CN108359675A - 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法 - Google Patents

一种获得双筛选标记转基因玉米的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108359675A
CN108359675A CN201810164532.7A CN201810164532A CN108359675A CN 108359675 A CN108359675 A CN 108359675A CN 201810164532 A CN201810164532 A CN 201810164532A CN 108359675 A CN108359675 A CN 108359675A
Authority
CN
China
Prior art keywords
screening
carriers
riddled basins
present
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810164532.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张方东
杜邓襄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201810164532.7A priority Critical patent/CN108359675A/zh
Publication of CN108359675A publication Critical patent/CN108359675A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了一种获得双筛选标记转基因玉米的方法，属于玉米生物技术育种领域。本发明以EGFP和Bar基因的融合基因作为筛选标记基因，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚中，筛选得到双筛选标记转基因玉米，通过绿色荧光与除草剂梯度混合筛选，选用1mg/L除草剂、3mg/L除草剂和绿色荧光筛选的筛选方法，经过1个周期的筛选就可以得到94.23％的阳性率，并可以获得充足的转基因单株，可以极大地缩减筛选周期，大大提高了筛选精度，提高了转基因效率，适用于玉米转基因技术的规模化应用。

Description

一种获得双筛选标记转基因玉米的方法
技术领域
本发明属于玉米生物育种技术领域，更具体的涉及一种获得双筛选标记转基因玉米的方法。
背景技术
玉米(Zea mays L.)，学名玉蜀黍，是重要的粮食作物，也是重要的饲料和工业原料，在国民生计和经济建设中起着至关重要的作用。近几年育种应用中，育种家综合应用常规育种、分子生物技术和生物信息学，大大缩短育种的周期，在资源消耗不增加甚至减少的情况下，提高种质资源筛选和改良的效率。以分子遗传学为基础的现代生物技术的发展与应用，尤其是转基因技术的应用实现了育种性状的定点突变，破解种质资源狭窄、改良速度缓慢这个困扰我国玉米育种发展的困境。
转基因技术本质上是通过目标基因的交流实现的，与常规育种技术没有本质区别，而且在技术上，转基因育种技术改良的遗传信息更清楚、更明确、更具体，选择效率高。虽然与传统育种技术有些差异，转基因技术对传统育种技术并不排斥，作为常规技术的延伸和发展，它与常规技术的结合可相得益彰，提高品种改良效率的同时，也可以综合培育出多抗、优质、高产、高效新品种。有效的筛选是转基因系统的最关键的部分之一，将转化细胞从未转化细胞中分离出来，选择标记的存在提高了转基因的效率。
玉米转基因常采用抗生素或除草剂抗性基因作为选择标记基因，主要是通过负向筛选来进行的。标记基因表达的转化细胞对相应的抗生素或除草剂产生抗性，可以在筛选过程中存活、增殖，同时未转化细胞生长被抑制或被杀死，成功从未转化细胞中分离出转化细胞，另一方面，理想的选择剂也不应对随后的再生、生根和植物生长产生负面影响。但是目前并没有一种高效的转基因玉米植株获得方法，如GAT蛋白作为草甘膦筛选标记最早开始用于2004年，McCutchen等使用改良的GAT基因进行草甘膦筛选，经过150至200天的筛选，获得了64％的筛选效率，不仅周期长，而且筛选准确率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种获得双筛选标记转基因玉米的方法，在玉米遗传转化及筛选过程中可以有效缩短筛选周期，提高筛选准确率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种双筛选标记基因，所述双筛选标记基因为EGFP和Bar基因的融合基因，所述筛选标记基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种获得含所述双筛选标记基因的玉米转基因方法，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚中，筛选得到双筛选标记转基因玉米；所述筛选包括依次进行的：绿色荧光正向筛选、除草剂抗性反向筛选和PCR筛选。
