CN117396131A - 用于从人呼吸中收集并洗脱气溶胶颗粒以进行分析的装置、系统和方法 - Google Patents

用于从人呼吸中收集并洗脱气溶胶颗粒以进行分析的装置、系统和方法 Download PDF

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Abstract

用于收集和洗脱人或动物呼吸样品中含有的气溶胶颗粒的装置、系统和方法，其目的是对呼吸样品中存在的非挥发性呼吸道病原体进行采样。在至少一些实施方案中，本发明提供了这样的装置、系统和方法以从呼吸气溶胶中收集、保存、聚集和释放病原体特异性生物标志物，用于随后用免疫测定和分子测定进行分析，以进行人的呼吸道感染的临床诊断。采样装置包含水溶液可溶解的聚合物膜，其安装在吸附气溶胶颗粒的呼吸气溶胶的采样装置的壳体中的流动路径中。采样装置进一步包含用于将洗脱装置可释放地接合到壳体的接合方式，其用于将水溶液引入到壳体中并且用于在与水溶液接触时溶解聚合物膜。

Description

用于从人呼吸中收集并洗脱气溶胶颗粒以进行分析的装置、 系统和方法
发明领域
本发明涉及用于收集人或动物的呼吸样品中含有的气溶胶颗粒的装置、系统和方法，其目的是对呼吸样品中存在的非挥发性呼吸道病原体进行采样，并且具体地涉及这样的装置、系统以及方法，其用于病原体和病原体生物标志物的改进收集、保存、制备、聚集和快速释放，以进行呼吸道感染临床诊断的免疫测定和分子测定的后续分析。
发明背景
全球高达20％的初级保健咨询是由于呼吸道感染引起的。它们每年导致400万人死亡-几乎全部是由于引起肺炎的下呼吸道感染(LRTI)(Vos et al.Lancet 2020；396(1082):1204)。一方面，细菌感染需要及时开始抗生素治疗，而另一方面，病毒感染(例如流行性感冒)则需要使用抗病毒药物(如果有)进行治疗。
因此，体外诊断(IVD)行业迫切需要提供改进的快速诊断解决方案来检测呼吸道感染，以便打破传播链，启动正确及时的治疗，并避免开出不必要的抗生素处方以对抗抗生素耐药性。需要在人们首先寻求护理的护理点(point-of-care)以及对容易获得的样品进行快速、简单的样品采集和测试。世界卫生组织(WHO)和其他利益相关者制定了描述未满足的诊断需求的高优先级目标产品概况(TPP)，并包括(a)用于社区获得性下呼吸道感染即时检测(point-of-care test)的TPP(Gal et al.PLoS One.2018；13(8):e0200531)和(b)用于检测结核病(TB)的快速基于非痰检测的TPP(世界卫生组织，新结核病诊断的高优先级目标产品概况：共识会议报告，2014和Denkinger.JID.2015；211(Suppl2))。
有许多现有技术实例描述了使用拭子、痰、唾液和支气管肺泡灌洗液(BAL)以进行呼吸道感染的诊断。这些标本限制了呼吸系统感染性疾病(特别是下呼吸道感染(LRTI))的诊断，具体如下：(a)鼻咽或口咽拭子会导致患者不适，需要经过培训的工作人员并漏掉LRTI，(b)唾液和鼻拭子可能对自我检测或在家采集有吸引力，但不含有或仅含有少量来自下呼吸道的细菌和病毒，使得它们的应用局限于对上呼吸道感染的诊断，(c)痰是最常见的TB诊断样品，但很难获得，并且不均匀的样品基质需要复杂且昂贵的样品制备，(d)支气管肺泡灌洗(BAL)是诊断LRTI的黄金标准，但需要特殊设备(在护理点不可用)，这是高度侵入性的并可能导致并发症。总之，来自上呼吸道的标本可能会漏掉LRTI，而来自下呼吸道的标本很难获得，或者需要在护理点不可行的侵入性程序。
为了克服现有标本的这些局限性，特别是在下呼吸道感染的诊断中，期望使用人和/或动物的呼吸样品。
有许多现有技术实例描述了在传感器阵列(例如电子鼻或质谱法)上收集和检测呼吸中的挥发性有机化合物(VOC)(US10413215,WO2017187141)。然而，检测到的VOC的分子实体及其来源通常没有定义，并因此它们与特定疾病的相关性尚不清楚，甚至在生物学上不可信，这导致特异性低，使得基于VOC的系统不适合临床诊断。此外，质谱仪仍然昂贵，是相对较大的仪器，并因此很可能不适合在护理点使用。此外，收集的VOC与最先进的实验室诊断方法(例如聚合酶链式反应(PCR))不兼容。
相比之下，众所周知，人类气溶胶含有生物学上合理的非挥发性病原体，例如完整的细菌、病毒、真菌和病原体生物标志物，例如核酸(例如DNA和RNA)或病原体抗原。气溶胶是空气中细颗粒物、颗粒物质、“飞沫核”或液体飞沫(随后称为“气溶胶颗粒”)的悬浮液。从物理上讲，气溶胶是颗粒与其周围的气体或气体混合物的异质混合物。呼出的气溶胶颗粒以多种尺寸模式出现，这些模式与呼吸道中不同的产生部位和产生机制相关(Wang etal.Science.2021；373(6558))。气溶胶颗粒直径通常≤100μm，并可能含有传染性细菌和病毒，研究表明小气溶胶颗粒(通常≤5μm)中富含病原体(Gralton et al.J MedVirol.2013；85(12):2151,Fennelly et al.Am J Respir Crit Care Med.2004；169(5):604)。含有生物材料例如细胞(如细菌)或病毒、生物分子、代谢副产物和细胞碎片的气溶胶通常被称为生物气溶胶，其源自生物来源或可能影响生物目标。许多研究表明，呼吸系统感染性疾病包括RSV(Kulkarni et al.Am J Respir Crit Care Med.2016；194(3):308)、MERS-CoV(Kim et al.Clin Infect Dis.2016；63(3):363)、流行性感冒(Yan et al.ProcNatl Acad Sci.2018；115(5):1081)和SARS-CoV-2(Liu et al.Nature.2020；582(7813):557)通过来自咳嗽、打喷嚏、呼吸和说话的微粒和气溶胶(飞沫和飞沫核)传播。对于结核病，60多年前Riley和Wells(Am J Hyg.1959；70:185)的开创性实验通过证明豚鼠在呼吸了来自遥远TB患者病房的空气后出现TB，证明了空气传播。从那时起，Fennelly等人总结的多项研究都详细描述了气溶胶中结核分枝杆菌(Mtb)和相关生物标志物的存在。(Chest.2020；157(3):540)。
当前来自人类呼吸气溶胶的用于病原体生物标志物的样品收集和聚集装置具有许多理想的属性，但效率低下，并因此不够灵敏和/或过于复杂且具有高呼吸阻力和/或没有教导快速和无仪器洗脱病原体生物标志物的方法。显然需要更有效且更简单地从人呼吸中收集病原体生物标志物，以提高灵敏度，随后快速洗脱生物标志物以用诊断测定进行检测。
背景技术未能教导或建议气溶胶中生物标志物的可重复收集和检测。现有技术的示例描述了气溶胶中特定生物标志物的收集，但所有这些都未能满足医学标准。限制之一是由于收集和聚集效率低而导致的低灵敏度(EP 1 377 815)。另一个限制是用于后续检测的所收集的特定生物标志物的释放不充分、不完整且耗时(US2020/0300876)。用于生物空气和气溶胶颗粒采样的其他现有技术示例的限制在于它们需要主动泵送，这使得仪器复杂并且不适合需要低呼吸阻力的潮汐式呼吸或呼气的人呼吸采样(US 2013/0273520)。进一步的现有技术示例没有描述收集和洗脱的无仪器组合。
WO 2012/024407描述了气溶胶收集系统，其使用具有形成为过滤器的多个电纺纳米纤维的纳米纤维垫来收集气溶胶。泵用于将空气中的颗粒夹带到气流中。
WO 2013/132085涉及用于气溶胶的便携式采样装置。静电过滤膜用于从受试者呼出气体中收集气溶胶。为了过滤掉污染物(例如唾液、粘液和大颗粒)，在采样装置内部提供了挡板以获得通过装置的非直线气流。使用后，该装置被密封，然后被送往实验室进行进一步的基于传感器的分析。
US 10,080,857描述了用于呼吸样品收集和分析的系统。受试者向连接到样品收集器的吹口呼气。样品收集器使用喷嘴并在喷嘴下游含有收集分析物的液体缓冲液。使用后，断开吹口，密封样品收集器，然后转移至分析分析物的诊断装置。
发明简述
本发明的一个目的是消除或至少减轻与现有技术的装置、系统和方法相关的问题。具体地，本发明的目的不仅是改进人或动物呼吸气溶胶颗粒中存在的非挥发性呼吸道病原体的收集，而且还改进样品的处理用于随后免疫测定和分子测定的分析，以进行人的呼吸道感染的临床诊断。
本发明的这些和可能的其他目的通过独立权利要求1、30和33的特征组合来解决。本发明的优选或任选特征在从属权利要求中表明。
本发明涉及用于从人类个体(受试者)收集和洗脱气溶胶颗粒以进行分析的装置、系统和方法。尽管本文提及“人类呼吸”，但预期本发明也适用于非人类动物。另外，本发明还可以用于从例如人类聚集的房间中的空气中收集颗粒，以测试由人类呼出的空气中可能存在于空气中的非挥发性呼吸道病原体。
