CN108362754A - 一种呼出气中生物标志物在线检测系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种呼出气中生物标志物在线检测系统及方法。将被检测对象放置于单向气流舱室中(或在室内环境中),使用抽气泵将呼出气中的生物标志物采集到液体中,然后利用蠕动泵将样品实时输送至生物传感器芯片上,生物标志物与修饰在生物传感器上的特异性物质结合,使生物传感器电导性变化,通过对比电导的实时测量值与标准品的电导信号值,将所测电导信号实时转换为可读取的生物标志物浓度,实现实时在线检测呼出气中的生物标志物,从而可以实时地了解呼吸系统及机体的疾病健康状况。
Description
技术领域
本发明涉及呼出气中生物标志物实时检测研究领域,特别涉及一种由于系统免疫防御反应而引发的呼出气中生物标志物变化的实时在线检测的研究方法及其系统。
背景技术
呼出气中含有大量气道表面在呼吸过程中形成的气溶胶和挥发性的分子,包含了内源性的挥发性有机物和气道及肺组织细胞释放的细胞因子等生物标志物,通过对其检测,可反映气道及肺实质的炎症程度、氧化损伤状态等。同时,血液中的生物标志物(如降钙素原、白细胞介素等)也可以通过呼吸作用进入到呼出气中,通过对其检测研究,可以反映机体系统的健康疾病状况。通过对呼出气中生物标记物的研究,可以帮助我们更直接了解与呼吸系统有关的病理生理过程,同时也为我们提供了疾病早期诊断、动物病情疫情监测及药物疗效评价的新手段。
除此之外,我国近年来空气污染情况严峻,严重危害人体健康。各种大气污染物,尤其是大气细颗粒物(PM2.5)的呼吸暴露能够直接对肺部造成氧化损伤,引起炎症反应,显著增加慢性阻塞性肺病(COPD)、肺功能下降等呼吸系统疾病。生物标志物作为联系污染物与生物效应之间的纽带,对其研究可以用来反映污染物对生物体的毒性作用,可以作为污染物暴露和毒性效应的早期预警指标。
发明内容
本发明旨在提供一种呼出气中生物标志物的在线检测系统及方法,可以实时获知生物体呼出气中生物标志物的浓度和变化过程,从而可以实时地了解和研究被检测对象呼吸系统炎症、氧化损伤状态以及机体的疾病健康状况。
本发明的技术原理是:将被检测对象(如小动物)放置于单向气流舱室中(或在室内环境中),使用抽气泵将呼出气中的生物标志物采集到液体中,然后利用蠕动泵将样品实时输送至生物传感器芯片上,生物标志物与修饰在生物传感器上的特异性物质(如抗体)进行特异性结合,从而产生生物传感器电导性变化,通过对比电导的实时测量值与标准品的电导信号值,将所测电导信号实时转换为可读取的生物标志物浓度,实现实时在线检测呼出气中的生物标志物,从而可以实时地了解呼吸系统及机体的疾病健康状况。
本发明的技术方案如下:
一种在线检测呼出气中生物标志物的系统,包括采样装置、样品输送装置和检测装置三部分,其中采样装置将呼出气中的生物标志物采集到液体中,通过样品输送装置实时输送给检测装置,呼出气中的生物标志物与检测装置中的生物传感器上的响应物质相互作用,使生物传感器电导性变化,通过对比电导的实时测量值与标准品的电导信号值,获得生物标志物浓度。
进一步的,上述在线检测呼出气中生物标志物的系统中,所述采样装置包括单向气流舱室、抽气泵和气溶胶液体富集系统,被检测对象(活体动物或人)放置于单向气流舱室中,抽气泵将呼出气输送到气溶胶液体富集系统中,气溶胶液体富集系统采集到的含有呼出气中生物标志物的液体样品传递给样品输送装置。
优选的,所述单向气流舱室为透明材质的舱室(或为室内环境),便于观察被检测对象(舱室中的实验动物或室内环境中人群)的活动状况,尺寸宜适中,避免空间太小而造成被检测对象紧张焦躁,避免空间太大而造成呼出气被清洁空气稀释较多,降低采集效率。
所述抽气泵可以为任意类型抽气泵,一般要求抽气流量范围为0.5-5L/min,其中以低功率、低噪音的真空抽气泵为最佳。
