JP2008523129A - 二次元及び三次元ポリマー支持体の調製法 - Google Patents

Abstract

薬理学的及び／又は生物学的に活性なタンパク質分子を含有するポリマー支持体の調製方法であって、塩基性物質又は緩衝液によって支持体を中性化する工程と、前記支持体を乾燥させる工程と、既定量の薬理学的及び／又は生物学的に活性なタンパク質分子で支持体を浸潤させる工程とを含む方法。

Description

発明の主題
本発明は、酵素活性を有するタンパク質、特に凝固因子が固定される二次元及び三次元ポリマー支持体を調製するための新規な方法を記載する。これらの支持体は、手術中など、速やかで効果的な止血を要する状況又は内臓への深い創傷もしくは外傷の場合に使用することができる。

発明の背景
手術中又は損傷した臓器もしくは出血しやすい創傷からの出血の止血は、長年にわたり様々な方法で試みられ、部分的な解決法が、適用部位に限局化した速やかな凝固を活性化させることができる因子で富化された種々の材料でできた、いわゆる「フィブリングルー」及び／又はタンポンに見いだされてきた。フィブリングルー（たとえばTisseel VH（登録商標）Baxter）は通常、血流を止めるフィブリン血餅を生じさせることが知られているような適量のフィブリノーゲン及びトロンビンを混合することによって即時調合される。しかし、これらの製品は、広範な区域からの重度の出血を止めるのには適さない。そのような場合、ひとたび支持体が創傷に装着されると凝固過程を活性化させる因子で種々の技術（吸着、浸潤など）によって富化された二次元又は三次元構造を使用することが好ましい。使用される因子は実質的にフィブリノーゲン及びトロンビンであり、これらは、ひとたび適用されると、組み合わさってフィブリン又はトロンビンのみを形成し、それが、創傷中に生理学的に存在するフィブリノーゲンと反応する。支持体を作るために使用される材料は、生体適合性及び生体付着性を特徴となければならず、加工及び取り扱いが容易でなければならず、問題の創傷に装着しなければならない。この目的には天然のポリマーが特に適し（たとえばグリコサミノグリカン、多糖、セルロース、ペクチン酸、アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン）、同じく半合成ポリマー（たとえばセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸の誘導体、ジカルボン酸とで架橋したコラーゲン）又は合成ポリマー（ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー、ポリカプロラクトンを含む）が適している。これらのポリマーはまた、化学的に修飾されていることもできる。たとえば、ヒアルロン酸は、以下のような様々な方法で修飾されている。
・脂肪族、アリール脂肪族、芳香族、環式及び複素環式系のアルコールでのエステル化（HYAFF（登録商標））（ＥＰ２１６４５３Ｂ１）、
・脂肪族、アリール脂肪族、脂環式、芳香族、環式及び複素環式系のアミンでのアミド化（HYADD（商標））（ＥＰ１０９５０６４Ｂ１）、
・Ｎ−アセチル−グルコサミンの部分における脱アセチル化（ＥＰ１３１２７７２Ｂ１）、
・Ｏ−硫酸化（ＥＰ７０２６９９Ｂ１）、
・Ｎ−アセチル−グルコサミン部分の第一級ヒドロキシルの酸化による過カルボキシル化（HYOXX（登録商標））（特許出願ＥＰ１３３９７５３）。

本発明にしたがって使用されるヒアルロン酸は、任意の供給源から、たとえば鶏冠の抽出（ＥＰ１３８５７２）、発酵（ＥＰ７１６６８８）又はバイオテクノロジー経路によって得ることができる。分子量は、４００〜３×１０⁶Da、特に１×１０⁵Da〜１×１０⁶Da、さらに具体的には２００，０００〜７５０，０００Daの範囲であることができる。