在至少一些实施方案中，本发明提供了这样的装置、系统和方法，以从呼吸气溶胶颗粒中收集、保存、聚集和释放病原体特异性生物标志物，用于随后免疫测定和分子测定的分析，以进行人的呼吸道感染的临床诊断。该采样装置包含安装在壳体中的人呼出气体的气溶胶流动路径中的水溶液可溶解的聚合物材料(随后称为“聚合物膜”)，其吸附并保存一旦接触可溶解在水溶液中的气溶胶颗粒。
合适的可溶解的聚合物材料的非限制性实例包括聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖、聚氧化乙烯(PEO)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)和普鲁兰多糖。当用作撞击器时，可溶解的聚合物膜可以以膜或箔的形式提供，或者当用作过滤器时，可溶解的聚合物膜可以作为纤维或开孔泡沫或海绵提供。纤维生产的非限制性实例包括静电纺丝、熔喷、吹纺、湿纺、直接拉丝、离心纺纱、强力纺纱、接触纺丝和刷纺丝、模板合成、自组装、从植物或木材中分离纤维。在优选的实施方案中，可溶解的聚合物膜是在惰性支撑网上的电纺壳聚糖/聚氧化乙烯(PEO)(质量比8:2)纤维或在PVA箔上电纺的PVA纤维。
不希望受到单一假设的限制，这样的装置提供了用于病原体生物标志物(如来自人呼吸气溶胶颗粒的核酸和抗原)的便携式、手持式、高效的护理点收集和洗脱系统，该系统是完全一次性的并且不依赖复杂的仪器。
此外，洗脱优选通过将采样装置与洗脱装置(例如含有水溶液的管)连接，并将其上下翻转来进行，以使聚合物膜由于重力的作用而溶解。举例来说，水溶液是含有TRIS、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫氰酸胍、盐酸胍、HEPES、通用运输培养基(UTM)、液体amies运输培养基、吐温20、Triton X100、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、氯化钠、磷酸盐缓冲盐水、Hank’s平衡盐溶液、牛血清白蛋白、L-半胱氨酸、明胶、蔗糖、谷氨酸、万古霉素、两性霉素B、粘菌素、酚红、氢氧化钠、异丙醇或其组合的稳定化和/或灭活运输缓冲液。这使得能够保存含有病原体和病原体生物标志物的呼吸气溶胶样品，其目的是为了储存以及安全装运到集中实验室以用于呼吸道感染的后续临床诊断(例如用免疫测定和分子测定)。在一个具体实施方案中，洗脱装置是标准临床实验室管，并因此与集中实验室的标准工作流程高度兼容。这不仅加快了从气溶胶样品采集点到样品进行临床分析点的整个过程，而且需要更少的逻辑步骤，并将生物样品的污染风险降至最低。在用采样装置收集气溶胶颗粒后立即用稳定水溶液洗脱病原体和病原体生物标志物，保留了病原体的生存力并稳定了用于运输的病原体生物标志物。在一些实施方案中，为了安全运输而灭活病原体是所期望的，这可以通过杀死病原体但保留生物标志物的灭活缓冲液来实现。非限制性实例是使用含有硫氰酸胍的缓冲液，其灭活病原体但保留核酸以用于在环境温度运输样品。举例来说，含有所收集的气溶胶颗粒的洗脱装置被装运到集中实验室进行测试。
根据至少一些实施方案，这样的收集和洗脱系统优选地包含相对较少的组件以用于经济的制造。采样装置优选地输出聚集的病原体生物标志物样品，其与用于检测呼吸道中任何位置存在的呼吸道病原体的各种不同的测定、分析仪和方法兼容，包括但不限于上呼吸道和/或下呼吸道。优选地，采样装置不需要用于收集和洗脱的动力设备。本发明一起使用的分析仪和测定可以是护理点系统或集中实验室系统。测定和检测方法的非限制性实例包括免疫测定、包括所有核酸扩增测试(NAAT，例如PCR、等温扩增)的分子测定、DNA杂交测定、基于CRISPR的测定、测序测定或生长测定。
本发明的方法和系统的实现涉及手动、自动或其组合执行或完成某些选定的任务或步骤。此外，根据本发明的方法和系统的优选实施方案的实际仪器和设备，几个选定的步骤可以通过硬件或通过任何固件的任何操作系统上的软件或其组合来实现。例如，作为硬件，本发明的选定步骤可以作为芯片或电路实现，包括但不限于ASIC(专用集成电路)。作为软件，本发明的选定步骤可以作为由使用任何合适的操作系统的计算机执行的多个软件指令实现。在任何情况下，本发明的方法和系统的选定步骤可以被描述为由数据处理器执行，例如用于执行多个指令的计算平台。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提供的材料、方法和实施方案仅是说明性的而非旨在限制。
附图简述
在此仅通过示例的方式参考附图来描述本发明。现在具体详细地参考附图，应强调的是，所示的细节是通过示例的方式并且仅为了对本发明的优选实施方案进行说明性讨论的目的，并且呈现这些细节是为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用和最容易理解的描述。在这方面，没有试图比基本理解本发明所需的更详细地示出本发明的结构细节，结合附图进行的描述使得本领域技术人员显而易见本发明的几种形式是如何体现在实践中。
在附图中：
图1是本发明的采样装置和洗脱装置的示例性、说明性非限制性图解侧视图。
图2A-D是图1中的采样装置和洗脱装置的示例性图解侧视图，说明了程序的不同步骤，包括(A)气溶胶颗粒收集，(B)捕获的病原体的溶解和洗脱，(C)回收洗脱装置中的洗脱液，以及(D)用螺纹盖覆盖洗脱装置。
图3是体现本发明的采样装置和洗脱装置的图解视图，其使用微流体测定来检测病原体，读取来自微流体测定的信号的检测器以及数据输入、处理和呈现单元。
图4是体现来自图3的本发明的图解侧视图，其使用侧流免疫测定作为微流体测定来检测病原体，使用基于摄像头的检测器来读取信号，以及使用移动平板电脑作为数据输入、处理和呈现单元。
图5示出了说明根据本公开的示例性方法的流程图。
图6示出了非限制性示例性简化流程，在照片中示出了采样装置和检测器以及计算装置。
图7A和7B分别示出了先前描述的采样装置和洗脱装置的替代的、任选的实施方案。
图8示出了先前描述的采样装置和洗脱装置以及生物标志物测定的任选的实施方案的分解图。
图9示出了用于从呼吸样品中检测一种或多种病原体生物标志物以优选地提供可执行的诊断的示例性非限制性计算系统。
图10示出了用于接收多个这样的测定结果、分析它们(任选地与其他信息组合)、然后传输和/或存储它们的非限制性示例性系统。
图11A和11B显示了由在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)支撑网上的壳聚糖/聚氧化乙烯(PEO)纳米纤维垫组成的聚合物膜在暴露于呼吸气溶胶之前(A)和暴露于呼吸气溶胶之后(B)的非限制性示例性扫描电子显微镜(SEM)图像。
图12A和12B示出了先前描述的采样装置(A)的替代、任选实施方案，其用于收集、邮寄到实验室、用洗脱装置洗脱、在实验室中测试以及将结果传输给患者(B)。
图13示出了前述采样装置的替代、任选实施方案的透视剖面侧视图。
图14A示出了图13所示采样装置的细节的透视剖面侧视图。
图14B示出了通过图14A中所示的采样装置部分的气溶胶颗粒和空气流动路径。
图15显示了当与本发明的采样装置组合使用时的PCR测定的结果。
图16显示了三个不同人的呼气流速。
图17显示了10个采样装置在不同空气质量流速的平均压降。
至少一些实施方案的描述
现在将参照附图描述本公开的具体示例。尽管讨论了具体的配置和布置，但是应当理解，这样做只是为了说明性的目的。对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，本发明还可以用于各种其他应用中。
值得注意的是说明书中对“一个实施方案”、“实施方案”、“示例实施方案”等的引用表明所描述的实施方案可以包括特定特征、结构或特性，但是每个实施方案不一定包括该特定的特征、结构或特性。而且，这样的短语不一定是指同一实施方案。此外，当结合实施方案描述特定特征、结构或特性时，无论是否明确描述，结合其他实施方案来实现这样的特征、结构或特性将在本领域技术人员的知识范围内。
本文描述的一些实施方案涉及微流体布置中的呼吸气溶胶颗粒采样装置和洗脱装置，其集成在具有用于执行多种测试(例如免疫测定、等温扩增测定、PCR、DNA杂交、测序等)的检测系统的微流体测定内。在实施方案中，测试盒将执行此类测试所需的所有组件集成到单个一次性包装中。测试盒可以被配置成由外部检测器分析以读取测定信号，该测定信号与数据输入、数据处理和呈现系统连接，该呈现系统提供与测试盒内发生的反应相关的数据。其任选地将来自检测器的数据与用户在算法中输入的临床数据相结合，例如以确定受试者针对特定呼吸系统疾病(例如肺炎)的风险评分。然后它任选地将最终结果呈现给用户。
