂，以得到的组合物中的缓冲剂的浓度成为20mM、海藻糖·二水合物的浓度成为8w/w％的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例2相同的方法得到了肽组合物C9。将得到的组合物的组成示于表1。

(比较例10)

使用了马来酸(东京化成工业株式会社制，商品名：马来酸，pK₁：1.84，pK₂：5.83)作为缓冲剂，以得到的组合物中的缓冲剂的浓度成为19mM的方式进行制备，使用了氨丁三醇(三羟甲基氨基甲烷)(和光纯药株式会社制，商品名：氨丁三醇“制造专用”，pKa：8.3)作为中和剂，以氨丁三醇浓度成为50mM的方式制备组合物，除此以外，通过与比较例2相同的方法得到了肽组合物C10。将得到的组合物的组成示于表1。

使用得到的肽组合物1～14和C1～C10，进行了以下的保存和测定。将保存条件示于表2，将测定结果示于表3和表4。

[肽组合物的保存]

将各个组合物通过以下的操作进行保存。

将得到的玻璃管内的肽组合物的一半分注于相同种类的新的玻璃管中，各自密封了两个玻璃管。

对于进行了高压灭菌处理(AC处理)的组合物，在121℃、20分钟的条件下进行了灭菌处理。

将2根玻璃管中的1根以表2的条件进行保存。对于在40℃(湿度75％)保管的玻璃管，将玻璃管在恒温恒湿槽LH21-13M(Nagano Science株式会社制)内进行保存，对于在60℃(湿度75％)保管的玻璃管，将玻璃管在恒温恒湿器CSH-210(Tabai Espec株式会社制)内进行保管。

应予说明，对于在40℃保存的玻璃管，将保存天数放大6倍的天数设为实际保存时间(相当于室温保存的时间)，对于在60℃保存的玻璃管，将保存天数放大50倍的天数设为实际保存时间(相当于室温保存时间)。

另一个玻璃管作为保存前样品进行开封，进行了HPLC测定和光线透射率测定。此外，除了需要时以外进行密封，测定后在室温保存。

[pH测定]

使用pH计(株式会社堀场制作所制，制品名：B-712(主体)，S010(传感器))进行测定。

[分解物的含有比例的增加量]

对各个组合物的制备中使用的肽(以下标记为“原料”)和保存后的肽组合物，通过利用HPLC的反向色谱进行分析。此外，对高压灭菌处理后(保存前)的肽组合物也进行了分析。测定条件如下。从下述的测定条件可知，测定条件成为利用肽键的吸光的测定条件，并且在该条件下检测出组合物的肽成分成为峰值。

HPLC：Waters公司制，717自动采样器，515HPLC泵，在线脱气AF，泵控制模块II，2410折射率检测器(用于温度控制而非检测)，柱加热器模块

柱：YMC-Triart C18、3mm×250mm(YMC公司制)

流动相：A液：蒸留水/乙腈/TFA＝750/250/1

B液：蒸留水/乙腈/TFA＝500/500/1

检测器：Waters公司制，996光电二极管阵列检测器

流量：0.4mL/分钟

注入量：10μL

测定的波长范围：190～220nm(结果使用205nm的数据)

分析用试样：包含约120ppm的主成分肽的水溶液

(原料的情况是溶于水中而制备上述肽浓度的水溶液，组合物的情况是通过用水稀释，从而制备上述肽浓度的水溶液作为分析用试样。)

软件：Empower^TM2(Waters公司制)

使用软件计算出检测的峰的面积和面积百分比，作为分析结果。分析结果的面积百分比表示至小数第2位。从分析结果可以掌握，主成分肽(合成对象的肽)、C末端分解物、其他(除了主成分肽与C末端分解物以外)成分的各含有比例(％)。C末端分解物是指，关于主成分肽，C末端的酰胺基分解，C末端成为羧酸的肽。在上述测定条件下，通常情况下，在比主成分肽的峰值稍晚的保持时间检测出C末端分解物。对于组合物中的C末端分解物的含有比例(％)的增加量，通过从保存后(或高压灭菌后)的组合物中的C末端分解物的含有比例(％)减去原料中的C末端分解物的含有比例(％)而计算出。