优选的，所述农杆菌介导的遗传转化方法使用的转化载体为pHZM3载体，所述pHZM3载体为去除pEGAD载体中草丁膦抗性基因Bar的完整表达框后，再将pEGAD载体中的绿色荧光蛋白GFP表达框替换为所述筛选标记基因的载体。
优选的，所述pHZM3载体的构建方法包括以下步骤：
1)将所述筛选标记基因连接到pUC57载体上进行筛选标记基因的克隆，得到克隆后的筛选标记基因；
2)利用BamH I和Hind III双酶切所述克隆后的筛选标记基因，得双酶切后的筛选标记基因；
3)采用Sam I对pEGAD载体进行酶切，去除pEGAD载体上的草丁膦抗性基因Bar的完整表达框，得无Bar基因的pEGAD载体；
4)将步骤2)得到的所述双酶切后的筛选标记基因与步骤3)所述无Bar基因的pEGAD载体进行连接，得到转基因载体pHZM3；
步骤1)、2)分别与步骤3)没有时间先后顺序的限定。
优选的，所述筛选包括依次进行的：绿色荧光正向筛选、除草剂抗性反向筛选和PCR筛选。
优选的，所述绿色荧光正向筛选和除草剂抗性反向筛选的筛选次数独立地为2～3次。
优选的，所述PCR筛选时所使用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示。
本发明提供了一种获得双筛选标记转基因玉米的方法，以EGFP和Bar基因的融合基因作为筛选标记基因，经过一轮筛选可获得94.2％的转基因频率，大大提高了筛选精度，缩短了筛选时间，提高了转基因效率，适用于玉米转基因技术的规模化应用。
附图说明
图1为转基因载体pHZM3的结构示意图；
图2为绿色荧光筛选标记结果图，其中a为绿色荧光筛选表型，白色箭头指示的部分为绿色荧光表达愈伤组织，b为筛选得到的阳性愈伤组织；
图3为除草剂筛选表型，其中a为绿色荧光筛选后接种于N-S-N培养基上的愈伤组织表型，b为绿色荧光筛选后接种于N-S-S1培养基上的愈伤组织表型，c为绿色荧光筛选后接种于N-S-S2培养基上的愈伤组织表型；
图4为T0代转基因植株的PCR检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种双筛选标记基因，所述双筛选标记基因为EGFP和Bar基因的融合基因，所述筛选标记基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明以EGFP和Bar基因的融合基因作为筛选标记基因。在本发明中，所述融合基因优选的通过人工合成方式获得，所述人工合成优选的为EGFP基因和Bar基因进行连接，所述EGFP基因优选的来源于载体pEGAD；所述Bar基因优选的去除起码密码子ATG。
在本发明中，所述EGFP基因和Bar基因进行连接的方式优选的为首尾串联，更优选的为在EGFP基因后面连接去除ATG的Bar基因。本发明将得到的所述融合基因以EGFP-Bar表示。
本发明优选的对所述EGFP-Bar进行酶切位点的修饰，得到修饰后的EGFP-Bar。在本发明中，所述酶切位点优选的为限制性内切酶BamH I和Hind III，本发明将修饰后的EGFP-Bar作为筛选标记基因，所述EGFP-Bar的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种获得含双筛选标记基因的玉米转基因方法，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚中，筛选得到双筛选标记转基因玉米；所述筛选包括依次进行的：绿色荧光正向筛选、除草剂抗性反向筛选和PCR筛选。
本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚中。本发明中，含所述筛选标记基因的转化用载体优选的为pHZM3载体，所述pHZM3载体优选的为去除pEGAD载体中草丁膦抗性基因Bar的完整表达框后，再将pEGAD载体中的绿色荧光蛋白GFP表达框替换为所述筛选标记基因的载体。具体的，所述pHZM3载体的构建方法包括以下步骤：
1)将所述筛选标记基因连接到pUC57载体上进行筛选标记基因的克隆，得到克隆后的筛选标记基因；
2)利用BamH I和Hind III双酶切所述克隆后的筛选标记基因，得双酶切后的筛选标记基因；
3)采用Sam I对pEGAD载体进行酶切，去除pEGAD载体上的草丁膦抗性基因Bar的完整表达框，得无Bar基因的pEGAD载体；
4)将步骤2)得到的所述双酶切后的筛选标记基因与步骤3)所述无Bar基因的pEGAD载体进行连接，得到转基因载体pHZM3。
本发明将所述筛选标记基因连接到pUC57载体上进行筛选标记基因的克隆，得到克隆后的筛选标记基因。在本发明中，所述连接优选采用全基因合成的方法，所述全基因合成的方法优选的包括全基因合成和Gateway法克隆；
得到克隆后的筛选标记基因后，本发明利用BamH I和Hind III双酶切所述克隆后的筛选标记基因，得双酶切后的筛选标记基因。在本发明中，所述双酶切的体系优选的为100μL体系，所述体系优选的包括：10×buffer，10μL；限制性内切酶BamHI，3μL；限制性内切酶HindIII，3μL；克隆后的筛选标记基因质粒DNA，5～10μg；ddH2O，补足100μL。在本发明中，所述双酶切的温度优选的为35～40℃，更优选的为36～38℃，最优选的为37℃。在本发明中，所述双酶切的时间优选的为5～16h，更优选的为10-15h，最优选的为12h。