尽管下面的描述涉及采样装置，但是它可以被很好地理解并因此被命名为收集器，因为它收集人或动物的呼吸样品中含有的颗粒或颗粒物质。在收集颗粒或颗粒物质时，仅怀疑它们含有非挥发性呼吸道病原体。此后进行的测试将提供病原体或多种病原体的定性阳性或阴性确认或定量。因此，采样装置用于对可能存在于所收集的颗粒或颗粒物质中的非挥发性呼吸道病原体进行采样的目的。
下面的描述还涉及含有适合于溶解聚合物膜的水溶液的洗脱装置。可以想象，聚合物膜位于不被水溶液溶解的基底上。因此，源自气溶胶并被聚合物膜吸附的颗粒通过聚合物膜的溶解而从基底上洗掉或洗脱。聚合物膜的吸附可以包括吸附和/或吸收和/或结合。
图1是本发明的用于收集与呼吸道病原体相关的分子和/或结构和/或生物标志物的采样装置和洗脱装置的示例性、非限制性图解侧视图。不希望受到单一假设的限制，采样装置被设计成在使用之前收集人呼吸气溶胶颗粒中存在的此类分子和/或结构和/或生物标志物。
如收集器系统100中所示，采样装置1402包含在其中含有气流路径1406的管状壳体1404。来自受试者的呼吸穿过管状壳体1404中的流入口1408，穿过气流路径1406，到达膜1410。膜1410优选地包含由保持器元件1416保持就位的可溶解的聚合物膜。当呼吸穿过气流路径1406时，呼吸的非气态组分在膜1410处聚集。这些非气态组分包含固体和液体颗粒并与气态组分一起构成气溶胶悬浮液。如果呼吸道病原体存在于肺、咽喉、口腔和/或呼吸道的其他部分中，则来自这种病原体或整个病原体本身的分子和/或结构和/或生物标志物被预期存在于颗粒中。膜1410优选地包括这样的颗粒不能通过的材料，使得颗粒被捕获并聚集在膜1410处。不希望受单一假设的限制，膜1410优选地被配置成支持以足够聚集的量收集这样的颗粒，而不需要迫使部分的受试者过度呼气。由于膜1410的聚集作用，肺活量降低、肺部炎症和/或在呼气时不能产生很大的力的受试者能够提供足够的样品。
多种可溶解的聚合物材料是可用的并且适合用于聚合物膜1410。合适的可溶解聚合物材料的非限制性实例包括聚(乙烯醇)(PVA)、壳聚糖、聚氧化乙烯(PEO)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)和普鲁兰多糖。当用作撞击器时，可溶解的聚合物膜可以是箔或膜，或者当用作过滤器时，可溶解的聚合物膜可以是纤维，或其组合。在优选的实施方案中，可溶解的聚合物膜是在惰性支撑网上的电纺壳聚糖/聚氧化乙烯(PEO)(质量比8:2)纳米纤维垫。在另一个优选实施方案中，可溶解的聚合物膜是在PVA箔上的PVA纤维垫。
为了支持颗粒从聚合物膜1410洗脱，优选地在已经收集呼吸样品之后，任选地且优选地采样装置1402包含洗脱装置1422。在收集呼吸样品之后，洗脱装置1422可以被放置以与采样装置1402流体连通，或者可以在收集呼吸样品之前处于流体连通中。如果在收集呼吸样品之后将洗脱装置1422放置以与采样装置1402流体连通，然后任选地连通元件116支持通过聚合物膜1410的流体连通。
在该非限制性示例中，连通元件包括针116，其刺穿或破裂聚合物膜1410，使得流体(包括但不限于液体和/或气体)可穿过刺孔或缺口从采样装置1402到达洗脱装置1422.
当连接采样装置1402和洗脱装置1422时，优选地，针116刺穿隔膜118。隔膜118优选地定位在洗脱装置1422的上端120处，靠近与采样装置1402的连接。任选地，将上端120放置成与采样装置1402物理接触，例如通过压力、旋转和/或其他运动，导致隔膜118被刺穿、破裂或其他破坏。隔膜118的这种破坏允许水溶液122与聚合物膜1410接触。如图所示，水溶液122可以在超压室124中提供。如图所示，超压室124可以放置在洗脱装置1422的壁126中。当水溶液122与聚合物膜1410接触时，可溶解的聚合物膜被溶解。包含可溶解的聚合物和在可溶解的聚合物上或可溶解的聚合物内收集的任何气溶胶颗粒(“洗脱液”)的所得溶液优选在洗脱液储存器128中收集，如图所示。任选地，通过将连接的采样装置1402和洗脱装置1422上下翻转，水溶液122由于重力作用而被递送至聚合物膜1410。
本发明的优点之一在于，用可溶性的聚合物的采样装置优选地被配置成具有低呼吸阻力、高气溶胶颗粒和病原体收集效率，并且快速溶解在无毒的水溶液中以完全释放用于洗脱后的后续检测测定的病原体。作为非限制性实例，聚合物膜1410可包括电纺纳米纤维垫，其包含可溶解的聚合物的纤维。
在一些实施方案中，可溶解的聚合物膜含有配体或配体涂覆的捕获珠子。有多种配体可供使用并且适合使用。非限制性实例包括抗体、适体、肽和甘露糖结合凝集素。
在一些实施方案中，可溶解的聚合物膜可包含试剂或洗涤剂以增加收集期间的稳定性并改善洗脱期间的溶解度。非限制性实例包括Triton X-100、吐温、SDS、二氯二苯基三氯乙烷(DDT)、离液盐、二硫苏糖醇(DTT)、酸和/或碱、pH缓冲盐、珠子或其任何组合。
室124中的水溶液122可含有裂解剂或洗涤剂并且可被配置成产生裂解物。裂解剂或洗涤剂的非限制性实例包括Triton X-100、吐温、SDS、二氯二苯基三氯乙烷(DDT)、离液盐、二硫苏糖醇(DTT)、酸和/或碱、pH缓冲剂、珠子、溶剂或其任何组合。在优选的实施方案中，水溶液具有低于6.5的pH以快速溶解壳聚糖/PEO纳米纤维垫。在另一个优选的实施方案中，水溶液是pH高于8.0并且与核酸扩增测试(NAAT)例如PCR直接相容的TRIS-EDTA缓冲液。
图2A-D是图1中的采样装置和洗脱装置的说明性、示例性、非限制性图解侧视图，其说明了该程序的不同步骤。与图1中具有相同编号的组件具有相同或至少相似的功能。
图2A描绘了含有不同病原体202的人呼吸气溶胶颗粒200，其在收集步骤中沉积在聚合物膜1410上。病原体202是指其病原体的分子和/或其结构，任选地包括整个病原体和/或其片段。“气溶胶”是指如本文所描述，包含悬浮在气体中的任意尺寸的固体或液体颗粒的呼吸样品。图2A示出了没有洗脱装置1422的采样装置1402。
在图2B所描绘的后续步骤中，采样装置1402连接至洗脱装置1422。针116刺穿隔膜118，使得超压室124中的水溶液122能够流入采样装置1402以溶解包含所收集的病原体202的聚合物膜1410。在任选的实施方案中，通过将连接的采样装置1402和洗脱装置1422上下翻转，水溶液122可在重力作用下递送至聚合物膜1410。
接下来，如图2C所描绘的，含有病原体的洗脱液204在洗脱液储存器128中被收集。在洗脱之后，洗脱装置1422可以与采样装置1402断开。如图2D所示，洗脱装置1422可以用螺纹封闭件1213(例如盖子)加盖或覆盖，以用于储存直至进一步的处理。例如，洗脱装置1422可以与样品一起运输到中心实验室以用于病原体生物标志物的后续分析。
图3描绘了将采样装置1402和洗脱装置1422与如本文所示的检测装置306组合的说明性、示例性、非限制性系统。与图1和图2A-2D中具有相同编号的组件具有相同或至少相似的功能。如图所示，系统300包含如图所示的采样装置1402和洗脱装置1422。系统300优选地进一步包含检测装置306。检测装置306可以容纳测定系统304，测定系统304提供信号，然后由所述检测器306读取或检测该信号。检测器装置306优选地与计算装置308通信连接。计算装置308可以包含外部数据输入、处理和呈现系统，例如，以允许医疗人员在本地和/或实时地读取结果。任选地，采样装置1402、洗脱装置1422和/或测定304包括如图所示的测试盒310，其可以进入检测装置306用于读出。计算装置308可以通过如图所示的连接312与检测器306进行无线、有线、视觉和/或其他合适的通信。
测定304优选地被配置为与洗脱装置1422微流体连通的微流体测定。多种微流体测定是可用的并且适合使用。非限制性实例包括免疫测定、等温扩增测定、PCR、核酸杂交、基于CRISPR的测定和测序。在优选实施方案中，微流体测定是等温扩增测定。
多种读取测定信号的检测器306适合使用。非限制性示例包括荧光检测器、发光检测器、光度检测器或图像传感器。在任选但优选的实施方案中，检测器是多色荧光检测器。
各种外部数据输入、处理和呈现系统是可用的并且适合用作计算装置308或与计算装置308结合使用。非限制性示例包括智能手机、平板电脑、笔记本电脑、电脑或其他移动处理单元。数据输入、处理和呈现系统可以以多种方式连接，包括但不限于WiFi、蓝牙和USB，并且可以使用多种协议，例如HL7、ASTM、FHIR标准。
不希望以任何方式受到限制，本发明的优点之一是用户在数据输入、处理和呈现计算装置308中输入临床患者信息，该信息将在临床预测规则中与来自检测装置306的病原体数据组合。非限制性的示例是CRB-65(混乱、呼吸频率、血压、年龄)与检测到的病原体的组合，以用于社区获得性肺炎死亡风险的临床预测。