ポリマーは、たとえばヒアルロン酸誘導体の場合でＥＰ６１８８１７に記載されているように、様々な形状及びサイズに製造することができる。物理的な止血活性は、これらのポリマーの優れた吸収性のおかげだけで、これらのポリマーに起因するものであり（たとえば、ヒアルロン酸誘導体の止血性がＥＰ９９９８５９で特許請求されている）、この活性は、本発明によって考慮される状況で非常に望ましい。実際に、ヒアルロン酸誘導体によって構成される生体材料中のフィブリノーゲン及びトロンビン両方の存在を活用して（ＵＳ６，５０３，５２７）止血活性を有するタンポンを得ることが可能であることはすでに公知である。トロンビンは凝固カスケードの最終段階における鍵酵素になるため、ここまで述べた止血活性が、変化しないままのトロンビンの活性のおかげであると考えられるであろう。実際に、フィブリノーゲンは、創傷部位で豊富に利用可能であるため、不可欠なものではない。科学技術文献は、トロンビンがpH７、すなわち血液のpHで最大の活性を有し、トロンビンが、それ自体で又はフィブリノーゲンとともに、ポリマーと会合しているとき、この値を可能な限り安定かつ一定に維持しなければならないと報告している。酸性度における大きな変動は、タンパク質構造の変性による酵素活性の減少又は完全な損失を招くおそれがある。現在開発されている止血包帯はすべて実質的に酸性のポリマー支持体を特徴とする。たとえば、ＵＳ６，５０３，５２７に記載されている支持体は、カルボキシ官能基の７５％がエステル化され、残り２５％が遊離状態であり、したがってトロンビンの作用を妨害することができるヒアルロン酸のベンジルエステル（HYAFF（登録商標）11）によって構成されている。そのうえ、コンパクトで生体付着性のコラーゲンパッチ上のトロンビン及びフィブリノーゲンに基づく製品がすでに市販されている（TachoSil（登録商標）Nycomed）。この場合、製品の酸性度のレベルは、出発ポリマーを、凝固因子が付着されるコンパクトな構造に転換するために使用される化学的処理のせいである。これは、製品に対する重大な制限となる。理由は、酵素の活性が、存在するとしても、支持体が創傷に適用されたとき支持体のpHが血液のpH、すなわちpH７に限りなく近い状況で得ることができる活性よりも決定的に劣るからである。本発明は、広範な創面及び／又は深い創傷、内臓への創傷、広範な区域からの失血を伴う手術創に対して止血効果を発揮することができるようにトロンビンで浸潤されるポリマー支持体を調製するための新規な方法によってこの制限を解消する。この方法は、酵素のための支持体として働く二次元又は三次元構造のpHを中性値に維持することによってトロンビンの酵素活性を完全に維持することを可能にする。

発明の詳細な説明
本発明は、二次元又は三次元ポリマー支持体を中性化して、それが、凝固過程を妨害する一つ以上の薬理学的及び／又は生物学的に活性なタンパク質、特に凝固酵素でひとたび富化されると、浅い創傷及び／又は深い創傷、手術創又は内臓への外傷の場合に、最大限の酵素活性の発現をさせることによって止血を誘発するために使用することができるようにする新規な方法に関する。

本発明の方法に適用することができるポリマーとしては、
・天然のポリマー：たとえばグリコサミノグリカン、多糖、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン酸、ゼラチン、コラーゲン、ゲラン、キトサン、
・半合成ポリマー：たとえばセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、アミドの誘導体、ジカルボン酸とで架橋したコラーゲン、アルデヒドなど、
・合成ポリマー、たとえばポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー、ポリカプロラクトン、樹脂、ポリホスファゼン及び／又はそれらの混合物
がある。

本発明の目的に適した材料はまた、化学的に修飾された前記ポリマー（たとえばエステル化、アミド化、Ｏ−硫酸化、脱アセチル化、過カルボキシル化によって化学的に修飾さえたヒアルロン酸）であって、おそらくは互いに会合し、種々の形態及びサイズに作られたもの（フィルム、スポンジ、メッシュ、不織布及び織布、膜及び顆粒）から得ることができる。