所述气溶胶液体富集系统可以是一个内盛采集液的样品采集管,作为一种优选实现方式,所述样品采集管的设计原理为负压液体撞击式,材质为塑料、玻璃等透明材料。样品采样管设计有4个开口:顶部的输气管口,上部侧面的抽气口,下部侧面的采集液补充口,以及底部的样品输送口。其中来自单向气流舱室的输气管穿过输气管口,从样品采集管顶部竖直向下深入到采集液液面下方1-2cm处;抽气泵连接的抽气口位于采集液的液面上方;采集液补充口位于侧部靠下部位(采集液液面以下为最佳)。除此四个开口外,样品采集管其他部位结构气密。抽气泵开启,样品采集管中采集液液面上方为负压,在大气压的作用下,空气从单向气流舱室中携带实验动物呼出气进入到样品采集管,气体中携带的物质与样品采集液混合被采集,废气由抽气泵排出。抽气速率为0.5-2L/min,过低的抽气速率会造成呼出气输送不及时,过高的抽气速率则会导致液体飞溅而影响采集。
进一步的,上述在线检测呼出气中生物标志物的系统中,所述样品输送装置包括蠕动泵、采集液瓶、废液瓶和输送管路。其中蠕动泵从采集液瓶中将样品采集液输送给采样装置(气溶胶液体富集系统),然后将采集到的样品实时输送给检测装置,经检测后的废液由输送管路送到废液瓶收集。
优选的,所述蠕动泵为双通道蠕动泵,两通道分别用于样品输送和采集液补给,可以调节流量范围至1-200μL/min。
所述的采集液瓶和废液瓶可以为任意用于生化样品盛放的容器,如实验用离心管等。
所述输送管路包括样品输送管与采集液补充管,优选为与蠕动泵适配的硅胶软管,样品输送管与采集液补充管的管径相同以保证流量相等,从而维持气溶胶液体富集系统(样品采集管)中的溶液体积维持不变。
进一步的,上述在线检测呼出气中生物标志物的系统中,所述检测装置包括微流控芯片、生物传感器、信号放大器和微型计算机。其中生物传感器布设于微流控芯片上,实时响应样品中的生物标志物;生物传感器经信号放大器与微型计算机连接,传感器信号通过信号放大器放大后,由微型计算机处理并展示。
优选的,所述生物传感器是经过特异性抗体修饰的基于场效应的生物传感器。
本发明的另一方面,提供了一种在线检测呼出气中生物标志物的方法,
包括以下步骤:
1)功能化修饰生物传感器,使之能够响应呼出气中的生物标志物;
2)搭建前述的在线检测呼出气中生物标志物的系统;
3)通过采样装置采集被检测对象呼出气中的生物标志物;
4)将采集到的样品输送到生物传感器;
5)检测生物传感器的电导性变化,通过对比电导的实时测量值与标准品的电导信号值,获得生物标志物浓度。
上述步骤1)功能化修饰生物传感器通常是将生物标志物的特异性抗体修饰到器件上,用于检测呼出气中的生物标志物。所述生物传感器优选为硅纳米线生物传感器,抗体修饰方法优选为化学修饰。简要的,首先利用硅烷交联剂(如3-氨丙基三乙氧基硅烷)浸泡硅纳米线,在硅纳米线表面形成带正电荷的氨基基团。然后使用戊二醛与氨基反应,在硅纳米线表面形成醛基。随后用抗体溶液浸泡芯片,使抗体与醛基结合被修饰到器件上。最后使用正丙胺溶液封闭没有结合抗体的醛基,之后即可用于检测生物标志物。
生物传感器进行检测前要使用标准溶液进行校正,用缓冲溶液以及包含一系列不同浓度生物标志物的标准溶液进行校正。
在步骤3)中,将被检测对象放入采用装置的单向气流舱室中或置于室内环境中,在气溶胶液体富集系统(样品采集管)中放入采集液,打开抽气泵进行样品采集。通常,采集液为无目标生物标志物的无菌水或者PBS缓冲液,优选为在功能化修饰生物传感器时配制抗体溶液所用的PBS缓冲液。
优选的,在步骤3)采集样品之前,先将未采集样品的采集液输送到生物传感器中进行检测,作为本次检测过程的背景值,当检测值稳定时,打开采集系统中的抽气泵进行采样。
在步骤5)中,当采集样品中含有的生物标志物和生物传感器器件表面修饰的抗体发生特异性反应时,生物标志物和抗体结合的信号导致器件的电导信号发生变化,变化后的电导信号经过信号放大器放大,通过微型计算机处理并显示。当电导值高于缓冲溶液的电导值时,认为呼出气溶液含有相应的生物标志物。