图4是基于图3的实施方案的非限制性、示例性、说明性和具体示例。与图1、2A-2D和图3中具有相同编号的组件具有相同或至少相似的功能。系统400包含聚合物膜1410，其在该实施方案中优选地进一步包含具有检测标记402的捕获试剂。如图所示，聚合物膜1410优选地包含在采样装置1402中。如图所示，呼吸流过气流路径1406，使得所示的呼吸颗粒和气溶胶撞击在聚合物膜1410上。然后，本文所述的病原体可以单独地和/或与具有检测标记402的捕获试剂组合地被聚合物膜1410捕获。
当洗脱装置1422被放置以与采样装置1402流体连通时，优选地，针116刺穿隔膜118。然后，如前所述，水溶液122可溶解或以其他方式破坏聚合物膜1410。然后，具有溶解的聚合物膜1410、病原体标记物(如果存在)和任选地具有检测标记402的捕获试剂的水溶液122流过流体通道404，其优选地放置在洗脱装置1422的底部。
液体优选地从流体通道404流至基于免疫测定的微流体测定406。微流体测定406包含检测区408和捕获试剂410以检测病原体。
在一些实施方案中，微流体测定406包含侧流测定。如果存在具有检测标记402的捕获试剂，则捕获试剂预期与病原体生物标志物结合。在一些实施方案中，此类标记是与结合病原体抗原的抗体配体偶联的荧光纳米粒子。在可溶解的聚合物膜1410的捕获和溶解之后，病原体生物标志物-捕获试剂-检测标记复合物预期行进至微流体测定406中的检测区408，在那里它们在检测区408处被第二捕获试剂410捕获。在示例性实施方案中，捕获试剂是与病原体抗原特异性结合的抗体或其他配体，标记物是荧光纳米粒子，并且第二配体是与相同病原体抗原结合但不同表位的抗体。在一些实施方案中，可以存在具有检测标记402的几种不同的捕获试剂，并且可以将几种不同的捕获试剂410固定在检测区408处以在多重测定中检测几种不同的病原体。检测装置306可以保持并读取提供信号的检测区域408。如图所示，检测器装置306优选地通过连接312与计算装置308通信连接。
图5示出了分析人呼吸气溶胶的非限制性、示例性、说明性方法。如方法500所示，该流动优选地开始于人类受试者呼气到采样装置502中。然后优选地允许这种呼吸连同包含病原体生物标志物的呼吸颗粒撞击和/或以其他方式接触聚合物膜504。聚合物膜包含水性液体可溶解的聚合物材料。此时，该方法可以在将聚合物膜转移至洗脱装置后继续。或者，该方法如下所描述地继续。
接下来，聚合物膜优选地用来自洗脱装置506的水溶液溶解。此时，该方法可以在将洗脱装置转移至检测系统后继续。
然后允许液体接触检测系统内的微流体测定，然后该检测系统优选地能够检测这样的病原体生物标志物508。数据优选地被传送到数据输入、处理和呈现单元510。基于接收到的临床预测然后可以计算用户在算法中输入的病原体数据和临床数据512。然后可以将最终结果呈现给用户514。
图6示出了非限制性示例性简化的流程，其中在照片中示出了采样装置、检测器和计算装置。在流程600中，当受试者(或患者)在602呼气到采样装置中时，开始呼吸的收集。在604，采样装置优选地与能够检测一种或多种呼吸病原体的检测器流体连通。在606处，如图所示，来自检测器的结果可以被发送到远程装置。
图7A和7B分别示出了先前描述的采样装置和洗脱装置的替代的、任选的实施方案。与图1、2A-2D、3和4中具有相同编号的组件具有相同或至少相似的功能。图7A示出了在任选实施方案中的采样装置1402，其以剖面透视图示出。在该任选实施方案中，采样装置1402优选地包含加速器1414、多个空气狭缝1413和刺穿器702。空气狭缝1413支持用于向采样装置1402中呼吸的减压。刺穿器702可以通过使得水溶液储存器能够被刺穿来支持从聚合物膜1410收集和聚集具有溶解材料的液体。
图7B示出了在任选实施方案中的洗脱装置1422，其以剖面透视图示出。在该任选实施方案中，优选使水溶液122与先前描述的聚合物膜1410接触，之后具有溶解的聚合物膜组分的液体流至流体通道404。这样的液体包含病原体生物标志物、呼吸颗粒、病原体和其部分等。
经由流体通道404，液体然后流至包含侧流测定的微流体测定406。在一些实施方案中，微流体测定406包含如图所示的一个或多个免疫色谱测试条701，用于检测一种或多种病原体生物标志物。
图8示出了先前描述的采样装置和洗脱装置、生物标志物测定的任选实施方案的分解图。与图1、2A-2D、3、4和7A-7B中具有相同编号的组件具有相同或至少相似的功能。
在该实施方案中，管状壳体1404包含先前描述的聚合物膜1410，该聚合物膜1410用保持器元件1416固定。所述保持器元件含有多个空气狭缝1413和一个或多个喷嘴1414a以加速气溶胶颗粒。管状壳体1404还含有与来自所述保持器元件1416的空气狭缝对齐的多个空气狭缝1413。洗脱装置1422优选地包含储存器中的水溶液122并且连接到微流体测定406。板状壳体包含如图所示刺穿器702。穿刺器702优选地使洗脱装置1422的储存器破裂，使得水溶液与聚合物膜1410接触并溶解其中的可溶解的聚合物。然后洗脱液可以流至所述微流体测定406以检测一种或多种病原体生物标志物。
图9示出了用于从呼吸样品中检测一种或多种病原体生物标志物以优选地提供可行的诊断的示例性非限制性计算系统。如系统900中所示，医疗用户计算装置902通过有线或无线连接917至少与检测装置936进行数据通信。检测装置936还可包含如本文所描述的测定和检测器，和/或可额外地或替代地包含本文所描述的其他组件。检测装置936优选地至少能够读取检测一种或多种病原体生物标志物的存在的测定结果。医疗用户计算装置902优选地从检测装置936中接收测定的结果。
医疗用户计算装置902还可以与服务器920通信，例如以传输来自检测装置936的结果，和/或从服务器920中获得患者信息。这样的信息可以单独发送或与结果的分析结合发送，例如，根据特定病症可能出现在特定患者的风险因素和/或总体风险的临床计算。在非限制性示例中，用户在医疗用户计算装置902中输入临床患者信息，该信息将与来自服务器920的患者信息和来自检测装置936的病原体数据组合。替代地或附加地，检测装置936可以直接与服务器920通信。非限制性示例是在医疗用户计算装置902中输入的CURB-65标准(混乱、血尿素氮、呼吸频率、血压、年龄)与病原体数据组合，该病原体数据包括来自检测装置936的流行性感冒A/B、RSV、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳博德特氏菌、人偏肺病毒、副流行性感冒、耶氏肺孢子虫、A组链球菌(GAS)、嗜肺军团菌结果，该结果与来自服务器920的CRP、PCT和胸部X光检查结果的实验室结果相结合，以预测肺炎的死亡风险并提出适当的治疗。
医疗用户计算装置902可以包含用户输入装置904、用户应用程序界面912和用户显示装置906。用户输入装置904可以任选地是任何类型的合适的输入装置，包括但不限于键盘、触摸屏、麦克风、鼠标或其他指示装置等。优选地，用户输入装置904包括麦克风和键盘、鼠标或键盘鼠标组合。
用户应用程序界面912可用于与检测装置936交互，例如传输命令以从检测装置936获得测定结果和/或测定条件或参数。用户应用程序界面912还可用于显示来自服务器920的患者信息和/或分析。
检测装置936任选地且优选地包含通信模块942，用于至少将测定结果传输至医疗用户计算装置902。
医疗用户计算装置902还包含处理器910和存储器911。处理器910的功能优选地涉及由任何合适的计算处理器执行的那些，其通常指的是具有用于实现通信和/或特定系统的逻辑功能的电路的设备或设备的组合。例如，处理器可以包括数字信号处理器装置、微处理器装置、以及各种模拟-数字转换器、数字-模拟转换器和其他支持电路和/或前述的组合。系统的控制和信号处理功能是根据它们各自的能力在这些处理装置之间进行分配的。处理器可以进一步包括基于其计算机可执行程序代码来操作一个或多个软件程序的功能，该计算机可执行程序代码可以存储在存储器(例如在该非限制性示例中的存储器911)中。当本文使用该短语时，处理器可以被“配置为”以多种方式执行某一功能，包括例如通过使一个或多个通用电路通过执行体现在计算机可读介质中的特定的计算机可执行程序代码来执行该功能，和/或通过使一个或多个专用电路执行该功能。
还任选地，存储器911被配置为存储定义的本机指令集的代码。处理器910被配置为响应于接收从存储在存储器911中的定义的本机指令集的代码中选择的相应基本指令来执行定义的基本操作集。例如但不限于，存储器911可以存储从本机指令集中选择的第一集机器代码用于通过用户应用程序界面912接收来自用户的信息请求，从本机指令集中选择的第二集机器代码用于从服务器920传输这样的信息，从本机指令集中选择的第三集机器代码用于从检测装置936请求结果以及从本机指令集中选择的第四集机器代码用于从检测装置936接收这样的结果。