先に述べたように、本発明を適用することができるポリマー支持体は、ポリマー及び／又はその誘導体の固有の性質又はポリマーを処理する際に使用される方法に帰すことができる異なる程度の酸性度を特徴とする。酸性度は、止血活性、特にトロンビンの止血活性に対してマイナスの効果を有し、トロンビンは、創傷に適用された場合でも凝固効果を有しなくなる。酸性度を中性化することが、酸性環境に対して感受性である生物学的・薬理学的活性を有する他の分子（たとえば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰのような成長因子）を固定化するために本明細書に記載の支持体が使用される場合を含め、この問題を解決し、今日まで公知の方法の制限を解消する一つの方法である。

したがって、本発明のポリマー支持体は、その代替態様にしたがって、止血用途だけでなく、たとえば上記で挙げたような成長因子を前記ポリマー支持体上に固定化することによって創傷治癒を促進するためにも使用することができる。

本発明の方法は二つの工程を含む。
・塩基性物質（たとえば炭酸水素ナトリウム）又は緩衝液によって支持体を中性化する工程、
・支持体を乾燥させる工程、
・正確に計算した量のトロンビンで支持体を浸潤させる工程。

使用されるポリマーのタイプにしたがって、塩化ナトリウム溶液で支持体を前処理して塩基性溶液の吸収を改善し、それによって媒体のイオン移動度を増し、中性化剤の作用を助長することが必要であるかもしれない。その場合、支持体を乾燥又は凍結乾燥させることが必要であろう。中性化工程は、使用される材料のタイプにしたがって化学量論的量又は計算上の過剰量で加えられる塩基性物質（たとえばＮａＨＣＯ₃）で生成物を処理することによって実施される。化学量論的量が加えられる場合、塩基性物質のための媒体として使用される溶媒は、ポリマーが、直後に加えられるトロンビン溶液を吸収するその能力を維持するよう、正確に計算されなければならない。実際に、トロンビンは通常、凍結乾燥形態又は凍結溶液として供給され、いずれにしても、生成物上に延展させる前に溶液中に溶解する必要がある。低酸性度ポリマーの場合、トロンビンは、支持体の酸性度と対抗するのに十分である緩衝液（たとえばＰＢＳ）に溶解することができる。

計算された過剰量の塩基性物質を加えることによって中性化が達成される場合、ＮａＣｌによる浸潤及び塩基性溶液（たとえばＮａＨＣＯ₃）による中性化は、塩をエタノールと水との比６０：４０の混合物に溶解することによって同時に実施されるべきである。この処理ののち、入念にすすいで過剰量の塩基を除去する。すすぎ溶液は、好ましくは比８０：２０のエタノールと水とで構成されたものである。最後に、エタノールだけで洗浄し、アセトンに数回通したのち乾燥させる。この時点で、選択した生物学的・薬理学的に活性の分子（トロンビン及び／又は他の凝固因子、成長因子など）を含有する溶液で支持体を浸潤させる。

支持体は、ひとたびこの処理を受けるとパッケージングされ、この工程は、支持体の安定性及び無菌性を保証しなければならない。無菌性は、本発明の支持体にとって所期の適用分野の観点できわめて重要である。滅菌は、旧来の方法（γ線、β線、エチレンオキシドを含む）により、使用されるポリマー及び薬理学的・生物学的に活性な分子のタイプにしたがって本発明の方法の異なる処理段階で達成される。より正確には、滅菌は、支持体を中性化する前に実施することもできるし、中性化ののち、薬理学的・生物学的に活性な物質による浸潤の前に実施することもできる。実際に、活性分子は滅菌処理に感受性であることができ、このようにして、活性分子が劣化することを防ぐことが可能である。滅菌ののちも、他の処理を無菌環境で実施しなければならないことを忘れてはならない。必然的に無菌性のすべての工程を最小限にすることが汚染の危険性を減らし、本発明の方法を工業的規模でさらに経済的にする。

