CN108366972B - 包括多硫酸化寡糖和聚阳离子的膜及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括至少一种聚阳离子和至少一种多硫酸化寡糖的纳米膜。本发明还涉及可通过同时或交替溅射至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液获得的纳米膜，以及所述纳米膜在皮肤、皮肤病、伤口或粘膜上的用途。本发明还涉及纳米膜在用于与渗出性伤口接触时释放多硫酸化寡糖的方法中的用途。

Description

包括多硫酸化寡糖和聚阳离子的膜及其制造方法

技术领域

本发明的目的是包括至少一种聚阳离子和至少一种试剂的纳米膜。这种试剂选自具有1-4个糖单元的合成多硫酸化寡糖，它们的盐或它们的复合物。本发明还基于可通过同时或交替溅射至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液获得的纳米膜，和这些纳米膜在皮肤、皮肤病症、伤口或粘膜上的用途。本发明还基于纳米膜在用于与渗出性伤口接触时释放多硫酸化寡糖的方法中的用途。

背景技术

伤口愈合是一个自然的生物过程，人类和动物组织能够通过它们特有的修复和再生过程来修复局部病变。

伤口愈合的速度和质量取决于受损有机体的总体状态、伤口的病因、伤口的状态和位置、和感染的发生与否、以及是否易患愈合问题的遗传因素。

伤口的自然愈合主要发生在三个连续的阶段，每一个阶段的特征在于特定的细胞活性，其使得修复过程按照特定的时间顺序进行：炎症阶段、肉芽阶段(或增殖阶段)和疤痕形成阶段。

第一阶段，即炎症阶段，从血管破裂开始，其触发形成主要由纤维蛋白和纤连蛋白组成且将构成临时基质的血块(血液凝集)。这种基质部分填补了病变，并能够使募集的炎症细胞在受损区域内迁移，以确保伤口的去污清洁。存在的血小板还会释放能够募集愈合细胞的因子(例如，细胞因子、生长因子)，所述愈合细胞例如是炎症细胞(多核嗜中性粒细胞和巨噬细胞)、成纤维细胞和内皮细胞。

第二阶段对应于肉芽组织的发展。首先，观察到通过增殖成纤维细胞的损伤定植。然后，血管内皮细胞的迁移将能够使受损组织的新生血管形成或血管生成。在肉芽组织中，成纤维细胞被激活并且分化为具有明显的由肌动蛋白微丝产生的收缩性能的肌成纤维细胞，从而使伤口收缩。这些微丝由一种蛋白质，即α-平滑肌肌动蛋白表达。因而，这些肌成纤维细胞在引起病变愈合的肉芽组织的形成和成熟中起主要作用。在那里，表皮的重建角质细胞发生迁移。

修复过程的第三阶段，疤痕的形成或成熟伴随着肉芽组织的重塑。一部分细胞外基质由蛋白酶(主要是基质金属蛋白酶(MMP)和弹性蛋白酶)引导，并且观察到细胞外基质的逐渐重组。逐渐地，在肉芽组织中占优势的III型胶原被替换为I型胶原(真皮的主要基质组分)。在成熟阶段结束时，成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管细胞开始增殖和/或它们的活性降低。然后，剩余细胞通过细胞凋亡死亡。随着细胞外基质的重塑和剩余细胞的凋亡，炎症状态逐渐降低。这个阶段更长：在约一年后，疤痕被重塑，它不再是红色，不再僵硬，不再导致疼痛并且变平。

多硫酸化寡糖是已知的并用于治疗各种皮肤病，尤其用于治疗伤口。例如，可以列举由Laboratoires Pierre Fabre销售的促进表皮修复的“Cicalfate”系列产品，其含有多硫酸化寡糖，硫糖铝。这些产品以霜剂形式存在。

也可以列举用于治疗伤口的由Laboratoires Urgo销售的“UrgoStart”产品，其含有多硫酸化寡糖，蔗糖八硫酸钾。这些产品以敷料形式存在。蔗糖八硫酸钾包含于脂质胶体基质中。