类似地，服务器920优选地包含处理器930和具有机器可读指令的存储器931，该机器可读指令具有相关或至少相似的功能，包括但不限于如本文所描述的服务器920的功能。例如但不限于，存储器931可以存储从本机指令集选择的第一集机器代码，用于从医疗用户计算装置902接收对患者信息和/或分析的请求，从本机指令集中选择的第二集机器代码用于执行分析引擎934的功能，以及从本机指令集中选择的第三集机器代码，用于将这样的信息和/或分析传输到医疗用户计算装置902。任选地，存储器931存储了从本机指令集中选择的第四集机器代码，用于从医疗用户计算装置902接收测定结果信息。
任选地且优选地，检测装置936包含处理器938和存储器940，它们可以例如以SOC(片上系统)的形式组合，或者组合为任何合适的微处理器组合。存储在存储器940上的指令由处理器938执行。例如但不限于，存储器940可以存储从本机指令集选择的第一集机器代码用于确定一个或多个测定结果、从本机指令集选择的第二集机器代码用于从医疗用户计算装置902接收这样的结果的请求、以及从本机指令集中选择的第三集机器代码用于将这样的结果传输到医疗用户计算装置902。
还任选地且优选地，检测装置936包含用于检测测定结果的检测器944，例如呼吸样品中病原体生物标志物的存在的指示物。
图10示出了用于接收多个这样的测定结果、分析它们(任选地与其他信息组合)、然后传输和/或存储它们的非限制性示例性系统。与图9具有相同引用编号的组件具有相同或至少相似的功能。
系统1000的特征是多个医疗用户计算装置902，其中示出了两个：医疗用户计算装置902A和医疗用户计算装置902B，这仅是为了说明的目的并且没有任何限制的意图。系统1000的特征还在于多个检测装置936，其中示出了两个：检测装置936A和检测装置936B，这仅是为了说明的目的并且没有任何限制的意图。检测装置936A和936B中的每一个优选地能够至少读取测定结果并将它们分别传输至医疗用户计算装置902A和902B。每个这样的检测装置936还能够接收气溶胶样品并检测本文所描述的至少一种测定的结果，以检测至少一种呼吸道病原体的存在。如先前所描述的，医疗用户计算装置902A和902B中的每一个优选地能够将这样的结果传输到服务器920，并且还任选地能够接收返回的临床分析和/或患者信息。如先前所描述的，检测装置936A和936B中的每一个任选地进一步能够将这样的结果直接传输到服务器920(未示出)。
服务器920优选地还能够将这样的结果传输至患者计算装置1002。任选地，患者计算装置1002能够传输患者详细资料，包括但不限于一种或多种患者症状、当前病历、先前病历等。服务器920任选地且优选地还能够与医院计算装置1004通信，例如以传输结果和/或临床分析，和/或接收患者信息。医院计算装置1004可以是任何合适的医疗设施计算装置。服务器920任选地且优选地还能够与医疗记录计算装置1006通信，例如以获得患者医疗记录信息和/或传输测定结果，任选地与本文所描述的分析一起。服务器920任选地并且优选地还能够与实验室计算装置1008通信，例如以传输结果和/或临床分析，和/或接收实验室结果。实验室计算装置1008可以是任何合适的实验室设施计算装置。
图11A和图11B示出了在暴露于人呼吸气溶胶之前(图11A)和之后(图11B)，在支撑物上的电纺纤维的非限制性示例性扫描电子显微镜(SEM)图像。图像1101示出了在暴露于呼吸气溶胶之前，在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)支撑网1103(例如Sefar Nitex 03-130/52,Sefar AG,Switzerland)上，具有大约300nm直径的纤维1102的电纺壳聚糖/聚氧化乙烯(PEO)(质量比8:2)纳米纤维垫。SEM图像1111示出了在暴露于人类呼吸气溶胶2分钟后，相同的壳聚糖/聚氧化乙烯(PEO)纤维垫1102。除了材料的一些膨胀外，纳米纤维垫对人呼吸气溶胶显示出高度稳定性，并保持了其病原体收集效率。
优选地，本文所描述的在所有各种采样装置中使用的水溶液可溶解的聚合物膜包括在PVA箔上电纺的PVA纤维。优选地，PVA具有范围为4至65mPa*s的粘度(粘度是在20℃在4％的H2O中测量的)，并且水解度为70至93％。在示例性实施方案中，PVA具有8mPa*s的粘度和88％的水解度。
图12A和12B示出了先前描述的采样装置的替代的、任选的、示例性实施方案。如对于图12A所示，装置1200含有吹口1201、任选的吸入阀1202和采样装置1402，采样装置1402含有在支撑网1103上的可溶解的聚合物膜。在优选实施方案中，聚合物膜是支撑网上的纳米纤维垫以收集气溶胶颗粒，例如如图11A所示。图12B示出了示例性、非限制性、集中实验室测试用例过程1210，其中装置1200用于呼吸气溶胶的收集1221。该过程继续进行，随后将在标记的样品袋1211中的含有所述聚合物膜以及收集的气溶胶颗粒的采样装置1402邮寄1222到中央实验室设施。在洗脱过程1223中，采样装置1402插入螺纹盖1213和含有水溶液122的标准管的洗脱装置1422之间。举例来说，含有水溶液122的管和盖1213可以定制或者是含有PCR运输培养基的标准集中实验室管，例如来自cobas PCR介质套件(RocheDiagnostics,Switzerland)或通用病毒运输(UVT)系统(Becton Dickinson,USA)的试管。
在将采样装置1402一端连接到管1422，并在另一端将采样装置1402和螺纹盖1213连接后，将系统上下翻转以通过使所述可溶解的聚合物膜由于重力作用而与水溶液接触来溶解水溶液可溶解的聚合物膜。在溶解和洗脱所收集的病原体和/或生物标志物之后，可以移除并处置采样装置1402，并且可以优选地使用自动化高通量分析仪在标准集中式实验室工作流程中测试1224在洗脱装置1422中包含病原体和/或者生物标志物的所得液体洗脱液。非限制性实例包括分析在洗脱液中的病原体核酸1214的分子测定和抗原检测测定。测试完成后，结果通过安全通信通道1215发送回患者或医疗保健提供者1225。举例来说，可以通过具有基于广泛可用的用于结果传输的互操作性标准(例如HL7、ASTM或FHIR)的协议的互联网来提交结果。举例来说，用在如平板计算机或智能手机1216的便携式设备上运行的应用程序将结果呈现给患者或医疗保健提供者。举例来说，采样装置1402还可以与螺纹盖1213和具有水溶液122的洗脱装置1422一起运输和/或储存，因为水溶液可以在储存和/或运输期间帮助稳定病原体和/或生物标志物。水溶液还可以灭活病原体，以便安全运输和储存。
图13示出了先前描述的采样装置的替代的、任选的实施方案。图13的采样装置1402包含管状壳体1404，管状壳体1404在一端具有流入口1408，在与流入口1408相对的另一端具有流出口1409。气溶胶从流入口1408至流出口1409沿着气流路径1406从受试者流中呼出。管状壳体1404优选为两件式设计。两个部分借助于两个部分的螺纹接合或夹紧接合而保持在一起。为此，设置在下部上端的外螺纹与设置在上部下端的内螺纹接合。
水溶液可溶解的聚合物膜1410由膜支架1412支撑，膜支架1412在垂直于图13中的气流路径1406的平面中延伸到管状壳体1404中。聚合物膜1410的上游设置有加速器1414。加速器1414优选地包括一个或多个充当加速器1414的喷嘴，因为当气溶胶颗粒流过喷嘴1414a时，喷嘴加速气溶胶颗粒。加速器1414的喷嘴1414a优选地在管状壳体1404的内径上彼此等距间隔开。仅作为比较，加速器1414的上游形貌由于其会聚的喷嘴进口而类似于蜂窝结构的形貌。
加速器1414通过保持器元件1416保持就位，根据图13中所示的示例性实施方案，保持器元件1416被夹在管状壳体1404的上部部分和下部部分之间。保持器元件1416优选地与加速器1414形成为一体式部分，卡扣到膜支架1412中以夹紧聚合物膜1410并将其保持就位。
加速器1414优选地包括83个喷嘴1414a。喷嘴1414a的数量可取决于管状壳体1404的直径，但优选地在25至200的范围内。喷嘴1414a各自具有喷嘴开口，该喷嘴开口优选地具有0.78mm的直径并且具有会聚的锥形喷嘴入口几何构造(文丘里型几何构造)以促进气溶胶颗粒流过喷嘴1414a的加速并减少在气溶胶颗粒采样期间的呼吸阻力。喷嘴1414a的直径可取决于喷嘴1414a的总数，但优选地范围为从0.2mm至1.5mm。优选地，加速器1414中的所有喷嘴开口的面积之和在从20至65mm2的范围内。
加速器1414的上游设有螺纹1418，其可用于将封闭件(未示出)与螺纹接合以封闭流入口1408。螺纹1418可以是内螺纹或外螺纹，这取决于封闭件的类型。例如，螺纹1418可以是设置在壳体1404的内表面上的内螺纹，以引入螺纹塞或盖来封闭流入口1408。
另一个螺纹1420设置在聚合物膜1410的下游，这可用于将用于溶解聚合物膜1410的洗脱装置1422拧入管状壳体1404中。