本发明采用Sam I对pEGAD载体进行酶切，去除pEGAD载体上的草丁膦抗性基因Bar的完整表达框，得无Bar基因的pEGAD载体。在本发明中，所述酶切的体系优选的是50μL体系，所述体系优选的包括：10×buffer，5μL；限制性内切酶BamHI，3μL；质粒DNA，5～10μg；ddH2O，补足50μL。所述酶切的温度优选的为42℃，所述酶切的时间优选的为10～12h。
本发明将得到的所述双酶切后的筛选标记基因与所述无Bar基因的pEGAD载体进行连接，得到转基因载体pHZM3。在本发明中，所述连接优选的为通过连接酶连接，所述连接酶优选的为T4DNA连接酶。本发明对T4DNA连接酶的来源没有特殊限定，利用本领域技术人员可以常规获得的市售品种即可。在本发明中，所述连接的体系优选的为20μL，所述体系优选的包括：无Bar基因的pEGAD载体，50～100ng；双酶切后的筛选标记基因，无Bar基因的pEGAD载体质量的3倍；10×Ligation Buffer，2μL；T4DNA连接酶，0.2～0.5μL；ddH2O，补足20μL。本发明将所述融合基因EGFP-Bar连接在pEGAD载体上组成型启动子CaMV35S和终止子之间，替换原有的绿色荧光蛋白基因GFP表达框，构成完整的T-DNA区间，构建完成所述转基因载体pHZM3。
构建完成转基因载体pHZM3后，本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚中。本发明中所述玉米优选的为HiII、A188、C01、18-599R、齐319、H99中的一种，更优选的为HiII，本发明对所述玉米的来源没有特别的限定，优选的为常规市售品种。在本发明中对所述农杆菌介导的遗传转化方法没有特殊限定，优选的包括以下步骤：
(1)利用所述转基因载体pHZM3制备农杆菌工程菌；
(2)将所述农杆菌工程菌划线培养，得单菌落；
(3)将上述单菌落置于侵染液中，调整侵染液浓度到OD值为0.4～0.5后，振荡培养2～4h；
(4)去除鲜玉米穗的苞叶和花丝，75％酒精浸泡3～5min，切去果穗两端不整齐部分，收集籽粒；
(5)切除籽粒1/2～2/3的胚乳部分，得待侵染籽粒；
(6)剥取所述待侵染籽粒的幼胚，置于侵染液中，振荡后静置，得侵染的幼胚。
本发明利用所述转基因载体pHZM3制备农杆菌工程菌。在本发明中，所述制备农杆菌工程菌的方法优选的为电转化法。在本发明中，所述电转化时使用的感受态细胞优选的为农杆菌EHA105感受态细胞。本发明对所述电转化的方法没有特殊限定，利用本领域公知的方法即可。
得到农杆菌工程菌后，本发明将所述农杆菌工程菌划线培养，得单菌落。在本发明中，所述划线培养的培养基优选的为LB固体培养基，所述细菌培养基优选的包括LB培养基和YEB培养基。
得到单菌落后，本发明将上述单菌落刮到侵染液中，调整侵染液浓度到OD值为0.4～0.5后，振荡培养2～4h。在本发明中，所述侵染液优选的包括：N6盐、蔗糖、葡萄糖、脯氨酸、肌醇、MES、2,4-D和乙酰丁香酮；在本发明中，所述侵染液的pH优选的为4～6，更优选的为5～5.8，最优选的为5.2。在本发明中，所述N6盐的含量优选的为1～3g/L，更优选的为1.5～2.5g/L，最优选的为2g/L，所述N6盐提供组织培养过程中的氮源营养；所述蔗糖的含量优选的为60～75g/L，更优选的为65～70g/L，最优选的为68.5g/L，所述蔗糖具提供组织培养中的碳源营养；所述葡萄糖的含量优选的为30～40g/L，更优选的为35～37g/L，最优选的为36g/L，所述葡萄糖提供组织培养中的碳源营养；所述脯氨酸的含量优选的为0.2～1g/L，更优选的为0.5～0.8g/L，最优选的为0.7g/L；所述肌醇的含量优选的为0.04～0.15g/L，更优选的为0.08～0.12g/L，最优选的为0.1g/L，所述肌醇提供组织培养过程中的营养；所述MES的含量优选的为0.1～1g/L，更优选的为0.3～0.6g/L，最优选的为0.5g/L，所述MES在组织培养过程中起抗氧化的作用；所述2,4-D的含量优选的为1～3mg/L，更优选的为1.5～2.5mg/L，最优选的为2mg/L，所述2,4-D具有调节组织培养过程中的生长素比例，诱导脱分化的作用；所述乙酰丁香酮的含量优选的为60～150μM/L，更优选的为80～120μM/L，最优选的为100μM/L，所述乙酰丁香酮可起补充侵染转化过程中的诱导元素的作用。本发明中，所述调整优选的为使用侵染培养基稀释不同浓度的农杆菌菌液，在分光光度计下测量侵染培养基的吸光度。在本发明中，所述振荡培养的温度优选的为25～30℃，更优选的为26～29℃，最优选的为28℃。在本发明中，所述振荡培养的时间优选的为3h。
本发明去除收获鲜穗的苞叶和花丝，75％酒精浸泡3～5min，切去果穗两端不整齐部分，收集籽粒。在本发明中，所述鲜穗优选的为授粉后的玉米穗，更优选的为授粉后14d的玉米穗。在本发明中，所述玉米穗的胚长优选的为1.0～2.0mm，更优选的为1.4～1.8mm，最优选的为1.5mm。本发明所述玉米穗收获后，优选存放1～2d，所述存放的温度优选的为4℃。
本发明切除籽粒1/2～2/3的胚乳部分，得待侵染籽粒。在本发明中，所述切除优选的在无菌环境中进行，更优选的在超净工作台中进行。