ポリマー及び活性分子が許すならば、生成物を処理の一番最後で滅菌することもできる。

本発明は、特に、カルボキシ官能基がベンジルアルコールによって７５〜１００％の範囲の割合、好ましくは８０％エステル化されているヒアルロン酸ベンジルエステル（HYAFF（登録商標）11−p75HE）に基づく二次元又は三次元支持体の中性化法に関するが、本発明の方法はまた、酸化及び再生されたセルロース又は他のタイプのポリマーでできた生成物にも首尾よく適用されている。すべての例で、中性化された支持体は、公知の方法によって得られたトロンビンの付着物を受け入れた。しかし、本明細書に記載する方法はまた、酸性度レベルにおける変動に感受性である酵素全般（そのため、それらが固定される支持体のpHを６．５〜７．５の値で安定化させることが不可欠である）だけでなく、他の薬理学的及び／又は生物学的に活性な分子による前記ポリマー支持体の浸潤にも適用可能である。

広範囲の出血を特徴とする大きな創傷、損傷した臓器及び／又は手術創のための止血タンポンとしての使用を意図したものであるポリマー支持体の中性化及びその後のトロンビン浸潤を示す以下の実施例によって本発明をさらに例示する。

１．化学量論的量のＮａＨＣＯ₃によるHYAFF（登録商標）11 p75HE支持体の中性化
１．１ 塩化ナトリウム溶液による前処理
大きさ４×４cm、重さ１５２mgの不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試験片をペトリ皿に入れ、食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）１．４mlで湿潤させ、少なくとも１０分間放置した。次いで、乾いた区域がないかことを保証するためにチェックした。乾いたパッチがなおも存在するならば、数滴の食塩水を追加して、さらに１０分間放置した。

生成物を真空凍結乾燥機に入れて乾燥させた。少なくとも−３０℃で凍結させたのち、乾燥チャンバを１０（^-1）ミリバールまで減圧した。

ペトリ皿を−５℃まで加温し、４時間放置し、次いで２５℃まで加温し、少なくとも６時間放置した。

１．２ 支持体の滴定
ＮａＣｌで前処理した不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの支持体を裁断し、１６５mg分を秤量し、水６０mlとともにビーカに入れ、ＮａＣｌ ０．１gを加え、それをさらに５分間振とうした。

それを１〜５℃の恒温まで冷却し、広域指示薬液５滴を加え、不織布試料上に緑の変色が現れることによって示される中性に達するまで０．０１ＮａＯＨ溶液を滴下した。

消費された０．０１Ｎ ＮａＯＨの量は、０．０１７mmolに対応する１．７mlであった。消費された炭酸水素塩の量は、ＭＷ炭酸水素ナトリウム＝８４．０４×０．０１７＝１．４２８mgに等しかった。

１．３ 炭酸水素ナトリウムによる支持体の中性化
１．１にしたがって調製し、γ線によって滅菌した不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試料を使用した。炭酸水素ナトリウム１．００１gを水１００mlに溶解することによって１％炭酸水素ナトリウム溶液を調製する必要があった。次いで、１％炭酸水素ナトリウム溶液１mlを取り出し、水で量を５．６mlに調節した。次いで、この溶液０．８mlを使用して試料を湿らせた。

１．４ トロンビン溶液による支持体の浸潤
１mlあたりトロンビン２０００単位を含有する溶液０．５mlを、１．３にしたがって調製した試料の上に延展させたのち、少なくとも１５分間放置した。

次いで、生成物を以下のように凍結乾燥させた。生成物を−２〜５℃の温度に冷却し、次いで、−３０℃未満の温度で凍結させた。次いで、乾燥チャンバを１０（^-1）ミリバールまで減圧した。皿を−２５℃〜−１０℃の温度まで加温したのち、少なくとも１２時間昇華させた。乾燥させた皿を−１０℃〜＋２５℃の温度で少なくとも２時間維持した。

１．５ 非中性化試料の調製
ＮａＣｌ溶液で前処理した不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試験片を水のみ０．８mlで処理し、１５分後、トロンビン溶液０．５mlを表面上に延展させた。

１．６ 試料からのトロンビン抽出及びその後の５UT/ml（トロンビン単位／ml）までの希釈
二つの異なる試料を５ml注射器に挿入し（プランジャなしで）、次いでプランジャを元どおり装着した。ニードルキャップによって水１．３mlを各注射器に加えた。これを片側に１時間配置した。