还如图13所示，洗脱装置1422是具有封闭端1424和与封闭端1424相对的开放端1426的管。外螺纹1428设置在开放端1426附近，其可被带入到与设置在采样装置1402的管状壳体1404内部的聚合物膜1410下游的内螺纹1420接合。
可以想到的是，通过将封闭件与螺纹1420接合来封闭流出口1409，并且使用螺纹1418来与洗脱装置1422接合。
代替螺纹1420，采样装置1402可以很好地设置有任何类型的接合方式，以使洗脱装置1422与采样装置1402的管状壳体1404可释放地接合。这样的接合方式可以是夹紧方式、刺穿方式(例如在图1中所示的针116)、螺纹接合方式(例如在图13中所示)、或者适合于将洗脱装置1422与采样装置1402的管状壳体1404可释放地接合的其他类型的连接或紧固方式，以便在洗脱装置1422和采样装置1402的管状壳体1404的内部之间提供流体连通路径。
相同或相似的考虑可应用于螺纹1418。
图13中所示的采样装置1402被优化以有效收集存在于具有低呼吸阻力的人呼吸气溶胶颗粒中的病原体，并随后溶解聚合物膜1410，然后容易地将样品收集到洗脱装置1422(例如标准实验室管)中。
图14A以透视剖面侧视图示出了图13的采样装置1402的细节。在图14A的实施方案中的加速器1414包含多个喷嘴1414a并且设置在聚合物膜1410的上游。聚合物膜1410由加速器1414下方的膜支架1412支撑。膜支架1412被配置成当聚合物膜1410与洗脱装置1422提供的水溶液接触时，使得聚合物膜1410的足够大的表面被暴露以允许聚合物膜1410溶解。为此目的，一旦将洗脱装置1422拧入采样装置1402的管状壳体1404中，采样装置1402与洗脱装置1422一起上下翻转，从而导致水溶液从洗脱装置1422流出，进入采样装置1402的管状壳体1404并通过重力作用经由膜支架1412中的开口1411与聚合物膜1410接触。
加速器1414在气溶胶的流动方向上与聚合物膜1410间隔开，以允许气溶胶首先流过喷嘴1414a，随后空气通过狭缝1413径向向外逸出。由于在气溶胶中含有的气溶胶颗粒的重量较重，这些颗粒撞击到聚合物膜1410上，而没有这些颗粒的空气的主气流通过狭缝1413径向向外逸出。狭缝1413因此可以被认为是旁路并且优选地围绕聚合物膜1410的圆周的至少一部分布置。
图14B示出了气溶胶和在气溶胶中含有的气溶胶颗粒200的气流路径1406。含有气溶胶颗粒200的气溶胶首先流过加速器1414。气溶胶颗粒200然后撞击到聚合物膜1410上，而气流继续径向向外流动通过狭缝1413，直到气流在管状壳体1404的内表面上偏转，并且在聚合物膜1410下方再次会聚，以再次沿着主气流路径1406流动。
实施例1-用于从模拟呼吸气溶胶中收集分枝杆菌的采样装置并使用商业结核病PCR测定进行洗脱和检测的评估
该非限制性实施例涉及说明性采样装置和洗脱装置，用于从模拟人呼吸气溶胶中收集分枝杆菌并洗脱，并随后使用商业TB测定进行检测。
材料和方法
可溶解的聚合物膜
通过将溶解的壳聚糖和PEO以8:2的壳聚糖:PEO的质量比混合，然后用NanospiderNS Lab 500(Elmarco,Czech Republic)将溶液自由表面静电纺丝到PET支撑网(SEFARMEDIFAB 07-20/23)上来制备纳米纤维。所得电纺壳聚糖/PEO纳米纤维垫具有约10μm的厚度并且如图11A中所说明的纳米纤维具有约300nm的直径。支撑网上的纳米纤维垫是通过冲压直径为19mm的圆形膜来切割的。
采样装置
由聚酰胺12(PA2200,EOS GmbH,Germany)制成的3D打印定制采样装置壳体，具有22mm的外径，20mm的内径，85mm的长度。将PET支撑网上含有聚合物材料的聚合物膜固定在定制的PA2200保持器元件和膜支架之间，并放置在采样装置壳体的流动路径中。采样装置设计如图12A所说明。
模拟人呼吸气溶胶
将牛分枝杆菌BCG(1.91x 10ex8 cfu/ml)在0.067M磷酸盐缓冲液pH 6.8中以不同浓度稀释，并使用Cirrus2雾化器(Intersurgical,UK)以6l/min使用HEPA过滤的空气雾化到定制的玻璃室(长度60cm，直径8cm)中。以与阴性对照相同的方式雾化分子级水。使用SFM3300-AW数字流量计(Sensirion,Switzerland)测量空气流速。
采样
将玻璃室的出口连接至采样装置的入口，以进行2分钟采样。Cirrus2雾化器和牛分枝杆菌BCG cfu/ml值的重量差用于计算暴露于采样装置的细菌负荷。采样装置的出口连接至含有缓冲液的5ml BioSampler(SKC,USA)。
洗脱
在气溶胶采样之后，采样装置(由两个PA2200保持器元件和PET支撑网上的纳米纤维垫组成)连接至如图12B所说明的洗脱装置1422。洗脱装置是直径为16mm的标准实验室管，并且采样装置1402被设计成使得其与洗脱装置1422可释放地接合。该管含有1.5ml的pH为6.8的0.067M磷酸盐缓冲液作为洗脱液体。在将洗脱装置1422与采样装置1402和盖1213连接后，将该布置上下翻转2分钟以洗脱收集的BCG细菌。在再次转动布置之后，通过移除采样装置并通过用盖子封闭洗脱装置来将洗脱液收集在洗脱装置中。
DNA检测
使用FluoroLyse(Hain Lifescience,Germany)从洗脱装置的0.5ml的水溶液中分离DNA，并使用FluoroType MTB(Hain Lifescience,Germany)在FluoroCycler 12实时PCR循环仪(Hain Lifescience,Germany)上如用户说明中所描述的使用IS6110定向PCR检测BCG。
结果
图15显示了明显阳性1302和阴性样品1303的典型熔解曲线图1301。阳性样品熔解曲线图1302显示了内部测定对照DNA 1304的峰以及BCG IS6110扩增子1305的峰。阴性样品熔解曲线图1303仅显示内部测定对照DNA 1304的峰，但没有BCG IS6110扩增子1306的峰。实验的检测限(LOD)为在12升气溶胶中402cfu或每升气溶胶33cfu BCG。由于BCG只有一个IS6110基因拷贝，当假设结核分枝杆菌有16个IS6110拷贝时，这等于每升气溶胶中2cfu结核分枝杆菌的LOD。
实施例2-呼吸阻力的测量
该非限制性实施例涉及用于收集用于确定呼吸阻力的人呼吸气溶胶颗粒的说明性采样装置。
材料和方法
可溶解的聚合物膜-以与实施例1中所描述的相同的方式制备纳米纤维。
采样装置-采样装置以与实施例1中所描述的相同的方式制备
呼吸阻力的测量
通过施加20l/min的恒定气流并通过使用T形件连接器在采样装置的入口和出口处连接SDP800压差传感器(Sensirion,Switzerland)测量压降来测量含有可溶解的聚合物膜的采样装置的呼吸阻力。
结果
以可溶解的聚合物膜作为过滤器的采样装置的呼吸阻力为419Pa。此呼吸阻力足够低以收集呼出气体而不使患者承受压力。
实施例3-具有空气动力学和电纺纳米纤维垫的采样装置
该非限制性实施例涉及说明性的采样装置，其具有带有可溶解的纤维聚合物膜的空气动力喷嘴。
采样装置设计与生产
采样装置设计如图13、14A和14B中所示。能够用50％效率(d50)收集的颗粒尺寸为0.9μm。因此，采样装置在气流大于30l/min以及大于1μm的颗粒但呼吸阻力低时达到对气溶胶颗粒的高收集效率。
聚合物膜生产
具有纳米纤维的聚合物膜是通过10wt％聚乙烯醇(PVA)水溶液的针式静电纺丝制备的。该合成的、生物相容的、无毒的PVA具有的粘度范围为8mPa*s，并且水解度为88％。将悬浮液加热至>80℃以溶解PVA，并在溶解后冷却至环境温度。在Fluidnatek LE-100(Nanoscience Instruments,Phoenix,AZ)上在转鼓收集器上的可溶解聚合物箔上进行静电纺丝。所得平均纤维直径为88-442nm，并且纳米纤维垫厚度为10-20μm。所得聚合物膜由聚合物箔上的纳米纤维垫组成，用21mm直径的冲孔工具冲孔并放置在采样装置内。将聚合物膜放置在膜支架中并由保持器元件夹紧，且纳米纤维垫面向喷嘴出口。
实施例4-来自实施例3的用于从模拟呼吸气溶胶中收集、洗脱和检测分枝杆菌的采样装置并结合三种分子TB测定的表征
该非限制性实施例涉及来自实施例3的优化的说明性采样装置，用于收集分枝杆菌气溶胶颗粒，且使用洗脱装置洗脱，并随后使用三种商业分子TB测定进行检测。
材料和方法
模拟分枝杆菌气溶胶