得待侵染籽粒后，本发明剥取所述待侵染籽粒的幼胚，置于侵染液中，振荡后静置，得侵染的幼胚。在本发明中，所述剥取优选的在无菌环境中进行，更优选的在超净工作台中进行，所述剥取优选的利用手术镊剥取。本发明所述侵染前优选的包括清洗幼胚，所述清洗优选的采用侵染液清洗，所述侵染液优选的不含农杆菌。具体清洗时，所述不含农杆菌的侵染液与幼胚的比例优选为1mL：100-150个。本发明在清洗完成后，吸弃上述不含农杆菌的侵染液，加入含有农杆菌的侵染液，振荡后静置，得侵染的幼胚。在本发明中，所述震荡的时间优选的为0.5～2min，更优选的为0.8～1.2min，最优选的为1min。在本发明中，所述静置的时间优选的为3～8min，更优选的为4～6min，最优选的为5min。
得到侵染的幼胚后，本发明优选将所述侵染的幼胚培养为愈伤组织，所述培养优选的包括依次进行的共培养、恢复培养和诱导培养。在本发明中，所述共培养优选的为暗培养；所述共培养的温度优选的15～22℃，更优选的为18～20℃，最优选的为19℃；所述共培养的时间优选的为1～5d，更优选的为2～4d，最优选的为3d。本发明所述共培养的培养基优选的包括：N6盐、蔗糖、脯氨酸、肌醇、MES、硫酸铜、2,4-D、琼脂、半胱氨酸、二硫苏糖醇和乙酰丁香酮。在本发明中，所述共培养的培养基的pH优选的为5～7，更优选的为5.2～6，最优选的为5.8；本发明所述共培养的培养基中N6盐的含量优选的为1～3g/L，更优选的为1.5～2.5g/L，最优选的为2g/L；所述蔗糖的含量优选的为20～40g/L，更优选的为25～32g/L，最优选的为30g/L；所述脯氨酸的含量优选的为0.5～1g/L，更优选的为0.6～0.8g/L，最优选的为0.7g/L；所述肌醇的含量优选的为0.04～0.16g/L，更优选的为0.08～0.12g/L，最优选的为0.1g/L；所述MES的含量优选的为0.2～1.5g/L，更优选的为0.4～0.8g/L，最优选的为0.5g/L；所述硫酸铜的含量优选的为0.02～0.1μM/L，更优选的为0.03～0.07μM/L，最优选的为0.05μM/L；所述2,4-D的含量优选的为1～4mg/L，更优选的为1.5～2.5mg/L，最优选的为2mg/L；所述琼脂的含量优选的为5～12g/L，更优选的为6～10g/L，最优选的为8g/L；所述半胱氨酸的含量优选的为0.2～1g/L，更优选的为0.3～0.6g/L，最优选的为0.4g/L；所述二硫苏糖醇的含量优选的为0.1～0.2g/L，更优选的为0.12～0.18g/L，最优选的为0.15g/L；所述乙酰丁香酮的含量优选的为60～150μM/L，更优选的为80～120μM/L，最优选的为100μM/L。
本发明在共培养后进行所述恢复培养。在本发明中，所述恢复培养优选的为暗培养，所述恢复培养的温度优选的为20～35℃，更优选的为25～30℃，最优选的为28℃。在本发明中，所述恢复培养的时间优选的为7～10d，最优选的为10d。本发明所述恢复培养的培养基的pH优选的为5～7，更优选的为5.2～6，最优选的为5.8。本发明所述恢复培养的培养基优选的包括：N6盐、蔗糖、脯氨酸、肌醇、水解酪蛋白、MES、2,4-D、Gelrite、硝酸银和羧苄青霉素。在本发明中，所述N6盐的含量优选的为2～6g/L，更优选的为3～5g/L，最优选的为4g/L；所述蔗糖的含量优选的为20～40g/L，更优选的为25～32g/L，最优选的为30g/L；所述脯氨酸的含量优选的为0.5～1g/L，更优选的为0.6～0.8g/L，最优选的为0.7g/L；所述肌醇的含量优选的为0.04～0.16g/L，更优选的为0.08～0.12g/L，最优选的为0.1g/L；所述水解酪蛋白的含量优选的为0.2～1.5g/L，更优选的为0.4～0.8g/L，最优选的为0.5g/L；所述MES的含量优选的为0.2～1.5g/L，更优选的为0.4～0.8g/L，最优选的为0.5g/L；所述2,4-D的含量优选的为1～4mg/L，更优选的为1.5～2.5mg/L，最优选的为2mg/L；所述Gelrite的含量优选的为1～5g/L，更优选的为2～4g/L，最优选的为2.5g/L；所述硝酸银的含量优选的为0.5～1.2mg/L，更优选的为0.8～1mg/L，最优选的为0.85mg/L；所述羧苄青霉素的含量优选的为0.04～0.16g/L，更优选的为0.08～0.12g/L，最优选的为0.1g/L。
本发明在恢复培养后进行所述诱导培养，获得愈伤组织。在本发明中，所述诱导培养优选的为N6培养，所述诱导培养的温度28℃，所述诱导培养的时间20天。本发明所述诱导培养的培养基的pH优选的为5～7，更优选的为5.2～6，最优选的为5.8。本发明所述诱导培养的培养基优选的包括：N6盐、蔗糖、脯氨酸、肌醇、水解酪蛋白、2,4-D、Gelrte、硝酸银、羧苄青霉素和双丙氨膦。在本发明中，所述N6盐的含量优选的为2～6g/L，更优选的为3～5g/L，最优选的为4g/L；所述蔗糖的含量优选的为20～40g/L，更优选的为25～32g/L，最优选的为30g/L；所述脯氨酸的含量优选的为0.5～1g/L，更优选的为0.6～0.8g/L，最优选的为0.7g/L；所述肌醇的含量优选的为0.04～0.16g/L，更优选的为0.08～0.12g/L，最优选的为0.1g/L；所述水解酪蛋白的含量优选的为0.2～1.5g/L，更优选的为0.4～0.8g/L，最优选的为0.5g/L；所述2,4-D的含量优选的为1～4mg/L，更优选的为1.5～2.5mg/L，最优选的为2mg/L；所述Gelrite的含量优选的为1～5g/L，更优选的为2～4g/L，最优选的为2.5g/L；所述硝酸银的含量优选的为3～6mg/L，更优选的为4～5mg/L，最优选的为4.25mg/L；所述羧苄青霉素的含量优选的为0.04～0.16g/L，更优选的为0.08～0.12g/L，最优选的为0.1g/L；所述双丙氨膦的含量优选的为1～4mg/L，更优选的为1.5～2.5mg/L，最优选的为2mg/L。