发明内容

本发明基于以纳米膜形式引入多硫酸化寡糖的新模式，使它们在与皮肤、伤口或粘膜接触时能够释放。

特别地，本发明的目的在于纳米膜，其特征在于，它包括至少一种聚阳离子和至少一种具有1-4个糖单元的多硫酸化寡糖。

本发明的纳米膜可通过溅射至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液获得。

就本发明而言，纳米膜可以理解为膜的厚度为1nm-10μm，优选小于10μm。根据优选的实施方案，本发明的纳米膜厚度为10nm-8μm，更优选为50nm-5μm，还更优选为100nm-1μm。

根据本发明的纳米膜的特征在于，它包括至少一种聚阳离子和至少一种多硫酸化寡糖。

根据本发明的纳米膜可通过同时或交替溅射至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液获得。

本发明的纳米膜在施用于伤口时特别有用。事实上，接触渗出物时，纳米膜迅速溶解，使得能够释放出多硫酸化寡糖。这使得在与渗出物接触时能够立即起作用，因而更快地达到有效剂量。此外，本发明的纳米膜含有用于治疗伤口的最佳量的多硫酸化寡糖，同时限制其制造方法中所用的原材料的量。

本发明的目的还在于提供一种纳米膜在用于与渗出性伤口接触时释放多硫酸化寡糖的方法中的用途，特别地，所述方法包括制备根据本发明的纳米膜的第一步骤和将纳米膜与渗出性伤口接触的第二步骤。

因此，本发明更具体地关注含有聚阳离子和多硫酸化寡糖的纳米膜在治疗渗出性伤口中的用途。事实上，在渗出物存在的情况下，纳米膜溶解并释放它们所含的试剂。

多硫酸化寡糖

用于本发明范围内的寡糖是由通常通过α或β糖苷键相互连接的1-4个糖单元，优选1或2个糖单元形成的合成寡聚体。换言之，单糖、二糖、三糖或四糖，优选单糖或二糖。

对这些多糖的糖单元类型没有特别的限制。优选地，它们是戊糖或己糖。作为单糖的例子，可以列举葡萄糖、半乳糖或甘露糖。作为二糖的例子，可以列举麦芽糖、乳糖、蔗糖或海藻糖。作为三糖的例子，可以列举松三糖。作为四糖的例子，可以列举水苏糖。

优选地，寡糖为二糖，并且还优选为蔗糖。就本申请而言，“多硫酸化寡糖”可以理解为，寡糖中每个糖的至少两个，并且优选全部羟基已经被硫酸盐基团取代。

优选地，用于本申请范围内的多硫酸化寡糖为蔗糖八硫酸盐。

用于本发明范围内的多硫酸化寡糖可以以盐或配合物的形式存在。

作为盐的例子，可以列举碱金属盐，诸如钠盐、钙盐或钾盐；银盐；或氨基酸盐。

作为配合物的例子，可以列举羟基铝配合物。

在本发明范围内，特别优选如下化合物：

-蔗糖八硫酸钾盐(或蔗糖八硫酸钾)；

-蔗糖八硫酸银盐；和

-蔗糖八硫酸盐的羟基铝配合物，通常称为硫糖铝。

特别优选蔗糖八硫酸钾(或KSOS)。它以多电荷分子的形式存在，并且具有基质金属蛋白酶抑制性能。它以带负电的小聚合物链(聚阴离子)的形式存在。

在本发明范围内，相对于纳米膜的重量，多硫酸化寡糖的用量为10重量％-90重量％，优选为30重量％-70重量％。

特别地，在本发明范围内，所用多硫酸化寡糖优选为钾盐。

在本发明范围内所用的多硫酸化寡糖可以以微粉形式或以溶解形式存在。

由于其对成纤维细胞的作用，知道蔗糖八硫酸钾盐在萌芽期用于治疗伤口已有25年。例如，这种作用定义在专利申请EP 230 023、WO 89/05645或WO 98/22114中。如这些文献中所指出的，在对伤口进行辅助去污清洁并因而去除坏死组织和/或纤维蛋白组织后，使用这种化合物(参见EP 230 023、WO 89/05645、WO 98/22114)。因而，它被用于清洁且净化的伤口。