牛分枝杆菌BCG库存(7.19x106 cfu/ml)在补充有10％ Middlebrook OADC生长补充剂的7H9肉汤中稀释600倍(“中等”)、1500倍(“低”)和7500倍(“极低”)。使用相同补充的7H9肉汤但不含BCG来生成“阴性”样品。用Cirrus2雾化器(Intersurgical,UK)使用HEPA过滤空气以6l/min雾化150至170mg的这些具有不同细胞浓度的BCG悬浮液或阴性样品，以在气溶胶中达到1992cfu(“中等”)、797cfu(“低”)、159cfu(“非常低”)、0cfu(“阴性”)的平均BCG水平。雾化器出口连接到T形件，用6l/min HEPA过滤的空气稀释气溶胶，以实现12l/min的总质量流量。空气流量由两个SFC5500质量流量控制器(Sensirion,Switzerland)控制。将具有稀释气溶胶的T形件的输出连接到采样装置的入口，每次实验采样35秒。
洗脱
在收集气溶胶颗粒后，洗脱装置是标准实验室管，其含有2ml的1x TE缓冲液pH8.5(10mM Tris,1mM EDTA)，通过在出口侧上的螺纹连接到采样装置。采样装置通过在入口侧上的螺纹用塞子封闭。在将采样装置与实验室管和塞子封闭后，将布置上下翻转持续2-4分钟，以便TE缓冲液与聚合物膜接触来溶解聚合物膜，从而洗脱收集的BCG细菌。在再次转动布置后，洗脱液流入到洗脱装置/管中，并移除采样装置。管中的洗脱液用于随后的三项分子核酸扩增测试(NAAT)分析。
用三种不同的NAAT进行DNA检测
用3种NAAT测试来自洗脱装置的液体样品，用于IS6110定向的BCG检测。
对于第一个测试，GeneXpert MTB/RIF Ultra(Cepheid,USA)，将1.5ml XpertUltra样品试剂直接添加到1ml的洗脱液，涡旋10秒，并在环境温度总共孵育15分钟。在孵育期5至10分钟之间，将样品再次涡旋10秒。在孵育后，将2.5ml的全部体积添加到测试盒中，并在GeneXpert GX-IV PCR分析仪上运行。
在第二次和第三次测试之前，通过将0.2ml洗脱液在加热块中在95℃在1000rpm孵育15分钟来进行简单的热裂解。在10000rpm离心5分钟后，上清液直接用作两次测试的样品。使用6μL作为Hain FluoroType MTB(Hain Lifescience,Germany)的样品，其在FluoroCycler 12PCR循环仪(Hain Lifescience,Germany)上运行，并按照用户说明中所描述的进行测试。30μL用作等温Loopamp MTBC检测套件(Human Diagnostics,Germany)的样品，其在LA-500Loopamp即时浊度计(Eiken,Japan)上运行，并按照用户说明中所描述的进行测试。
结果
表1示出了采样装置和洗脱装置与使用三种NAAT的检测相结合的84个气溶胶实验的结果。在所有实验中，对于所有三种测试，用采样装置收集并用洗脱装置洗脱的阴性气溶胶保持阴性(N＝21)。Loopamp MTBC和FluoroType MTB在所有三个水平(中等、低和极低)对100％含BCG的气溶胶都产生了阳性结果。这包括“非常低”的水平，其表明在6.4升气溶胶中159cfu BCG的细菌负载的可重复收集、洗脱和检测。Xpert MTB/RIF Ultra检测到所有“中”和“低”样品以及50％的“非常低”样品。
结核分枝杆菌(Mtb)含有16个IS6110基因拷贝，而BCG仅含有1个IS6110基因拷贝。因此，对于这些测试，Mtb的分析灵敏度预计比BCG的分析灵敏度低16倍，这表明采样装置和洗脱装置与NAAT一起能够检测在6.4升气溶胶中的10cfu Mtb。
表1
实施例5-来自实施例3的采样装置的呼气流速和呼吸阻力
材料和方法
呼出空气流速
通过将采样装置连接到SFM3300质量流量传感器(Sensirion)并要求参与者深吸气并向采样装置吹气/呼气来测量3名参与者(2名女性、1名男性)的呼出空气流速。
压降测量
通过确定10至80l/min之间不同空气质量流速的压降来测量10个采样装置的呼吸阻力(总共80次测量)。使用PREMASGARD 1115-I LCD(S+S Regeltechnik,Germany)差压传感器测量采样装置上的压降。空气流速由SFC5500质量流量控制器(Sensirion,Switzerland)控制。
结果
呼气流量
图16示出了3名参与者的呼气流速。典型的呼气流速峰值范围在40至70l/min之间。采样一分钟，呼气量范围为从1.2至4.1l，并且总量范围为从16至29l。
压降测量
图17示出了来自10个采样装置的平均压降以及在不同空气质量流速的95％置信区间。采样装置在40l/min时的平均压差(或呼吸阻力)低于1000Pa。采样装置在50l/min时的平均压差低于1500Pa。采样装置在60l/min时的平均压差低于2000Pa。这种呼吸阻力足够低以收集呼出的气体，而不使患者承受压力。
实施例6-对照DNA在可溶解的聚合物膜中的沉积
对照DNA(以及可能的其他试剂)可以掺入到可溶解的膜中。然后可以在随后的多重PCR中检测对照DNA，以确保一切按预期进行。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，旨在将所有这样的替代、修改和变化包括在本申请的公开内容内。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本说明书中，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入本文的程度相同。另外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。

Claims (39)

1.采样装置(1402)，其用于收集人或动物的呼吸样品中含有的气溶胶颗粒(200)，其目的是对呼吸样品中存在的非挥发性呼吸道病原体进行采样，所述采样装置(1402)包含：
壳体(1404)，其具有用于呼吸样品流入所述壳体(1404)的流入口(1408)和用于所述呼吸样品流出所述壳体(1404)的流出口(1409)，所述呼吸样品从所述流入口(1408)到所述流出口(1409)的流动限定了所述呼吸样品的流动路径(1406)，
水溶液可溶解的聚合物膜(1410)，其被布置在所述流入口(1408)和所述流出口(1409)之间的所述壳体(1404)内并在所述呼吸样品的所述流动路径(1406)中，以收集在所述呼吸样品中含有的气溶胶颗粒，以及
接合方式(1420)，其用于将洗脱装置(1422)可释放地接合至所述壳体(1404)以将水溶液(122)引入到所述壳体(1404)中，并用于在与所述水溶液(122)接触时溶解所述聚合物膜(1410)。
2.权利要求1所述的采样装置(1402)，其中所述接合方式(1420)被布置成使得所述洗脱装置(1422)可释放地连接至所述聚合物膜(1410)下游的所述壳体(1404)。
3.权利要求1或2所述的采样装置(1402)，其中所述接合方式包括螺纹(1420)。
4.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述接合方式是设置在所述壳体(1404)的内表面上的内螺纹(1420)。
5.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述接合方式(1420)被配置成使得含有水溶液(122)并且通常用于准备选自核酸扩增测试(NAAT)、PCR测定、等温扩增测定、DNA杂交测定、基于CRISPR的测定、测序测定和免疫测定的测定的实验室管(1422)可释放地连接至所述壳体(1404)。
6.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中螺纹(1418)设置在所述聚合物膜(1410)上游的所述壳体(1404)上，并且其中所述螺纹(1418)与螺纹封闭件(1213)接合以关闭所述壳体(1404)的所述流入口(1408)。
7.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中加速器(1414)布置在所述聚合物膜(1410)上游的所述壳体(1404)内部。
8.权利要求7所述的采样装置(1402)，其中所述加速器是具有多个喷嘴(1414a)的喷嘴布置(1414)，并且其中每个喷嘴(1414a)限定喷嘴开口，并且其中所述喷嘴布置(1414)延伸进入所述呼吸样品通过所述壳体(1404)的所述流动路径(1406)中，并且所述喷嘴布置的尺寸使得流过所述壳体(1404)的所述流入口(1408)的所有所述呼吸样品流过所述喷嘴布置(1414)。
9.权利要求8所述的采样装置(1402)，其中在所述加速器(1414)中的所有喷嘴开口(1414a)的面积之和是在20mm2至65mm2之间的范围内。
10.权利要求7至9中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述加速器(1414)在所述呼吸样品通过所述壳体(1404)的所述流动路径(1406)的方向上与所述聚合物膜(1410)间隔开，从而形成流动旁路(1413)，其至少部分地围绕所述聚合物膜(1410)延伸以允许所述呼吸样品的至少一部分绕过所述聚合物膜(1410)。