得到愈伤组织后，本发明使用绿色荧光作为报告基因在蓝光灯上进行瞬时转化效率的检测和统计，具有绿色荧光的愈伤组织即为转基因阳性愈伤组织，分离所述转基因阳性愈伤组织，绿色荧光的愈伤组织重量占侵染愈伤组织总量的比例为转化率，得到了平均7.3％的瞬时转化率。
本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚后，筛选得到双筛选标记转基因玉米。本发明中所述筛选的方法，包括绿色荧光正向筛选、除草剂抗性反向筛选和PCR筛选。
得到转基因阳性愈伤组织后，本发明利用所述转基因阳性愈伤组织进行绿色荧光正向筛选，得到正向筛选的愈伤组织。所述正向筛选优的为将所述转基因阳性愈伤组织接种于筛选培养基N-S-N上，暗培养21天后进行一轮筛选，优选的进行三轮筛选。本发明所述筛选培养基的配方优选的如表1所示：
表1.绿色荧光正向筛选和除草剂抗性反向筛选用筛选培养基配方
本发明中所述除草剂抗性反向筛选的过程优选的包括将所述正向筛选的愈伤组织接种到N-S-S1培养基上筛选3轮后，最后再接种于N-S-S2培养基上筛选3轮，三轮筛选后存活下来的即为经过反向筛选的愈伤组织。
得到反向筛选的愈伤组织后，本发明优选的通过组织培养的方法将所述反向筛选的愈伤组织培养为T0代转基因植株，所述组织培养优选的包括预分化培养、分化培养、生根培养和继代培养。在本发明中，所述组织培养各阶段所使用的培养基，以重量份计，成分如表2所示：
表2.培养基组成
本发明对所述组织培养的条件没有特殊限定。
得到T0代转基因植株后，本发明对所述T0代转基因植株进行PCR检测，所述PCR检测的方法优选的包括：提取T0代转基因植株的基因组DNA，设计引物，PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明对所述T0代转基因植株的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，优选的采用CTAB法提取。在本发明中，所述引物优选的使用Bar基因设计引物，所述Bar基因的目标片段908bp，所述引物序列如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。在本发明中，所述PCR的PCR反应体系优选的为20μL体系，所述体系优选的包含：30ng DNA，2.0μL 10×buffer,1.0μL 2mMdNTPs,1.5μL l25mM MgCl2,0.4μL 10μM引物和1.5U Taq酶；所述PCRDE反应程序优选的为94℃变性5min；94℃变性40s；55℃退火45s；72℃延伸50s；共35个循环；72℃延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图4所示，当PCR扩增条带上得到与Bar目标基因大小相同的912bp条带时，证明转基因成功。
下面结合实施例对本发明提供的获得双筛选标记转基因玉米的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
转基因载体pHZM3构建，其步骤如下：
根据pEGAD载体上的参考序列，将参考序列中Bar基因起始密码子ATG去掉，连接在EGFP基因后面，形成首尾串联融合的基因，并在融合基因两端分别添加限制性内切酶BamHI和HindIII的酶切位点。利用全基因合成的办法将融合基因EGFP-Bar合成在中间载体pUC57上。
使用质粒pEGAD作为载体骨架，使用限制性内切酶samI切下载体上的筛选标记基因草丁膦抗性基因bar的完整表达框。
使用限制性内切酶BamHI和HindIII从中间载体pUC57切下目的基因片段后，使用重组试剂盒替换去掉Bar基因表达框的pEGAD上的绿色荧光蛋白基因EGFP。构成一个由组成型启动子CaMV35S与对用终止子控制的筛选标记区域，获得新型转基因载体pHZM3，结构示意图如图1所示。
实施例2
农杆菌介导的玉米转基因，其步骤如下：
将单菌落划线生长出的农杆菌刮到侵染液中，调整侵染液浓度到OD值为0.4～0.5；
将调整好的菌液放在28℃振荡培养2-4h；
鲜穗收获(胚长约1.0～2.0mm)后于4℃存放1～2天；
去尽苞叶和花丝，75％酒精浸泡3～5min，用刀切去果穗两端不整齐部分；
在超净工作台中，用手术刀切去籽粒胚乳上半部分；
使用手术镊将幼胚挑出后置于装有1ml侵染液的2ml EP管中；
将装有幼胚的2ml EP管中的侵染液吸出，加入含有农杆菌的侵染液；
振荡1min，室温静置5min；
将侵染完的幼胚倒入底部垫有滤纸的平皿中，适度吹干；
将幼胚盾片向上转入共培养培养基，19℃暗培养3d；
将侵染后的幼胚转入恢复培养基，28℃暗培养7～10d；
恢复培养后将幼胚转移到含有羧苄青霉素的诱导培养基中，使用绿色荧光作为报告基因在蓝光灯上进行瞬时转化效率的检测和统计，得到了平均7.3％的瞬时转化率。