国际专利申请WO 89/05645指出，多硫酸化多糖(诸如硫糖铝)是蛋白酶抑制剂，特别是透明质酸酶，其是能够损害透明质酸和糖胺聚糖的酶。

当前，生物材料的发展趋势之一是面向智能生物制剂材料的生产。为此目的，已经开发了不同的表面处理技术。

聚阳离子

基于聚电解质(或者聚阳离子和聚阴离子)的层层沉积的功能化方式已在20世纪90年代初提出。

可以通过改变几个参数(层数、分子量、聚电解质的浓度和类型、pH值、离子力)来控制获得的纳米膜厚度。他们的兴趣归于生物材料领域，其通过插入蛋白质、肽或药物赋予它们生物功能的可能性。多层膜主要通过两种技术获得：通过在聚电解质溶液中交替浸渍或通过交替或同时溅射这些溶液。这些膜的内聚力主要基于聚阳离子和聚阴离子链的正电荷和负电荷之间，以及聚电解质和小的多电荷分子之间的静电相互作用。

在本发明范围内，纳米膜包括至少一种聚阳离子，即带正电的离子聚合物。

本发明的纳米膜通过将多硫酸化寡糖与大链聚阳离子组合获得。

优选地，所采用的聚阳离子可以选自聚(L-赖氨酸)、壳聚糖、胶原、支化聚(乙烯亚胺)、聚(L-精氨酸)、聚(烯丙胺)(PAH)及它们的混合物；特别是聚(L-赖氨酸)和支化聚(乙烯亚胺)。

这些纳米膜的内聚力基于聚阳离子链的正电荷与多硫酸化寡糖聚阴离子的负电荷之间的静电相互作用。

优选地，相对于纳米膜的重量，这些聚阳离子以10重量％-90重量％，优选30重量％-70重量％的量存在于本发明的纳米膜中。

药学上可接受的环境

特别地，本发明的纳米膜可通过同时或交替溅射(或喷雾)至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液获得。特别地，纳米膜可通过一连串的多次交替溅射聚阳离子溶液的溅射和多硫酸化寡糖溶液的溅射获得。

聚阳离子和多硫酸化寡糖如上文所定义。

特别地，本发明的纳米膜可通过溅射聚阳离子溶液和多硫酸化寡糖溶液1-500个步骤获得，两种溶液同时或交替溅射，优选同时。

实际上，聚阳离子和多硫酸化寡糖溶液的同时溅射尤其能够以相对于交替溅射数量减少的步骤来达到所需厚度。此外，与交替溅射相比，通过同时溅射获得的纳米膜的厚度更容易控制，从而可以再现。因此，交替溅射能够优化插入纳米膜的多硫酸化寡糖的量。

优选地，通过溅射聚阳离子溶液和多硫酸化寡糖溶液5-200个步骤，更优选溅射20-100个步骤获得纳米膜。

特别地，包括聚阳离子或多硫酸化寡糖的液体溶液包括可含有水的药学上可接受的环境。

就本申请而言，药学上可接受的环境意指与聚阳离子和/或多硫酸化寡糖相容的环境。

特别地，水可以以高于70％，优选高于95％的含量存在于包括聚阳离子或多硫酸化寡糖的液体溶液中。

特别地，包括聚阳离子或多硫酸化寡糖的液体溶液可以包括水(即作为药学上可接受的环境)和优选浓度为150mM的氯化钠(NaCl)(“基础盐”)的混合物。

每个溅射步骤可以持续进行1秒-1分钟，优选5秒-10秒。

例如，溅射流量可以为0.1mL/s-1mL/s，优选为0.2mL/s-0.5mL/s。

优选地，在每个溅射步骤之后进行冲洗步骤和/或干燥步骤。

优选地，每个冲洗步骤和每个干燥步骤持续进行1秒-1分钟，优选5秒-10秒。

本发明的纳米膜也可通过在至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液中交替浸渍(滚动/浸入)的方法获得。

聚阳离子和多硫酸化寡糖如上文所定义。

特别地，本发明的纳米膜能够通过在聚阳离子溶液和多硫酸化寡糖溶液中进行1-500个交替浸渍步骤获得。优选地，纳米膜通过在聚阳离子溶液和多硫酸化寡糖溶液中进行5-200个交替浸渍步骤，更优选20-100个交替浸渍步骤获得。