[可见光透射率]

使用Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific公司制)测定吸光度，基于结果计算出可见光透射率。

[表2]

[表3]

「表4]

实施例1～14的肽组合物在保存了长时间的情况下，也维持了pH和透明性。肽的分解可能在组合物的高压灭菌处理等的制造时和保存期间发生。在实施例1～14的组合物中，即使在组合物的保存后也抑制分解物的生成。在实施例1～5、7、9、11、12的组合物中，即使在组合物的高压灭菌后，也抑制分解物的生成。实施例的肽组合物即使在保存后，C末端分解物的含有比例的增加量为1.4％以下。以此方式，认为实施例中得到的组合物均在组合物可使用的制品的保存期间(例如，3个月～1年)内能够保持肽。

另一方面，可以看出，在比较例的组合物中，保存后的C末端分解物的含有比例增加3％以上，增加了20％左右。另外，在比较例1～4、6、7的肽组合物中，虽然维持了透明性，但即使在组合物的高压灭菌后，分解物的含有比例也增加。此外，比较例9和比较例10的肽组合物的透明性差(比较例9：19％、比较例10：69％)。由于比较例9～10的肽组合物从保存前开始透明性差，因此取消了保存。

此外，对于性状，实施例1～14为透明的凝胶，保存后也维持了透明的凝胶的状态。比较例1～8为透明的凝胶，即使在保存后也维持了透明的凝胶的状态。比较例10为凝胶，比较例9不是凝胶而是液状的组合物。

产业上的可利用性

本发明的肽组合物可以同时实现保存稳定性和期望的特性。因此，能够很好地用于医疗用用途等。

序列表

<110> 株式会社目立康

<120> 肽组合物

<130> MNC14226PCT

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以用于本发明的自组装肽

<400> 1

Arg Leu Asp Leu Arg Leu Ala Leu Arg Leu Asp Leu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以用于本发明的自组装肽

<400> 2

Arg Leu Asp Leu Arg Leu Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以用于本发明的自组装肽

<400> 3

Arg Leu Ala Leu Arg Leu Asp Leu Arg Leu Asp Leu Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可以用于本发明的自组装肽

<400> 4

Lys Arg Leu Asp Leu Asn Leu Arg Leu Asp Leu Arg Lys

1 5 10

Claims

1.一种肽组合物，配合自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水而成，pH为4.5～6.6，

所述自组装肽由以下的氨基酸序列组成，并且所述自组装肽的C末端为酰胺基：

a₁b₁c₁b₂a₂b₃db₄a₃b₅c₂b₆a₄

其中，a₁～a₄表示碱性氨基酸残基；

b₁～b₆表示非电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，但是，其中的至少5个为疏水性氨基酸残基；

c₁和c₂表示酸性氨基酸残基；

d表示疏水性氨基酸残基，

所述自组装肽的C末端的氨基酸为碱性氨基酸，

所述缓冲剂的浓度为15mM～50mM。

2.根据权利要求1所述的肽组合物，其中，在所述肽组合物中，包含在所述自组装肽中的氨基酸残基的电荷的总和为超过0且+3以下。

3.根据权利要求1所述的肽组合物，其中，所述缓冲剂为组氨酸、硝酸硫胺、吡啶、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、乙二胺和/或N-甲基吗啉。

4.根据权利要求1所述的肽组合物，其中，可见光透射率为70％以上。

5.一种权利要求1～4中任一项所述的肽组合物的制造方法，其中，包括将自组装肽、pKa大于等于3.5且小于7.5并包含一个以上氮原子的缓冲剂、以及水进行搅拌，

所述自组装肽的C末端为酰胺基，

所述自组装肽的C末端的氨基酸为碱性氨基酸。