プランジャを注射器に押し込むことによって不織布から溶液を抽出し、抽出物を試験管に捕集した。次いで、ＰＢＳ１．５mlを注射器に加え、数分間放置したのち、プランジャを押すことによって溶液を抽出することによって不織布を洗浄した。こうして得られた溶液を、最初の抽出物を入れた試験管に加えた。この処理を繰り返した。

溶液を１０ml量にして、１００UT/mlの濃度を得た。

濃度１００UT/mlの溶液１mlを取り出し、ＰＢＳで量を１０mlにして、１０UT/mlの濃度を得た。

濃度１０UT/mlの溶液１mlを取り出し、ＰＢＳで量を２mlにして、５UT/mlの濃度を得た。

１．７ 濃度５UT/mlのトロンビン対照液の調製
濃度２０００UT/mlのトロンビン溶液０．５mlをＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）で１０mlまで希釈して１００UT/mlの濃度を得た。

濃度１００UT/mlの溶液１mlをＰＢＳで量を１０mlにして、１０UT/mlの濃度を得た。

濃度１０UT/mlの溶液１mlを取り出し、ＰＢＳで量を２mlにして、５UT/mlの濃度を得た。

１．８ 濃度１mg/mlのフィブリノーゲン溶液の調製
濃度９０mg/mlのフィブリノーゲン溶液１mlをＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）で９mlの量まで希釈して、濃度１０mg/mlのフィブリノーゲン溶液を得た。１mlを取り出し、ＰＢＳで量を１０mlにして、１mg/mlのフィブリノーゲン濃度を得た。

１．９ 中性化不織布及び非中性化不織布から抽出したトロンビンの活性の比較
１０×１０cmの大きさのペトリ皿をふたなしで表面上に平らに配置した。先に調製した三つのトロンビン溶液それぞれから一塗りずつの１００マイクロリットル３塗りを、皿の上、縁から約１cmのところに約２cm間隔の列で配置した。
１．濃度５UT/mlの対照液、
２．濃度５UT/mlの炭酸水素塩で中性化した不織材料から抽出した溶液、
３．濃度５UT/mlの非中性化不織材料から抽出した溶液。

同時に、濃度１mg/mlのフィブリノーゲン１００マイクロリットルの三つの試料を加えた（マルチチャネルピペットを使用）。次いで、これを３０〜６０秒間放置した。

次いで、皿を垂直位置に来るまでゆっくり傾け、以下を検証した。
・フィブリノーゲン＋トロンビンによって構成された対照試料及び炭酸水素塩で中性化された不織材料から抽出されたフィブリノーゲン＋トロンビンによって構成された対照試料が元の試料と同じ量の血餅を形成し、傾けたとき皿にしっかり付着したままであるということ、
・炭酸水素塩で中性化されていない不織材料から抽出されたフィブリノーゲン＋トロンビンによって形成された試料が他の二つよりもずっと小さい血餅を形成し、傾けたとき皿の上で滑るということ。

これは、試料３では、支持体の酸性度のせいでトロンビンがその酵素活性を十分に発揮することができなかったことを示す。

２．酸化再生セルロース（ＯＲＣ）による支持体の中性化
このタイプのポリマー支持体上では、中性化は、炭酸水素ナトリウムのような塩基性物質の過剰量を加えることによって達成される。

２．１ 炭酸水素ナトリウムのヒドロアルコール溶液の調製
炭酸水素ナトリウム０．５gを水１００mlに溶解した。この溶液をゆっくりと攪拌し、その間、エタノール４００mlを加えた。

２．２ 試料の中性化
得られた混合物中にＯＲＣ（４×４cm、重さ１４８mg）に基づく組織の試験片を少なくとも２０分間入れておいた。次いで、試料を溶液から取り出し、エタノールと水との比８０：２０の溶液２００mlで少なくとも２回洗浄した。