实施例3
双筛选标记基因的复筛：
将转化愈伤组织转入N-S-N培养基，28℃暗培养，21天筛选一次。转化后愈伤组织在蓝光灯上或倒置荧光显微镜460-495激发光下进行观察，具有绿色荧光的愈伤组织即为转基因阳性愈伤组织(如图2所示)。三轮筛选获得的筛选频率分别为19.807±4.251％，78.712±1.980％和98.727±0.011％；
分别将转化愈伤组织转入N-S-S1和N-S-S2培养基，28℃暗培养，21天筛选一次。根据愈伤组织表型，去除褐化死亡的愈伤组织，剩余愈伤组织占全部每皿愈伤组织总量的比例为转化率(如图3所示)。使用低浓度的除草剂(1mg/L)三轮筛选获得的筛选频率分别为89.879±1.091％，93.211±1.713％和100.000±0.192％。使用高浓度的除草剂(3mg/L)三轮筛选分别获得36.572±3.006％，58.173±1.011％和79.609±0.706％的阳性率。
实施例4
双筛选标记基因的PCR检测
PCR反应引物：使用Bar基因序列设计PCR引物Bar-F：5′-TGCCAGAAACCCACGTCAT-3和Bar-R：5′-AAGGGCATCGACTTCAAGGA-3′，目标片段908bp；
PCR反应体系：配制20μl PCR体系，包含30ng模板DNA，2.0μL 10×buffer,1.0μL2mM dNTPs,1.5μL l25mM MgCl2,0.4μL 10μM引物和1.5U Taq酶；
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s；55℃退火45s；72℃延伸50s；共35个循环；72℃延伸5min；
PCR产物使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。
实验例
分别按照与实施例3～4相同的方法进行试验，分别验证不同筛选方法的PCR阳性率，结果如表3所示：
表3不同方法的筛选效率
由以上实施例可知，本发明的在玉米遗传转化和筛选过程中，经过绿色荧光表型筛选可以获得较高的筛选效率，而通过绿色荧光与除草剂梯度混合筛选，选用1mg/L除草剂、3mg/L除草剂和绿色荧光筛选的筛选方法，经过1个周期的筛选就可以得到94.23％的阳性率，并可以获得充足的转基因单株，并且可以极大地缩减筛选周期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggagctgcgg ccgctgccgc tgcggcagcg gccgaattcc ccgggctcga gaagcttgga 780
tccaccggat ctagaagccc agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg 840
gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc 900
cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc 960
tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc 1020
tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc 1080
caccagcgga cgggactggg ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca 1140
cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg 1200
cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt caagcacggg 1260
aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg 1320
gtcctgcccg tcaccgagat ctga 1344
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgccagaaac ccacgtcat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagggcatcg acttcaagga 20

Claims (6)

1.一种双筛选标记基因，所述双筛选标记基因为EGFP和Bar基因的融合基因，所述筛选标记基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种获得含权利要求1所述双筛选标记基因的玉米转基因方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述筛选标记基因转化入玉米幼胚中，筛选得到双筛选标记转基因玉米；所述筛选包括依次进行的：绿色荧光正向筛选、除草剂抗性反向筛选和PCR筛选。
3.根据权利要求2所述的玉米转基因方法，其特征在于，所述农杆菌介导的遗传转化方法使用的转化载体为pHZM3载体，所述pHZM3载体为：去除pEGAD载体中草丁膦抗性基因Bar的完整表达框后，再将pEGAD载体中的绿色荧光蛋白GFP表达框替换为所述筛选标记基因的载体。