本发明的有益效果:本发明克服了目前生物标志物检测上的一些缺陷(如耗时长、离线检测、采样伤害等),采用无创的呼出气实时采集和检测方法,快速,准确,且能连续监测变化趋势,在动物疾病疫情监测、环境毒理学研究、药物动力学研究等方面有很好的应用前景。本发明呼出气中生物标志物在线检测系统及方法的主要特点是:
(1)该系统和方法实时采集呼出气,并利用硅纳米线生物传感器检测生物标志物,相比传统法,该方法快速,灵敏,准确;
(2)该系统通过无创采集检测呼出气中的生物标志物,相比于采集血液样品,最大程度地避免和减轻了采样过程中对被检测对象造成的刺激和伤害;
(3)该方法通过基于场效应的生物传感器实时反映呼出气中的生物标志物的含量,同时可以连续监测,反映被检测对象呼吸系统或机体在一段时间内的生理和病理变化过程。
附图说明
图1.本发明呼出气中生物标志物实时在线监测系统结构示意图,其中:1-单向气流舱室,2-抽气泵,3-气溶胶液体富集系统,4-蠕动泵,5-采集液瓶,6-废液瓶,7-输送管路,8-微流控芯片,9-生物传感器,10-信号放大器,11-微型计算机。
图2.本发明实施例对呼出气中生物标志物实时在线监测系统检测白介素6标准样品的结果图。
图3.本发明实施例对呼出气中生物标志物实时在线监测系统检测不同呼出气样品中白介素6的结果图。
具体实施方式
下面结合附图,通过实施例对本发明的呼出气中生物标志物在线检测系统和方法做进一步阐述,本领域技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内,各种替换和修改都是可能的。因此,本发明不应局限于实施例所公开的内容,本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。
呼出气中生物标志物在线检测系统结构如图1所示,包括三大功能部分:采样装置、样品输送装置和检测装置,其中采样装置包括单向气流舱室1、抽气泵2和气溶胶液体富集系统3;样品输送装置包括蠕动泵4、采集液瓶5、废液瓶6和输送管路7;检测装置包括微流控芯片8、生物传感器9、信号放大器10和微型计算机11。被检测对象(活体动物或人)放置于单项气流舱室1中(或室内环境中),抽气泵2将气体输送到气溶胶液体富集系统3中,蠕动泵4从采集液瓶5中将样品采集液输送到气溶胶液体富集系统3中,然后将样品实时输送到检测装置中,流经微流控芯片8的样品最终被废液瓶6收集。布设于微流控芯片8上的生物传感器9实时响应样品中的生物标志物如IL-6(或其他任何生物标志物),响应信号通过信号放大器10放大后,由微型计算机11处理并展示。
所述单项气流舱室1为亚克力材质,尺寸为300*200*200mm,前后两端开直径为5mm圆孔,一端通入清洁空气,另一端连接内径为5mm的无菌软管至气溶胶液体富集系统3。所述气溶胶液体富集系统为样品采集管,使用50ml PP材质的实验用离心管制作,在管盖中心打孔使软管可以穿过。在离心管侧面,管盖下1cm处,打孔连接抽气泵2。抽气泵2为便携式可调流量无油真空泵,设置抽气流量为1L/min。离心管底部和靠近底部的侧面分别打孔连接硅胶软管作为出样口和补液口,直径1mm。所有开孔连接处使用热熔胶密封,保证气密。
蠕动泵4两通道分别是:一个连接样品输送管从样品采集管的出样口至微流控芯片再至废液瓶6,另一个连接采集液补充管从采集液瓶5至样品采集管的补液口。这些管路均为硅胶软管,内径0.8mm。蠕动泵4工作时,两条管路中的流量相等。
实施案例:在线检测PM2.5血液暴露后的大鼠呼出气中的白介素6(IL-6)
具体步骤如下:
(1)使用白介素6特异性抗体修饰硅纳米线生物传感器:用浓度为4mM,pH8.4的PBS缓冲液配制特异性抗体溶液,包含浓度0.1mg/ml的抗体和浓度0.4mg/ml的氰基硼化钠;首先利用硅烷交联剂(如3-氨丙基三乙氧基硅烷)浸泡硅纳米线,在硅纳米线表面形成带正电荷的氨基基团。然后使用戊二醛与氨基反应,在硅纳米线表面形成醛基。随后用抗体溶液浸泡芯片,使抗体与醛基结合而被修饰到器件上。最后使用正丙胺溶液封闭没有结合抗体的醛基,之后即可用于检测生物标志物。(2)对4只大鼠进行不同来源但同质量的PM2.5静脉注射暴露(也可以是呼吸暴露等其他方式);