特别地，包括聚阳离子或多硫酸化寡糖的液体溶液包括可含有水的药学上可接受的环境。

特别地，水可以以高于70％，优选高于95％的含量存在于包括聚阳离子或多硫酸化寡糖的液体溶液中。

特别地，包括聚阳离子或多硫酸寡糖的液体溶液可以包括水(即作为药学上可接受的环境)和优选浓度为150mM的氯化钠(NaCl)(“基础盐”)的混合物。

每个浸渍步骤可以持续进行1分钟-15分钟，优选5分钟-10分钟。

优选地，每个浸渍步骤之后进行冲洗步骤和/或干燥步骤。

优选地，每个冲洗步骤持续进行1分钟-15分钟，优选5分钟-10分钟。

优选地，每个干燥步骤持续进行1秒-1分钟，优选5秒-10秒。

本发明的目的还在于合并液体组合物，其特征在于，它包括如上文定义的至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液。

在下述非限制性实施例中更详细地说明本发明。

根据本发明的纳米膜的实施例：

已经使用的聚阳离子是合成来源的，如聚(L-赖氨酸)(多肽)或天然来源的，如胶原蛋白(COL，蛋白质)。

蔗糖八硫酸钾(或KSOS)和聚阳离子已在超纯水中制备(电阻率为18.2MΩ.cm，Milli-Q plus系统，Millipore)。

已经在硅基材(Wafernet INC，USA)上完成了纳米膜的构建，所述硅基材事先使用金刚石刮刀切割成约2×2cm²的矩形。使用前，已用等离子清洁剂(Harrick Plasma，USA)处理基材以去除杂质并使其变得亲水。所用气体为空气中的氧气。

无论系统研究如何，通过以下沉积第一层的聚(乙烯亚胺)(BPEI)：将基材浸入(5分钟)BPEI水溶液中，然后用水冲洗两次(每次1分钟)，并用氮气干燥。该第一层用作有利于纳米膜构成的紧固层。

以下定义通过溅射制备聚阳离子/KSOS纳米膜。使用了包括四个喷枪的溅射装置，其连接到压缩空气入口并且放置在离基材25cm的距离处。

两个喷枪能够溅射溶液中的两种化合物(KSOS和所选的聚阳离子)。另外两个能够进行冲洗和干燥沉积物的步骤。

为了评估溅射化合物的量，在每次处理期间测量溅射流量并且约为0.3mL/s。

在溅射持续时间内，以1000rpm旋转基材，以便获得一致的沉积物。

已经研究了几个参数：

-溅射类型(交替或同时)

-基础盐NaCl浓度(0和150mM)

-聚阳离子类型(合成来源或天然来源)

-溅射的KSOS/聚阳离子比率

为了测量硅基材上连续沉积物的厚度，使用椭圆偏光法。

通过将2×2cm²的基质与20mL的生理环境和模拟伤口的环境接触45分钟来进行纳米膜稳定性测试。

通过稀释含有Ca²⁺和Mg²⁺的10×浓缩的PBS溶液获得的pH水平7.4±0.1的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，PBS)模拟生理环境。

通过5％质量的NaCl和5％质量的CaCl₂二水合物水溶液模拟伤口环境。

根据本发明的实施例1：聚(L-赖氨酸)/KSOS纳米膜

经过25次同时溅射步骤后，获得PLL/KSOS纳米膜。溅射持续时间如下：溅射化合物10秒；冲洗5秒，干燥5秒。

在具有150mM NaCl的水溶液中使用这两种化合物。

在PLL浓度为0.2mg/mL时，通过使KSOS浓度在0.05-12mg/mL变化来获得构建的优化。

在0.2mg/mL的KSOS获得最佳构建。

在开发PLL/KSOS纳米膜之后，已经通过与生理环境接触并且与伤口环境接触测试它们的稳定性。为此，将每个尺寸为2x2cm²的纳米膜与750μL的生理环境或伤口环境接触45分钟，然后用Milli Q水冲洗45分钟。

在与生理环境接触时，PLL/KSOS纳米膜具有低的厚度损失(<10％)，这意味着与生理环境接触时，纳米膜是稳定的。此外，红外光谱显示一小部分KSOS在此接触期间释放：KSOS的1240cm^-1带稍微减少。