4.根据权利要求3所述的玉米转基因方法，其特征在于，所述pHZM3载体的构建方法包括以下步骤：
1)将所述筛选标记基因连接到pUC57载体上进行筛选标记基因的克隆，得到克隆后的筛选标记基因；
2)利用BamH I和Hind III双酶切步骤1)所述克隆后的筛选标记基因，得双酶切后的筛选标记基因；
3)采用Sam I对pEGAD载体进行酶切，去除pEGAD载体上的草丁膦抗性基因Bar的完整表达框，得无Bar基因的pEGAD载体；
4)将步骤2)得到的所述双酶切后的筛选标记基因与步骤3)所述无Bar基因的pEGAD载体进行连接，得到转基因载体pHZM3；
步骤1)、2)分别与步骤3)没有时间先后顺序的限定。
5.根据权利要求2所述的玉米转基因方法，其特征在于，所述绿色荧光正向筛选和除草剂抗性反向筛选的筛选次数独立地为2～3次。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR筛选时所使用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示。
CN201810164532.7A 2018-02-27 2018-02-27 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法 Pending CN108359675A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810164532.7A CN108359675A (zh) 2018-02-27 2018-02-27 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810164532.7A CN108359675A (zh) 2018-02-27 2018-02-27 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108359675A true CN108359675A (zh) 2018-08-03

Family

ID=63003044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810164532.7A Pending CN108359675A (zh) 2018-02-27 2018-02-27 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108359675A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101011031A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 华中农业大学 玉米成熟胚途径的愈伤组织诱导及植株再生方法
CN103667340A (zh) * 2013-12-05 2014-03-26 华中农业大学 一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法
CN104830897A (zh) * 2015-05-04 2015-08-12 安徽师范大学 一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用
CN104911205A (zh) * 2015-05-28 2015-09-16 甘肃农业大学 一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体cpb-lar-gfp
CN104911206A (zh) * 2015-05-28 2015-09-16 甘肃农业大学 一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体cpb-ban-gfp
CN105886521A (zh) * 2016-04-19 2016-08-24 北京市农林科学院 抗草甘膦筛选标记基因及其在玉米转基因技术中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101011031A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 华中农业大学 玉米成熟胚途径的愈伤组织诱导及植株再生方法
CN103667340A (zh) * 2013-12-05 2014-03-26 华中农业大学 一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法
CN104830897A (zh) * 2015-05-04 2015-08-12 安徽师范大学 一种玉米新型高效无选择标记转基因载体系统构建方法及应用
CN104911205A (zh) * 2015-05-28 2015-09-16 甘肃农业大学 一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体cpb-lar-gfp
CN104911206A (zh) * 2015-05-28 2015-09-16 甘肃农业大学 一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体cpb-ban-gfp