表面のpHを指示薬液で試験した。７を超えるならば、数値が正常になるまでさらなる洗浄を実施した。

この時点で、試料を無水エタノール２００mlで２回洗浄した。１回の洗浄は少なくとも１５分の長さであった。

試料を３０℃に設定された乾燥機に入れ、窒素流中で少なくとも４時間、真空中で少なくとも８時間乾燥させたのち、γ線によって滅菌した。

トロンビン溶液（８４０単位／mlの濃度）１．２mlを組織上に配置した。

それを少なくとも２０分間放置したのち、１．１に記載のようにして凍結乾燥させた。

２．３ 非中性化試料の調製
ＯＲＣの試験片（４×４cm、ペソ１４８mg）を、水１００ml及びエタノール４００mlによって構成されたヒドロアルコール溶液に浸漬した。次いで、２．２に記載した手順に従い、ただし表面のｐＨをチェックすることはせず、すすぎ、乾燥及びトロンビンによる浸潤の同じ工程を実施した。

２．４ 中性化及び非中性化ＯＲＣから抽出したトロンビンの活性の比較
１．９に記載のようにして活性を試験すると、トロンビンが最大活性を維持していることが示された。実際に、フィブリノーゲン溶液による処理ののち、炭酸水素ナトリウムで中性化されたＯＲＣから抽出されたトロンビンの試料及び対照トロンビンによって構成された試料は、非中性化試料から抽出されたトロンビンで得られたものよりもはるかに大きい同じサイズの二つの血餅を形成した。そのうえ、これら二つの血餅は、傾けたときでもペトリ皿に付着したままであった。

３．過剰量のＮａＨＣＯ₃によるHYAFF（登録商標）11 p75HEの支持体の中性化
この場合、過剰量の塩基性物質が使用されるとき、不織HYAFF（登録商標）11 p75HEを高精度に秤量する必要はない。

３．１ 中性化浴の調製及び中性化
中性化浴はまた、イオン移動度を助長する薬剤を含有し、エタノールと水との比６０：４０の混合物によって構成されるものであった。次いで、エタノール３００mlと水２００mlとを混合し、この混合物に対し、ＮａＨＣＯ₃１．９g及びＮａＣｌ ２．２５gを加えた。次いで、この溶液を２０±５℃に冷却し、その中に、重さ１０gの不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試験片を二つのステンレス鋼メッシュによって吊り下げて浸漬した。不織材料を中性化浴中に約６０分間維持した。

３．２ 洗浄
過剰量の塩基を除去するためには、２０±５℃のエタノールと水との比８０：２０の混合物を用いる少なくとも３回の洗浄が必要であった。したがって、不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試験片を前記エタノール・水混合物４００ml中で振とうすることによって洗浄した。最初二回の洗浄はそれぞれ１〜２時間の長さであり、その後の洗浄はそれぞれ１〜３時間の長さであった。三回目のすすぎののち、洗浄混合物の中性化を検証した。中性がまだ達成されていないならば、達成されるまでさらなる洗浄を実施した。最後の洗浄は、試料をエタノール４００ml中で少なくとも９０分間振とうすることによって実施した。

次いで、不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試験片をアセトン３００ml中で２回、各回少なくとも４時間振とうすることによって洗浄した。このようにして中性化した支持体を窒素流中３０℃で乾燥させ、γ線によって滅菌した。

３．３ トロンビン溶液による支持体の浸潤
ＰＢＳ中トロンビン（１０００単位／ml）で構成された溶液を調製した。中性化した無菌の不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの約２５０mg試料をプランジャなしの注射器に入れた。次いで、プランジャを元どおり装着し、ニードルキャップを使用してトロンビン溶液１．２mlを加えた。これを３時間放置した。

３．４ 試料からのトロンビン溶液の抽出
液体を注射器から試験管に注入した。さらに１．５mlのＰＢＳを注射器に入れ、何分かののち、液体を再び取り出し、先の量に加えた。この処理を少なくともさらに２回繰返したのち、ＰＢＳで量を１０mlに調節した。

３．５ 非中性化試料の調製
エタノール３００mlを水２００mlと混合し、２０℃に冷却し、この混合物に、重さ１０gの不織HYAFF（登録商標）11 p75HEの試験片を二つのステンレス鋼メッシュによって吊り下げて浸漬した。約６０分後、すすぎ、乾燥、滅菌、浸潤及びトロンビン抽出のサイクルを前記のように実施した。