(3)使用标准样品对生物传感器进行校准,通过缓冲液和不同浓度的白介素6溶液流经检测系统进行校准。
(4)将大鼠放置到单向气流舱室中,开启蠕动泵和抽气泵,进行样品采集和检测。当样品中有白介素6存在时,电导信号发生变化,电导值高于缓冲液电导值时,即为检测到白介素6。
图2显示了使用浓度为5-50000pg/ml的白介素6溶液对硅纳米线生物传感器进行校准的结果图,结果显示系统性能良好,白介素6浓度越高,电导信号值越大,不同浓度的信号可以很好地区分。
图3显示了暴露PM2.5后的四只大鼠呼出气中的白介素6检测电导信号值,可以看到不同来源颗粒物导致不同浓度的生物标志物,从而可以推测不同的健康效应。
Claims (10)
1.一种在线检测呼出气中生物标志物的系统,包括采样装置、样品输送装置和检测装置三部分,其中采样装置将呼出气中的生物标志物采集到液体中,通过样品输送装置实时输送给检测装置,呼出气中的生物标志物与检测装置中的生物传感器上的响应物质相互作用,使生物传感器电导性变化,通过对比电导的实时测量值与标准品的电导信号值,获得生物标志物浓度。
2.如权利要求1所述的系统,其特征在于,所述采样装置包括单向气流舱室、抽气泵和气溶胶液体富集系统,被检测对象放置于单向气流舱室中,抽气泵将被检测对象的呼出气输送到气溶胶液体富集系统中,气溶胶液体富集系统采集到的含有呼出气中生物标志物的液体样品传递给样品输送装置。
3.如权利要求2所述的系统,其特征在于,所述单向气流舱室为透明材质的舱室,所述抽气泵的抽气流量范围为0.5-5L/min,所述气溶胶液体富集系统为样品采集管。
4.如权利要求3所述的系统,其特征在于,所述样品采集管设有4个开口:顶部的输气管口,上部侧面的抽气口,下部侧面的采集液补充口,以及底部的样品输送口;其中:来自单向气流舱室的输气管穿过输气管口,从样品采集管顶部竖直向下深入到采集液液面下方1-2cm处;抽气泵连接的抽气口位于采集液的液面上方;采集液补充口位于侧面靠下部位,位于采集液液面以下。
5.如权利要求1所述的系统,其特征在于,所述样品输送装置包括蠕动泵、采集液瓶、废液瓶和输送管路,其中蠕动泵从采集液瓶中将样品采集液输送给采样装置,然后将采集到的样品实时输送给检测装置,检测后的废液由输送管路送到废液瓶收集。
6.如权利要求5所述的系统,其特征在于,所述蠕动泵为双通道蠕动泵,两通道分别用于样品输送和采集液补给,流量调节范围为1-200μL/min。
7.如权利要求5所述的系统,其特征在于,所述检测装置包括微流控芯片、生物传感器、信号放大器和微型计算机,其中生物传感器布设于微流控芯片上,实时响应样品中的生物标志物;生物传感器经信号放大器与微型计算机连接,生物传感器的信号通过信号放大器放大后,由微型计算机处理并展示。
8.一种在线检测呼出气中生物标志物的方法,包括以下步骤:
1)功能化修饰生物传感器,使之能够响应呼出气中的生物标志物;
2)搭建权利要求1~7任一所述的在线检测呼出气中生物标志物的系统;
3)通过采样装置采集被检测对象呼出气中的生物标志物;
4)将采集到的样品输送到检测装置中的生物传感器;
5)检测生物传感器的电导性变化,通过对比电导的实时测量值与标准品的电导信号值,获得生物标志物浓度。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤1)所述生物传感器为硅纳米线生物传感器,通过化学修饰的方法将生物标志物的特异性抗体修饰到生物传感器上。
10.如权利要求8所述的方法,其特征在于,在步骤3)之前,用缓冲溶液以及包含一系列不同浓度生物标志物的标准溶液对功能化修饰的生物传感器进行校正。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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