CN105886521A (zh) * 2016-04-19 2016-08-24 北京市农林科学院 抗草甘膦筛选标记基因及其在玉米转基因技术中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUTLER,S.R. ET AL: "ACCESSION NO. AF218816，Cloning vector pEGAD，complete sequence", 《GENBANK》 *
杜邓襄: "玉米高效转基因体系建立与基于人工Ac/Ds转座子的激活标签突变体生成系的创建", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
王娜 等: "IPP异构酶基因遗传转化对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）虾青素含量的影响", 《海洋与湖沼》 *
高婧: "含抗除草剂标记的水稻叶绿体转化载体的构建及分子鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7994399B2 (en) Methods for the production of stably transformed, fertile Zea mays plants
JP6348952B2 (ja) 改良された植物形質転換効率についてのベクターおよび方法
JP2005500827A5 (zh)
CA2278618A1 (en) Methods for agrobacterium-mediated transformation
CN109112146B (zh) 控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用
WO2018205796A1 (zh) 提高大豆转化效率的方法
AU2019297209A1 (en) Method of obtaining multi-leaf alfalfa material by means of MsPALM1 artificial site-directed mutant
CA3211382A1 (en) Method for site-directed mutagenesis of bnhbbd gene of brassica napus l., and use
Nanasato et al. A method of transformation and current progress in transgenic research on cucumbers and Cucurbita species
Chen et al. The combination of morphogenic regulators BABY BOOM and GRF-GIF improves maize transformation efficiency
CN107338265B (zh) 一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法
CN108588120A (zh) 一种玉米农杆菌转化受体的制备方法及农杆菌介导的玉米转化方法
JP2000300098A (ja) Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物
CN116769792B (zh) 一种毛竹茎秆伸长相关基因PheLBD12及其应用
JPWO2019103034A1 (ja) ゲノム編集植物の生産方法
CN107058317B (zh) 一种花粉特异性启动子及其应用
CN106148346B (zh) 一种分离出的胚乳不表达启动子safes6及其应用
US20190017067A1 (en) Glyphosate tolerant plants having modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene regulation
CN115896160B (zh) 一种利用发根农杆菌高效快速获得苹果稳定转基因植株的方法
CN108165578B (zh) 一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法
CN108359675A (zh) 一种获得双筛选标记转基因玉米的方法
CN110204600A (zh) BnSPL14基因、蛋白及其在控制甘蓝型油菜株型中的应用
CN110257406B (zh) 密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因及其应用
CN118406698B (zh) ZmWIND1基因在提高玉米遗传转化效率中的应用
Krens et al. Oriental lily hybrids engineered to resist aphid attack

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180803

RJ01 Rejection of invention patent application after publication