３．６ 対照液
１．７及び１．８に記載のようにしてトロンビン溶液及びフィブリノーゲン溶液を調製した。

３．７ 中性化及び非中性化HYAFF（登録商標）11 p75HEから抽出したトロンビンの活性の比較
１．９に記載のようにして活性を試験した。

フィブリノーゲンの添加ののち、対照トロンビン及び中性化試料から抽出されたトロンビンによって構成された試料中で二つの血餅が形成した。これらの血餅は同じサイズであり、傾けたときペトリ皿の底に付着した。非中性化対照試料から抽出されたトロンビンの試料では、フィブリノーゲン添加ののち、非常に小さな血餅が形成し、傾けたとき、それはペトリ皿の壁面をすばやく滑り落ちた。

したがって、この場合でも、支持体の中性化はトロンビンの活性に影響しなかった。

止血剤は場合によっては深い創傷及び／又は浅い創傷、損傷した臓器の速やかな凝固及び／又は手術中の速やかな凝固を要するため、上記記載は、トロンビンによる浸潤ののち、使用されるポリマー支持体を中性化する重要性を確認させるものである。本発明によって特許請求される方法は、現在の問題理解の制限を解消し、適用しやすく、作りやすく、効果的で安全である解決手段を提供する。また、薬理学的・生物学的に活性な分子が他の凝固因子又は成長因子である場合にも有効であることがわかった。

Claims (20)

1. 凝固過程を妨害する薬理学的及び／又は生物学的に活性なタンパク質を含有する止血用のポリマー支持体の調製方法であって、
   ・塩基性物質又は緩衝液によって前記支持体を中性化する工程と、
   ・前記支持体を乾燥させる工程と、
   ・既定量の前記薬理学的及び／又は生物学的に活性なタンパク質で前記支持体を浸潤させる工程と
   を含む方法。
2. 使用されるポリマーが天然ポリマーである、請求項１記載の方法。
3. 前記ポリマーが、グリコサミノグリカン、多糖、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン酸、キトサン、ゲラン又はそれらの混合物から選択される、請求項２記載の方法。
4. 前記ポリマーが半合成ポリマーである、請求項１記載の方法。
5. 前記ポリマーが、ヒアルロン酸、アルギン酸、コラーゲン、セルロース又はそれらの混合物の誘導体から選択される、請求項４記載の方法。
6. 前記ポリマーが合成ポリマーである、請求項１記載の方法。
7. 前記ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はそれらのコポリマー、ポリカプロラクトン又はそれらの混合物から選択される、請求項１記載の方法。
8. 前記ポリマーが、エステル化、脱アセチル化、Ｏ−硫酸化、アミド化、過カルボキシル化によって得られるものから選択されるヒアルロン酸誘導体を含む、請求項１記載の方法。
9. 前記ポリマーが、ベンジルアルコールによって７５〜１００％の割合にエステル化されたヒアルロン酸誘導体である、請求項７記載の方法。
10. 中性化をアルカリ性炭酸水素塩又は緩衝液によって実施する、請求項１記載の方法。
11. 前記支持体の中性化の前に滅菌を実施する、請求項１〜１０記載の方法。
12. 前記生物学的・薬理学的に活性な物質による前記支持体の浸潤ののち滅菌を実施する、請求項１〜１０記載の方法。
13. 前記支持体の中性化ののち前記生物学的・薬理学的に活性な物質による浸潤の前に滅菌を実施する、請求項１〜１０記載の方法。
14. 前記生物学的・薬理学的に活性なタンパク質が凝固因子、特にトロンビンである、請求項１記載の方法。
15. 前記生物学的・薬理学的に活性な分子が成長因子である、請求項１記載の方法。
16. 前記分子が、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰから選択される、請求項１５記載の方法。
17. 請求項１〜１４の方法のいずれかによって得ることができるポリマー支持体。
18. 止血用の装置を調製するための、請求項１７記載のポリマー支持体の使用。
19. 請求項１５又は１６の方法によって得ることができるポリマー支持体。
20. 創傷治癒を促進するための装置を調製するための、請求項１９記載のポリマー支持体の使用。