11.权利要求10所述的采样装置(1402)，其中在所述加速器(1414)和所述聚合物膜(1410)之间的距离是在2mm至7mm之间的范围内。
12.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)具有在0.5μm至50μm之间的范围内的厚度。
13.权利要求12所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)包括选自聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖、聚氧化乙烯(PEO)、普鲁兰多糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯丙烯酸(PVAc)、聚甲基丙烯酸(PMAc)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)或其组合的聚合物薄膜。
14.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)包含纤维(1102)。
15.权利要求14所述的采样装置(1402)，其中所述纤维(1102)具有在20nm至1μm之间的范围内的直径。
16.权利要求14或15所述的采样装置(1402)，其中所述纤维(1102)选自聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖、聚氧化乙烯(PEO)、普鲁兰多糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯丙烯酸(PVAc)、聚甲基丙烯酸(PMAc)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)或其组合。
17.权利要求14至16中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述纤维(1102)包含比例为8:2的壳聚糖/聚氧化乙烯(PEO)的混合物。
18.权利要求14至17中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)进一步包含厚度在40μm至500μm之间的范围内的聚合物支撑网(1103)以支撑所述纤维。
19.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)在呼吸样品暴露的1至6分钟期间是稳定的，并且其中所述聚合物膜(1410)在水溶液中的溶解是由pH值的变化引发的。
20.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)包含粘度范围为4-65mPa*s、优选为8mPa*s，并且水解度为70-93％，优选88％的聚乙烯醇(PVA)。
21.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)包含与存在于所述呼吸样品中的所述气溶胶颗粒中的所述病原体结合的配体功能化珠子。
22.权利要求21所述的采样装置(1402)，其中所述配体功能化珠子选自磁珠、荧光纳米球和金纳米颗粒。
23.权利要求21或22所述的采样装置(1402)，其中所述配体选自抗体、适体、肽和甘露糖结合凝集素。
24.权利要求21至23中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述配体是与脂阿拉伯甘露聚糖结合的抗体。
25.权利要求24所述的采样装置(1402)，其中所述抗体与α(1→2)-连接的吡喃甘露糖结合。
26.权利要求21至25中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)被配置成使得所述配体功能化珠子在溶解时以适合用于生物标志物检测的方式被释放。
27.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)被配置成使得其在小于4分钟内溶解在水溶液中。
28.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述聚合物膜(1410)含有选自对照核酸、引物、探针、核苷酸、酶、盐或其组合的测定试剂。
29.前述权利要求中任一项所述的采样装置(1402)，其中所述采样装置(1402)是用于收集人呼吸生物气溶胶中存在的气溶胶颗粒的手持式采样装置。
30.用于收集和洗脱人或动物的呼吸样品中含有的气溶胶颗粒的系统(1400)，其目的是对呼吸样品中存在的非挥发性呼吸道病原体进行采样，所述系统(1400)包含：
权利要求1至29中任一项所述的采样装置(1402)，以及
洗脱装置(1422)，其通过所述采样装置(1402)的接合方式(1420)可释放地连接到壳体(1404)用于将水溶液(122)引入到所述壳体(1404)中，以用于在与所述水溶液(122)接触时溶解聚合物膜(1410)，并且在所述聚合物膜(1410)溶解时，用于接收洗脱液。
31.权利要求30所述的系统(1400)，其中所述洗脱装置(1422)是具有封闭端(1424)和与所述封闭端(1424)相对的开放端(1426)的管，并且其中外螺纹(1428)设置在所述洗脱装置的所述开放端(1426)处，所述外螺纹(1428)可与所述采样装置(1402)的所述壳体(1404)的内螺纹(1420)接合。
32.权利要求31所述的系统(1400)，其中所述洗脱管(1422)具有在0.2ml至4.5ml范围内、特别是2.0ml的样品体积以及在10mm至30mm范围内的直径。
33.用于收集、洗脱和检测人或动物呼吸样品中存在的非挥发性呼吸道病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)产生通过采样装置(1402)的流入口(1408)的人或动物的呼吸样品流；
b)用布置在所述采样装置(1402)内部的水溶液可溶解的聚合物膜(1410)吸附在所述呼吸样品中含有的气溶胶颗粒；
c)将所述采样装置(1402)连接至含有水溶液(122)的洗脱装置(1422)；
d)通过使所述水溶液(122)与所述聚合物膜(1410)接触来溶解所述聚合物膜(1410)；以及
e)在测定中检测病原体。
34.权利要求33所述的方法，其中在步骤c)和步骤d)之间，所述采样装置(1402)与所述洗脱装置(1422)一起被上下翻转。
35.权利要求33或34中任一项所述的方法，其中所述病原体是呼吸道感染，特别是下呼吸道感染。
36.权利要求33至35中任一项的方法，其中所述病原体选自腺病毒、博卡病毒、冠状病毒、汉坦病毒、人偏肺病毒、人鼻病毒/肠道病毒、流行性感冒A、流行性感冒B、副流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、阴沟肠杆菌复合体、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、产气克雷伯菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌族、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、肺炎支原体、结核分枝杆菌、结核分枝杆菌复合体、耶氏肺孢子菌、A族链球菌(GAS)。
37.权利要求33至36中任一项所述的方法，其中用于检测所述病原体的所述测定是选自核酸扩增测试(NAAT)、PCR测定、等温扩增测定、DNA杂交测定、基于CRISPR的测定、测序测定和免疫测定的测定。
38.权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述水溶液(122)是含有至少一种由以下组成的缓冲液：TRIS、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫氰酸胍、盐酸胍、HEPES、通用运输培养基(UTM)、液体amies运输培养基、吐温20、Triton X100、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、氯化钠、磷酸盐缓冲盐水、Hank’s平衡盐溶液、牛血清白蛋白、L-半胱氨酸、明胶、蔗糖、谷氨酸、万古霉素、两性霉素B、粘菌素、酚红、氢氧化钠、异丙醇或其组合。
39.权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述方法使用权利要求30至32中任一项所述的采样系统(1400)。
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