但是，在接触伤口环境时，PLL/KSOS纳米膜完全溶解，从而释放所有的KSOS。

根据本发明的实施例2：研究获得聚(L-赖氨酸)/KSOS纳米膜的溅射

在这个例子中，浓度为0.2mg/mL的两种化合物(PLL和KSOS)用于含有150mM基础盐NaCl的水溶液中。

在16次交替或同时溅射步骤后，获得PLL/KSOS纳米膜。

交替溅射的步骤如下进行：先将PLL溶液，然后将KSOS溶液溅射5秒，然后进行冲洗5秒和干燥5秒的步骤。

同时溅射的步骤如下进行：将PLL和KSOS溶液同时溅射5秒，然后进行冲洗5秒和干燥5秒的步骤。

图1显示，在150mM NaCl存在下，根据交替和同时溅射步骤的数量，PLL/KSOS纳米膜的厚度(以nm为单位)的发展。在16次溅射步骤后，PLL/KSOS纳米膜通过同时溅射法达到36nm，并且通过交替溅射法达到10nm。

同时溅射法使得能够以比交替溅射少的步骤获得具有给定厚度的PLL/KSOS纳米膜。实际上，所需要的是3个同时溅射步骤以获得10nm纳米膜，而这需要16个交替溅射步骤。因此，同时溅射法在经济上是有利的(更快并且能够使用更少量的PLL和KSOS)。

此外，同时溅射获得的厚度具有更好的再现性(厚度误差条小于10％厚度)。因此，用同时溅射更容易控制纳米膜的厚度。

此外，在所研究的步骤数量上，交替溅射获得的厚度达到10nm的上限值。这意味着6-16步之间，厚度不再增加。

总之，与交替溅射相比，同时溅射能够更有效地控制插入纳米膜的KSOS量。

根据本发明的实施例3：通过交替浸渍获得的支化聚(乙烯亚胺)(BPEI)/KSOS纳米膜

浓度为0.2mg/mL的两种化合物(PLL和KSOS)用于含有150mM基础盐NaCl的水溶液中。

在20次交替浸渍步骤后，获得BPEI/KSOS纳米膜。浸渍步骤如下进行：将支持物浸入其中一种溶液(BPEI或KSOS)中5分钟，然后进行冲洗(浸入150mM NaCl溶液中)5分钟并干燥5秒钟的步骤。

图2显示，在150mM NaCl存在下，根据交替浸渍步骤的数量，BPEI/KSOS纳米膜的厚度(以nm为单位)的发展。经过20次交替浸渍步骤后，BPEI/KSOS纳米膜达到4.7nm。作为对比，通过交替和同时溅射，BPEI/KSOS纳米膜的厚度达到约15nm。浸渍方法的优点之一是在化合物溶液中使用的体积。事实上，对于20个沉积步骤，交替浸渍中所用的每种化合物的体积为10mL，交替和同时溅射中为30mL。

Claims (14)

1.一种膜，其特征在于，所述膜包括至少一种聚阳离子和至少一种具有1-4个糖单元的多硫酸化寡糖，所述膜的厚度为1nm-10μm，其中所述膜通过同时溅射至少一种聚阳离子溶液和至少一种多硫酸化寡糖溶液获得。

2.根据权利要求1所述的膜，其特征在于，相对于所述膜的重量，所述聚阳离子以10重量％-90重量％的量，并且所述多硫酸化寡糖以10重量％-90重量％的量存在。

3.根据权利要求2所述的膜，其特征在于，相对于所述膜的重量，所述聚阳离子以30重量％-70重量％的量，并且所述多硫酸化寡糖以30重量％-70重量％的量存在。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的膜，其特征在于，所述聚阳离子选自聚L-赖氨酸、壳聚糖、胶原、支化聚乙烯亚胺、聚L-精氨酸、聚烯丙胺及它们的混合物。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的膜，其特征在于，所述聚阳离子选自聚L-赖氨酸和支化聚乙烯亚胺。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的膜，其特征在于，所述多硫酸化寡糖选自蔗糖八硫酸盐。

7.根据权利要求6所述的膜，其特征在于，所述蔗糖八硫酸盐为蔗糖八硫酸钾。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的膜，其特征在于，所述膜的厚度为10nm-8μm。

9.根据权利要求8所述的膜，其特征在于，所述膜的厚度为50nm-5μm。

10.根据权利要求9所述的膜，其特征在于，所述膜的厚度为100nm-1μm。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的膜，其特征在于，所述溅射溶液包括药学上可接受的环境。

12.根据权利要求11所述的膜，其特征在于，所述药学上可接受的环境为水。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的膜在制造用于与渗出性伤口接触时释放多硫酸化寡糖的装置中的用途。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的膜在制造保护皮肤、伤口或粘膜的装置中的用途。

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